Nghiên cứu sử dụng nano bạc và các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro giống mía ROC22 (saccharum offcinarum l )

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ sinh học Thanh Hóa, thuộc Sở Khoa học và Công nghệ Thanh Hóa, địa chỉ 567 Quang Trung 3, Đông Vệ, thành phố Thanh Hóa.

Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017.

Đối tượng nghiên cứu

- Giống mía ROC22 (Sacharum officinarum L.)

- Chế phẩm nano được cung cấp bởi Bộ môn Sinh học - khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Chất điều tiết sinh trưởng: 2,4-D, BA, kinetine, α-NAA.

Nội dung nghiên cứu

 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng khử trùng của nano bạc trên mẫu mía từ ngọn mang chồi bên và lá non

 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng hình thành callus và tái sinh chồi từ callus của mẫu cấy lá non

 Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng tái sinh và nhân chồi cấp 1 từ chồi bên

 Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2

 Nội dung 5: Nghiên cứu khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh từ chồi cấp 2.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Thiết kế thí nghiệm: Đây là thí nghiệm một nhân tố, được thiết kế kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) Thí nghiệm được bố trí gồm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 20 mẫu/CT đối với tất cả các thí nghiệm

Sử dụng môi trường MS cải tiến (MS*) tức MS (Murashige và Skoog,

Năm 1962, môi trường nuôi cấy được bổ sung thiamin 1 mg/l, nước dừa 150 ml/l, và đường, cùng với các chất điều tiết sinh trưởng Trước khi sử dụng, môi trường này được hấp khử trùng ở 121 oC, 1,1 atm trong 20 phút với pH = 5,8 Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25 ± 2°C, với cường độ ánh sáng 2500 lux trong 14-16 giờ mỗi ngày, ngoại trừ các thí nghiệm tạo mô sẹo được thực hiện trong điều kiện tối hoàn toàn.

3.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu thí nghiệm)x 100%

- Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống sạch/ Tổng số mẫu thí nghiệm) x 100%

- Tỷ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch / Tổng số mẫu thí nghiệm )x 100%

- Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = x 100%

- Hệ số nhân chồi (lần) - Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100%

- Số lá (lá) = Tổng số lá/tổng số chồi theo dõi

- Số chồi (chồi) = Tổng số chồi/tổng số mẫu theo dõi

- Chiều cao chồi = Tổng chiều cao/tổng số chồi theo dõi

- Số rễ (rễ) = Tổng số rễ/tổng số chồi theo dõi

- Chiều dài rễ (cm) = Tổng chiều dài/tổng số rễ

- Đường kính callus (cm) = Tổng đường kính/tổng số callus

- Đặc điểm callus, đặc điểm chồi, đặc điểm rễ

- Số cây/ khóm, số lá/cây

Chọn những khóm mía to, khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, và lấy ngọn hoặc chặt những cây non có từ 2-4 lóng Cây mía non có sức nảy mầm và khả năng tái sinh cao, đồng thời ít phát sinh hoạt chất thứ cấp, giúp bảo vệ môi trường hơn so với ngọn già.

Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng khử trùng của nano bạc trên mẫu ngọn mang chồi bên và lá non mía ROC22

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý nano bạc đến hiệu quả khử trùng mẫu từ ngọn mang chồi bên và lá non của giống mía ROC22 Kết quả cho thấy sự thay đổi nồng độ và thời gian xử lý có tác động đáng kể đến khả năng khử trùng, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng nano bạc trong nông nghiệp.

Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá và bẹ, chỉ để lại khoảng 3-4 cm xung quanh chồi bên, sau đó được lau sạch bằng cồn etanol 70 độ Tiếp theo, ngọn mía được đưa vào box cấy vô trùng, loại bỏ các lớp bẹ và lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn lại phần ngọn với lá non trắng sát chồi đỉnh Phần chồi bên, chồi đỉnh hoặc lá non trắng sát đỉnh sinh trưởng sẽ được tách ra làm vật liệu nuôi cấy Cuối cùng, đổ ngập nano bạc và lắc đều theo bố trí thí nghiệm, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng.

3 lần Sau đó, cấy vào môi trường nền thích hợp

Thí nghiệm 1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả khử trùng chồi và lá non mía roc 22

CT0: Dung dịch nano bạc 0 ppm

CT1 : Dung dịch nano bạc 50 ppm

Mẫu đã được khử trùng bằng dung dịch nano bạc trong 60 phút, sau đó được cấy vào môi trường nền MS* với thành phần bổ sung gồm 150 ml/l nước dừa, 6,3 g/l agar và 30 g/l đường saccharose.

Thí nghiệm 1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí nano bạc đến hiệu quả khử trùng mẫu chồi và lá non mía ROC22

- Dựa vào kết quả thí nghiệm 1.1 chọn ra nồng độ nano bạc cho hiệu quả khử trùng tốt nhất, sau đó tiến hành thí nghiệm 1.2

CT0: Không xử lí nano bạc

CT1: Xử lí mẫu trong dung dịch nano bạc với thời gian 45 phút

- Sau khi mẫu được khử trùng xong tiếp tục cấy vào môi trường nền MS* bổ sung 150 ml/l nước dừa + 6,3 g/l agar + 30 g/l đường saccharose

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo của mẫu lá non mía ROC22

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và nano bạc đến khả năng hình thành mô sẹo (callus) từ mẫu cấy lá non mía ROC22

Sau khi khử trùng mẫu, tiến hành cắt lá non thành từng miếng kích thước 1 cm x 1 cm Các miếng lá được cấy vào môi trường nền MS* kết hợp với 150 ml nước dừa, 6,3 g/l agar, 30 g/l đường saccharose và các chất bổ sung theo yêu cầu thí nghiệm.

