Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 4/2016 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
-Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương (TTCĐ)
- Khu nuôi động vật ATSH của TTCĐ
- Phòng thí nghiệm ATSH củaTTCĐ.
Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu
- Gà và vịt 1 ngày tuổi
Vacxin CGC là loại vacxin vô hoạt tái tổ hợp Cúm H5 nhị giá, bao gồm hai chủng Re-6 và Re-8, được nhập khẩu từ Trung Quốc Vacxin này được phát triển từ virus H5N1 clade 2.3.2.1 (chủng Re-6) và virus H5N6 clade 2.3.4.4 (chủng Re-8).
- Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập từ mẫu gà ở Lạng Sơn ngày 08/01/2016 (A/Ck/Vietnam/LangSon/16A10/2016(H5N6)
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: A/ck/VN1203/2004 (clade 1), A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1) và A/ck/VN/LangSon(TrangDinh)- NCVD140450(14A324)/2014 (H5N6 clade 2.3.4.4).
3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường
- Môi trưởng bảo quản swabs
- Bộ kit chiết tách ARN, kit nhân gen qRT-PCR
- Prime, Probe, đối chứng dương H5N6.
Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm
Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, và tủ lạnh âm sâu -80°C là những thiết bị thiết yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử Ngoài ra, tủ lạnh âm -20°C và hệ thống bơm hút chân không cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết tách RNA Đặc biệt, máy Real time PCR (RT-PCR) giúp phát hiện và phân tích gen một cách chính xác và nhanh chóng.
- Phòng thí nghiệm ATSH cấp 2 để phân lập virus
- Phòng nuôi động vật ATSH cấp 2+ để công cường độc.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm tại Việt Nam
- Nghiên cứu sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 + Re-8 khi tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cường độc
+ Nghiên cứu các triệu chứng lâm sàng của gia cầm sau công cường độc
+ Xét nghiệm virus bài thải
+ So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của lô gà và vịt
+ Bệnh tích đại thể của đàn gà, vịt sau khi công cường độc 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu
Gà và vịt được lựa chọn từ đàn sạch bệnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng cúm H5 Trước khi tiêm vacxin, khoảng 30% tổng đàn sẽ được lấy máu để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1.
Trong nghiên cứu tiêm vaccine cho gà, tổng số 50 con gà được chia thành hai nhóm: lô Vacxin gồm 30 con và lô Đối chứng gồm 20 con Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, 30 con gà thuộc lô Vacxin sẽ được tiêm một mũi vaccine khi chúng đạt 3 tuần tuổi, trong khi gà ở lô Đối chứng sẽ không được tiêm.
Bố trí tiêm vacxin cho 50 vịt được chia thành hai lô: lô Vacxin gồm 30 con và lô Đối chứng gồm 20 con Lô Vacxin sẽ được tiêm một mũi vacxin lúc 3 tuần tuổi và nhắc lại lúc 6 tuần tuổi theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong khi lô Đối chứng không được tiêm vacxin.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin
Tiêm vacxin Vịt Đối chứng
- Ba tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, lấy máu gà, vịt để xác định hiệu giá kháng thể kháng H 5 của virus CGC bằng phương pháp
HI với kháng nguyên H5N1 đồng chủng vacxin (hoặc gần với chủng virus vacxin nhất) và kháng nguyên virus dùng để công cường độc
Công cường độc nên được thực hiện khi gà đạt 6 tuần tuổi và vịt đạt 9 tuần tuổi, tức là 3 tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin Việc chọn lựa gà và vịt để công cường độc cần dựa trên tỷ lệ phân bố hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên đồng chủng vacxin Mỗi loài nên bao gồm 10 con từ lô Vacxin và 5 con từ lô Đối chứng, trong khi số còn lại được dự phòng.
Trong vòng 10 ngày sau khi công bố cường độc, cần theo dõi và chấm điểm lâm sàng hàng ngày theo quy trình của OIE Việc đánh giá sẽ được thực hiện theo các mức độ, trong đó có điểm Không và điểm 1.
- Mổ khám gia cầm chết, đánh giá bệnh tích đại thể Mổ khám gia cầm sống sót để so sánh bệnh tích với những con chết
Lấy mẫu swab hầu họng vào ngày thứ 3, thứ 10 và ngày gia cầm chết sau khi tiêm công cường độc để xét nghiệm virus bài thải bằng phương pháp Real-time RT-PCR.
