TỔNG QUAN
Giới thiệu về rong mơ Sargassum mcclurei
1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái
Hình 1.1 Rong mơ Sargassum mcclurei
Rong mơ S.mcclurei thuộc ngành rong nâu (Phacophyta) Rong nâu có trên
Có khoảng 190 chi và hơn 900 loài rong, chủ yếu sống ở môi trường biển, trong khi số lượng loài tìm thấy trong nước ngọt khá hạn chế Rong có cấu trúc đa dạng với nhiều tế bào hình màng giả, phiến, hoặc sợi đơn giản Chúng có thể phát triển thành dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp, hình thành cây với gốc, rễ, thân và lá Rong thường sinh trưởng ở các đỉnh, giữa và gốc của các lóng.
Rong mơ S.mcclurei có chiều dài từ 1-2 m, thậm chí lên tới 4 m khi sống ở độ sâu Đĩa bám rộng khoảng 1 cm, thường mọc liên kết với nhau thành 2-3 đĩa bám Đĩa bám có xẻ thùy nông, trong khi trục chính hình trụ có chiều dài dưới 1 cm Các nhánh chính thường có từ 3-5 nhánh, hình trụ và không có gai lớn, với chiều dài từ 3-7 cm và có thể dài tới 20 cm Lá của rong mơ dày và chắc, có hình bầu dục kéo dài từ 1-3 cm, mép lá có răng cưa nhọn và đôi khi có mâm nhỏ khi sống ở nơi sóng mạnh Gân giữa không rõ ràng, ổ lông phân bố rải rác, và cuống lá ngắn Phao có hình xoan hoặc hơi kéo dài, kích thước từ 2-5 mm, thường nằm trong một lá nhỏ có hình dạng rất biến thiên, với phao non ở gốc có cánh bao quanh giống như lá.
Rong là cây có cấu trúc khác biệt giữa gốc và các loại cây đực, cái Đế cái có hình ba cạnh với gai mọc thành chùm từ 2-3 cái, dài khoảng 1 cm, trong khi noãn cầu có đường kính 200 Đế đực có hình trụ, không có gai, dài từ 1-1,5 cm Trên các nhánh thụ phao, số lượng rất nhiều và thường trà trộn với các chùm đế.
1.1.2 Phân bố và đặc điểm sinh thái
Rong mơ S mcclurei là loài rong biển phổ biến dọc bờ biển từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu, tạo thành các bãi rong quan trọng với mật độ và sinh lượng cao, có thể đạt hơn 12 kg rong tươi/m² Loài này có khả năng thích nghi tốt với nhiều dạng vật bám và điều kiện môi trường khác nhau.
Chúng có thể phát triển ở vùng triều thấp hoặc sâu tới 4-5 m tùy thuộc vào điều kiện môi trường và vật bám, nhưng thường bị giới hạn bởi dải san hô và hoa đá mềm ở độ sâu 2-4 m Chúng có thể sống trên vách đá dốc hoặc bãi san hô chết bằng phẳng Ở những khu vực có sóng mạnh, lá của chúng dày và cứng, có mép với hai hàng răng cưa, trong khi ở nơi sóng yếu, lá mỏng và không có bìa đôi Hai dạng này thường gặp ở ven biển, ngay cả ở những khu vực gần nhau nhưng có điều kiện sống khác biệt.
Mùa sinh trưởng của rong mơ S mcclurei, giống như nhiều loài Sargassum khác, diễn ra từ tháng 11 đến tháng 6, với sự phát triển mạnh mẽ nhất từ tháng 2 đến tháng 3 Kích thước tối đa của chúng đạt được vào tháng 3 và tháng 4, khi các cơ quan sinh sản hình thành Sau đó, rong mơ sẽ bị sóng cuốn vào bờ và bắt đầu tàn lụi, tuy nhiên, ở một số nơi, mùa vụ có thể kéo dài đến tháng 7 và tháng 8.
Rong mơ không chỉ hấp thu chất dinh dưỡng và làm sạch nước mà còn là một phần quan trọng trong hệ sinh thái rạn san hô Vai trò của rong mơ trong việc điều hòa và cân bằng hệ sinh thái ven biển là rất lớn Đặc biệt, các bãi rong mơ là nơi cư ngụ và ươm nuôi ấu trùng, cũng như là môi trường sinh trưởng và sinh sản của nhiều loài thủy hải sản như cá chuồn, cá dìa và mực.