Thí nghiệm 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng hình thành mô sẹo từ mẫu cấy lá non mía ROC22

CT0: Môi trường nền bổ sung 0 mg/l 2,4–D,

CT1: Môi trường nền bổ sung 2 mg/l 2,4–D

CT2: Môi trường nền bổ sung 2,5 mg/l 2,4–D

CT3: Môi trường nền bổ sung 3 mg/l 2,4–D

CT4: Môi trường nền bổ sung 3,5 mg/l 2,4–D

Thí nghiệm 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp nano bạc đến khả năng hình thành mô sẹo từ mẫu lá non mía ROC22

Sau khi xác định nồng độ 2,4-D tối ưu cho khả năng hình thành mô sẹo trong thí nghiệm 2.1 với môi trường nền M1, thí nghiệm 2.2 được tiến hành Trong thí nghiệm này, môi trường nền M1 được bổ sung 2,4-D cùng với 0 ppm nano bạc.

CT1: Môi trường nền M1 bổ sung 2,4-D + 2 ppm nano bạc

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

Thí nghiệm 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

- Cấy mô sẹo vào môi trường nền MS* + 150 ml nước dừa + 6,3 g/l agar +

30 g/l đường saccharose bổ sung chất điều tiết sinh trưởng theo thí nghiệm gồm 5 công thức sau:

CT0: Môi trường nền bổ sung 0,2 mg/l kinetine + 0 mg/l BA

CT1: Môi trường nền bổ sung 0,2 mg/l kinetine + 0,5 mg/l BA

CT2: Môi trường nền bổ sung 0,2 mg/l kinetine + 1 mg/l BA,

Thí nghiệm 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

Từ thí nghiệm 3.1, chúng tôi đã xác định được công thức tối ưu cho khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trong môi trường nền M2 Tiếp theo, nano bạc đã được bổ sung để tiến hành thí nghiệm 3.2.

CT0: M2 Bổ sung 0 ppm nano bạc

CT3:M2 Bổ sung 6 ppm nano bạc

Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi cấp 1, nhân chồi cấp 1 từ chồi bên

Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, nano bạc đến khả năng tái sinh chồi cấp 1 từ chồi bên

Sau khi khử trùng, mẫu được cắt bỏ phần hỏng và cấy vào môi trường nền MS* với 150 ml nước dừa, 6,3 g/l agar và 30 g/l đường saccharose Ngoài ra, nano bạc và các chất điều sinh trưởng cũng được bổ sung theo các thí nghiệm nghiên cứu khác nhau.

Thí nghiệm 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi cấp 1 từ chồi bên

CT0: Môi trường nền bổ sung 0 mg/l BA

CT1: Môi trường nền bổ sung 0,5 mg/l BA

CT3: Môi trường nền bổ sung 1,5 mg/l BA

Thí nghiệm 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp nano đến khả năng tái sinh chồi cấp 1 từ chồi bên

Từ thí nghiệm 4.1, chúng tôi đã xác định được công thức tối ưu cho khả năng tái sinh chồi cấp 1 từ chồi bên trong môi trường nền M3 Tiếp theo, chúng tôi đã bổ sung nano bạc và tiến hành thí nghiệm 4.2 để đánh giá hiệu quả của sự bổ sung này.

Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, kinetine kết hợp nano bạc đến khả năng nhân chồi từ chồi cấp 1

Chồi cấp 1 được xử lý bằng cách tách bỏ bẹ lá và lá, sau đó cắt dọc làm đôi và cấy vào môi trường nền gồm MS*, 150 ml nước dừa, 6,3 g/l agar, 30 g/l đường saccharose, cùng với các chất điều tiết sinh trưởng và nano bạc theo các bố trí thí nghiệm khác nhau.

Thí nghiệm 5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp kinetine đến khả năng nhân chồi từ chồi cấp 1

Thí nghiệm 5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, kinetine kết hợp nano bạc đến khả năng nhân chồi từ chồi cấp 1

Từ thí nghiệm 5.1, chúng tôi xác định được công thức tối ưu cho khả năng nhân chồi từ chồi cấp 1 trong môi trường nền M4 Tiếp theo, chúng tôi đã bổ sung nano bạc và tiến hành thí nghiệm 5.2 để đánh giá hiệu quả.

Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine kết hợp nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2

Chồi cấp 2 được cắt bớt thân và lá, chỉ còn lại khoảng 1 cm, sau đó được cấy vào bình môi trường với mỗi bình chứa 5 cụm, mỗi cụm có 4 chồi Môi trường nền sử dụng là MS* kết hợp với 150 ml nước dừa, 6,3 g/l agar và 30 g/l đường saccharose, đồng thời bổ sung chất điều tiết sinh trưởng và nano bạc theo thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm 6.1 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2.

Thí nghiệm 6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, kinetine kết hợp với nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2

Từ thí nghiệm 6.1, chúng tôi đã xác định công thức tối ưu cho khả năng nhân chồi từ chồi cấp 2 trong môi trường nền M5 Tiếp theo, nano bạc đã được bổ sung và thí nghiệm 6.2 được thực hiện để đánh giá hiệu quả.

Tiêu đề	Nghiên cứu sử dụng nano bạc và các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro giống mía ROC22 (Saccharum offcinarum L.)
Tác giả	Ngô Thị Ánh
Người hướng dẫn	TS. Đồng Huy Giới
Trường học	Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	luận văn
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	1,98 MB