- Lấy mẫu huyết thanh gia cầm sống sót vào ngày thứ 10 để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với virus cường độc
3.4.2.2 Phương pháp điều tra hồi cứu
Bài viết tổng hợp thông tin từ Cục Thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm (CGC), kết quả tiêm phòng vacxin và kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng qua các năm Từ những dữ liệu này, chúng ta có thể đánh giá hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa.
3.4.2.3 Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm yêu cầu tất cả các thao tác xử lý mẫu, chiết tách ARN và phân lập virus phải được thực hiện trong buồng an toàn sinh học cấp 2 hoặc cao hơn Việc lấy mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên quan trọng trong quy trình này.
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên cần lấy từ 3 đến 5 gam bệnh phẩm của gia cầm bị bệnh, bao gồm não, phổi, khí quản, lách, hoặc ruột Nếu gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để lấy dịch ổ nhớp, họng hoặc phân tươi, sau đó cho vào dung dịch PBS với pH 7,2 đến 7,4, có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỷ lệ 1:10.
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS):
+ Natri clorua (NaCl) + Natri hydro photphat dihydrat (Na 2 HPO 4 2H 2 O) + Kali dihydro photphat (KH 2 PO 4 )
+ Kali clorua (KCl) + Nước cất
Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng ở 121 o C trong 30 giây
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ tiến hành lấy máu từ gia cầm chưa tiêm vacxin cúm gia cầm bằng cách sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu Rút cán xy lanh lên mức cao nhất để tạo khoảng trống bên trong, sau đó đặt xy lanh nghiêng 5 độ ở nhiệt độ 20 đến 30 độ C trong 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Cuối cùng, chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để sử dụng cho xét nghiệm.
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h b Phát hiện kháng nguyên
- Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
+ Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8 000 r/min trong 15 s
Chia dịch bệnh phẩm vào hai ống 1,5 ml; một ống dành cho xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào và trứng, ống còn lại để lưu mẫu bảo quản ở nhiệt độ -80 o C.
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
+ Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15 s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 g/min trong 15 giây
Sử dụng pipet để chuyển dịch trong ống sang hai ống 1,5 ml Một ống sẽ được dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc trên trứng, trong khi ống còn lại sẽ được bảo quản mẫu ở nhiệt độ -80 o C.
*) Phương pháp Realtime PCR (phụ lục 4)
Tất cả các quy trình tiêm truyền trứng và thu hoạch dịch niệu mô sau khi phân lập cần phải được thực hiện trong môi trường an toàn sinh học cấp 3 để đảm bảo an toàn và hiệu quả.
+ Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền lên 3 trứng
+ Chọn trứng gà có phôi 9 ngày đến 10 ngày tuổi khoẻ mạnh không có kháng thể cúm
+ Lau trứng bằng cồn 70 % và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
+ Dùng xi lanh 1 ml với kim 23G và hút dịch bệnh phẩm tiêm phía trên buồng hơi thẳng xuống xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng
+ Bịt lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán
+ Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 o C và theo dõi trong vòng 72 h
+ Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, giữ trứng trong tủ lạnh (4 o C) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định virus.
+ Đối với trứng không chết sau 72 h, cất vào tủ lạnh (4 o C) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định virus.
- Thu hoạch dịch niệu mô
+ Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên
+ Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định virus
Trước khi thực hiện giám định, cần áp dụng phương pháp HA để phát hiện sự hiện diện của virus cúm gia cầm (Newcastle, vi rút gây hội chứng giảm đẻ) trong dịch niệu mô thông qua đặc tính gây ngưng kết hồng cầu Nếu kết quả HA dương tính, điều này xác nhận rằng dịch niệu mô có chứa virus.
+ Giám định virus trong dịch niệu mô bằng phương pháp HI sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5 hoặc bằng phương pháp Realtime RT-PCR.
+ Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT- PCR hoặc RT-PCR) dương tính, dịch niệu mô có virus cúm gia cầm H5N1
+ Kết quả giám định âm tính, dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm.
Trong trường hợp giám định âm tính, cần sử dụng dịch niệu mô thu hoạch ở lần thứ nhất để tiêm truyền trứng lần hai Sau đó, theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần đầu để thực hiện giám định Nếu kết quả giám định lần hai vẫn âm tính, mẫu sẽ được kết luận là âm tính với virus cúm gia cầm H5N1.