1.1.3 Thành phần hóa học của rong mơ
Hàm lượng protein trong rong mơ tại Nha Trang dao động từ 8,05-21,11% trọng lượng rong khô, chịu ảnh hưởng bởi thành phần loài, quá trình phát triển, điều kiện sống và phương pháp bảo quản Rong mơ chứa 17 loại acid amin, bao gồm tất cả các acid amin thiết yếu, mang lại giá trị dinh dưỡng cao hơn so với protein từ các cây trồng trên cạn (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2004).
Rong mơ chứa một lượng lipid nhỏ so với các chất hữu cơ khác, với 28 loại acid béo chủ yếu như acid palmitic, acid oleic và acid linoleic, có hàm lượng từ 0,2-0,6% so với trọng lượng khô (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2004).
Thành phần quan trọng nhất trong rong mơ là acid alginic, hàm lượng của nó chiếm khoảng 19-44% so với trọng lượng rong khô (Nguyễn Hữu Đại, 1996) 6
Rong mơ Việt Nam nổi bật với hàm lượng acid alginic cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng chúng làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp alginate Bên cạnh đó, mannitol cũng là một hợp chất quan trọng, tuy nhiên vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Hàm lượng mannitol trong một số loài rong mơ dao động từ 5,98-17,68% so với trọng lượng khô (Chapman và cộng sự, 1980).
Rong mơ Việt Nam chứa nhiều chất khoáng với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào loài, nơi phân bố và giai đoạn phát triển Ngoài các nguyên tố phổ biến như K, Na, Ca và Mg, rong mơ còn có khả năng tích tụ stronti cao, chiếm khoảng 10%.
Hàm lượng khô của mẫu nghiên cứu cho thấy nước chiếm từ 3-10% và iod chiếm khoảng 0,05-0,25% Bên cạnh đó, mẫu còn chứa diệp lục và một số vitamin khác.
1.1.4 Ứng dụng của rong mơ
Rong mơ là một nguồn nguyên liệu quý giá, được ứng dụng rộng rãi trong y dược, công nghiệp, nông nghiệp và thực phẩm Trong y học, rong mơ là thành phần chính để sản xuất keo alginat, được sử dụng trong bao viên thuốc, huyết thanh nhân tạo, chỉ khâu, chất sát trùng và thuốc cầm máu Với hàm lượng iod cao, rong mơ có khả năng ngừa và trị bệnh bướu cổ, đồng thời được dân gian sử dụng để chữa ho, thủy thũng và một số bệnh ngoài da Gần đây, alginat còn được ứng dụng làm chất mang để cố định tế bào Trong công nghiệp, alginat từ rong mơ được dùng trong hồ vải sợi, trong khi trong nông nghiệp, nó có thể làm phân bón và được sử dụng để pha chế thuốc trừ sâu Ngoài ra, trong ngành chế biến thực phẩm, keo alginat được sử dụng phổ biến trong sản xuất bánh kẹo.
Tổng quan về tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của rong biển
Đặng Xuân Cường và cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của năm loài rong mơ tại tỉnh Khánh Hòa, bao gồm S angustifolium, S aemulum, S assimile, S feldmanii và S ilicifolium Kết quả cho thấy rong S angustifolium có hàm lượng phlorotannin/polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao nhất trong số các loài được nghiên cứu.
Nghiên cứu của Huỳnh Trường Giang và cộng sự (2013) đã xác định thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharide trích ly từ rong mơ S microcystum Kết quả cho thấy polysaccharide này có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Tác giả đề xuất rằng polysaccharide từ rong mơ có thể được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm tăng cường miễn dịch cho tôm cá nuôi.
Nghiên cứu của Demirel và cộng sự (2009) đã xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của một số loài rong nâu ở vùng biển Aegean, bao gồm C sinuosa, D dichotoma, D dichotoma var implexa, P fascia và S lomentaria Tác giả đã sử dụng nhiều loại dung môi khác nhau như methanol, dichloromethane và hexane để chiết xuất Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa không chỉ phụ thuộc vào loài rong mà còn vào loại dung môi chiết.
Nghiên cứu của Thoudam và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng việc sử dụng các dung môi khác nhau để tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ rong mơ S muticum, bao gồm alkaloids, anthraquinones, carbohydrates, flavonoids, glycosides, saponins, steroids, phenols, terpenoids và tannins, mang lại kết quả đáng chú ý Kết quả cho thấy methanol là dung môi hiệu quả nhất trong việc chiết xuất các hợp chất này Dịch chiết từ rong mơ sử dụng methanol không chỉ có khả năng khử gốc tự do DPPH mà còn đạt tổng năng lực chống oxy hóa cao nhất.
Nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự vào năm 2013 đã chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của hai loài rong nâu T conoides và T ornata tại vùng biển Ấn Độ có sự khác biệt rõ rệt Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa bao gồm DPPH, ABTS, H2O2/HO, khóa ion Fe (2+) và tổng năng lực khử Kết quả cho thấy rong T conoides có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với rong T ornata.
Dựa trên kết quả nghiên cứu, tác giả kết luận rằng dịch chiết từ hai loài rong nâu có tiềm năng được sử dụng làm thành phần trong thực phẩm chức năng, góp phần nâng cao sức khỏe cho con người.
Năm 2012, Kelman và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các loài tảo biển ở Hawaii, xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng của 37 mẫu tảo, bao gồm 30 loài từ 27 giống khác nhau Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các loài tảo phụ thuộc vào từng loài cụ thể.
Nghiên cứu của Budhiyanti và cộng sự (2012) đã xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết rong nâu Sargassum được thu tại bờ biển đảo Java, Indonesia Kết quả cho thấy hoạt tính này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như quá trình chiết, địa điểm thu hoạch, mùa vụ và loài rong.
Các chất chống oxy hóa tiềm năng từ các loại rong biển kunakeshwar dọc theo bờ biển phía tây Maharashtra, được Megha và cộng sự nghiên cứu vào năm
Nghiên cứu năm 2013 đã xác định hoạt tính chống oxy hóa của các loài rong biển ăn được, bao gồm tảo biển (Chaetomorpha media và Enteromorpha intestinalis), rong nâu (Padina tetrastromatica và Dictyota dichotoma) và rong đỏ (Gracilaria corticata và Gelidiella acerosa), bằng cách sử dụng dung môi chiết methanol và ethanol Kết quả cho thấy Enteromorpha intestinalis chiết bằng methanol và Dictyota dichotoma chiết bằng ethanol có hoạt tính chống oxy hóa tổng giảm mạnh hơn so với các loài rong khác.
Năm 2013, nghiên cứu của Sathya và cộng sự đã chỉ ra rằng hợp chất phlorotannin trong rong nâu Cystoseira trinodis, thu được từ bờ biển Mandapam, có hiệu quả chống oxy hóa và khả năng khử gốc tự do DPPH đáng kể Kết quả cho thấy việc chiết xuất rong nâu bằng dung môi F5 mang lại hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các dung môi khác như DCM, EtoAc (Ethy acetate), F1, F2, F3, F4, F6 và F7.
Năm 2013, nghiên cứu của Indu và Seenivasan đã xác định hoạt tính chống oxy hóa của một số loài rong biển tại vùng Đông Nam Ấn Độ, bao gồm Chaetomorpha linum, Grateloupia lithophila và Sargassum wightii Kết quả cho thấy rong S wightii có hoạt tính chống oxy hóa vượt trội hơn so với hai loại rong còn lại, với khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất.
S wightii được chiết trong dung môi ethanol Rong được chiết trong dung môi ethanol có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với khi chiết trong aceton.
Nghiên cứu của Foon và cộng sự (2013) đã chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa của các loài rong biển tại bờ biển đông Malaysia, bao gồm Eucheuma cottonii và Padina sp Nghiên cứu áp dụng hai phương pháp chiết là chiết thường và chiết soxhlet, sử dụng methanol làm dung môi chiết với khả năng hòa tan trung bình Kết quả cho thấy có mối tương quan cao giữa khả năng khử gốc tự do DPPH, hoạt tính khử sắt và hàm lượng polyphenol trong dịch chiết rong biển.
Nghiên cứu của Farasat và cộng sự vào năm 2013 đã chỉ ra rằng các loài rong lục như Ulva clathrata, Ulva linza, Ulva flexuosa và Ulva intestinalis thu hái tại bờ biển phía bắc Iran có hoạt tính chống oxy hóa đáng kể Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid trong các loài rong này cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong lĩnh vực y tế, mỹ phẩm và công nghiệp thực phẩm.
Năm 2013, Veeraperumal và các cộng sự đã nghiên cứu thành công hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết rong nâu Sargassum plagiophyllum Kết quả cho thấy dung môi aceton có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các dung môi khác như acid, kiềm và nước.
Trong các nghiên cứu về tách chiết hoạt tính sinh học từ rong nâu và rong biển, thường sử dụng dung môi độc hại như methanol và dichloromethane, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người dùng Sản phẩm tách chiết cần trải qua quy trình nghiêm ngặt để loại bỏ các dung môi này (Esther và cộng sự, 2003) Vì vậy, nghiên cứu về việc sử dụng dung môi thân thiện với môi trường là rất cần thiết.
Các phương pháp chiết
1.3.1 Cơ sở của quá trình tách chiết
Chiết là quá trình thu nhận một hoặc nhiều chất từ hỗn hợp, nhằm tách biệt, cô lập và tinh chế các thành phần có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng biệt.
Quá trình chiết diễn ra qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu tiên là dung môi thấm ướt bề mặt nguyên liệu và thẩm thấu vào bên trong, tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất Tiếp theo, dung môi hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí ra khỏi các khe vách tế bào Giai đoạn thứ hai tiếp tục hòa tan các hợp chất trong các ống mao dẫn của nguyên liệu nhờ dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong.
1.3.2 Các phương pháp tách chiết bằng dung môi
Tách chiết bằng dung môi là quá trình phân ly các chất bằng cách chuyển một chất tan từ pha lỏng này sang pha lỏng khác không hòa tan, nhằm nâng cao nồng độ của chất nghiên cứu Quá trình này không chỉ giúp chuyển một lượng nhỏ chất vào thể tích nhỏ dung môi mà còn giữ lại hoạt chất tốt hơn trong việc chiết xuất thành cao dịch thô, tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn tiếp theo.
1.3.2.1 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)
Phương pháp ngấm kiệt là một trong những kỹ thuật trích ly phổ biến, yêu cầu ít thao tác và thời gian Quá trình này diễn ra liên tục, trong đó dung môi bão hòa hoạt chất sẽ được thay thế bằng dung môi mới Tuy nhiên, mẫu sẽ được ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, sau đó dung môi bão hòa sẽ được thay thế và quá trình trích ly sẽ tiếp tục.
1.3.2.2 Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration)
Phương pháp ngâm dầm không mang lại hiệu quả vượt trội so với phương pháp ngấm kiệt Để thực hiện, cần ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh có nắp đậy, sau đó rót dung môi để phủ lớp mẫu Dưới điều kiện nhiệt độ thích hợp, dung môi sẽ thẩm thấu vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên Sau một thời gian, dung môi trong bình sẽ được đổ ra và thay bằng dung môi mới.
1.3.2.3 Tách chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu
Chiết hồi lưu là phương pháp chiết truyền thống, trong đó quá trình đun hồi lưu giúp chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tách biệt các chất có nhiệt độ sôi khác nhau trong hỗn hợp.
Phương pháp này ưu việt nhờ sử dụng ít dung môi nhưng vẫn chiết xuất hiệu quả hoạt chất Quá trình chiết suất diễn ra tự động và liên tục, giúp tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, nhược điểm lớn là không thể chiết xuất khối lượng mẫu lớn, do đó phương pháp này chỉ phù hợp cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
1.3.2.4 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình chứa có mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng ete dầu hỏa hoặc ether ethylic để trích ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước 9
1.3.3 Một số phương pháp tách chiết khác
1.3.3.1 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)
Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) là một phương pháp hiệu quả, thay thế cho các phương pháp truyền thống sử dụng dung môi hữu cơ (King và cộng sự, 2002) Phương pháp này diễn ra nhanh chóng, tự động, có tính chọn lọc cao, không gây cháy nổ và giúp giảm thiểu việc sử dụng các dung môi độc hại.
Siêu chất lỏng (SCFs) đang trở thành lựa chọn ưu việt để thay thế dung môi hữu cơ như n-hexane, dichloromethane và chloroform trong các quy trình chiết xuất và lọc công nghiệp Điều này là nhờ vào khả năng tách các chất cần thiết một cách dễ dàng thông qua sự thay đổi tính chất của dung môi chỉ với áp lực nhẹ, đồng thời đáp ứng quy định về bảo vệ môi trường và giảm thiểu khí thải từ các hợp chất hữu cơ.
1.3.3.2 Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm Đây là kỹ thuật chiết thay thế rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả Sóng siêu âm thường được sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic từ thực vật, quá trình chiết các hợp chất phenol từ Folium eucommiae có sử dụng sóng siêu âm thu được hiệu quả cao hơn so với khi chiết bằng cách gia nhiệt hoặc bổ sung enzyme hỗ trợ chiết tách (Bar, 1987) 16 Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi làm tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết 38
1.3.3.3 Phương pháp chiết sử dụng năng lượng lò vi sóng Đây là một mảng lớn chưa được khai thác, mặc dù bằng cách sử dụng lò vi sóng để làm trung gian trong quá trình chiết có thể duy trì các điều kiện nhẹ và đạt được hiệu quả vượt trội khi chiết (Delazar và cộng sự, 2012) 29 Dưới tác dụng của lò vi sóng nước trong thực vật bị nóng lên nhanh chóng, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch chiết vỡ ra, dịch chiết thoát ra ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ ngưng tụ Hiệu suất có thể bằng hoặc cao hơn những phương pháp khác nhưng thời gian chiết rất ngắn Dịch chiết thu được có mùi tự nhiên Sản phẩm phân hủy trong dịch chiết tự nhiên giảm đi, tiết kiệm thời gian, năng lượng, chi phí Tuy nhiên chỉ áp dụng được cho các nguyên liệu có tuyến dịch chiết nằm ngay sát bề mặt lá Năng lượng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết phân hủy 38
1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng tách chiết của các dung môi khác nhau không giống nhau, phụ thuộc vào các yếu tố như độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt Dung môi kém phân cực dễ hòa tan các chất không phân cực, trong khi dung môi phân cực mạnh lại hòa tan tốt các chất phân cực Độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ giúp dung môi thấm vào nguyên liệu dễ dàng, không cản trở quá trình khuếch tán các chất cần thiết, ngược lại, độ nhớt cao có thể làm giảm hiệu quả chiết xuất.
Theo công thức của Einstein, khi nhiệt độ tăng, hệ số khuếch tán cũng tăng Điều này dẫn đến việc lượng chất khuếch tán tăng lên theo định luật Fick.
Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, nhiệt độ cao có thể gây hại cho các hợp chất kém bền như vitamin, glycoside và alkaloid Đồng thời, sự gia tăng nhiệt độ cũng làm tăng độ tan của tạp chất, dẫn đến việc dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, đặc biệt là gôm và chất nhầy, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất Đối với dung môi có nhiệt độ sôi thấp, nhiệt độ cao có thể dẫn đến hao hụt dung môi, yêu cầu thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lưu Cuối cùng, đối với một số chất đặc biệt, khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại giảm, do đó cần giảm nhiệt độ để tăng độ tan.
Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
1.4.1 Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)
TEAC là phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa so sánh với khả năng chống oxy hóa của Trolox (Demirel và cộng sự, 2009) 30
Cation ABTS + (2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)) là một gốc tự do bền, phát quang màu xanh với độ hấp thu ở 734 nm Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch ABTS +, các chất này sẽ khử ion thành ABTS, cho phép đo độ giảm hấp thu tại 734 nm để xác định hoạt tính chống oxy hóa so với chuẩn Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS + có thể duy trì độ bền trong 2 ngày ở nhiệt độ phòng.
1.4.2 Phương pháp khử gốc tự do DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals)
Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) được phát minh bởi Blois vào năm 1958 DPPH là một gốc tự do bền, có màu tía và đạt đỉnh hấp thu ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, DPPH sẽ được khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), chuyển sang màu vàng Để đánh giá khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa, người ta đo độ giảm hấp thu tại bước sóng 517 nm.
Hình 1.2 Phản ứng giữa gốc tự do DPPH và một chất chống oxy hóa
1.4.3 Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity)
Phương pháp ORAC xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động thông qua việc đo mức độ phân hủy của fluorescein khi có mặt gốc peroxy Phản ứng này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox và mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính Khi fluorescein bị oxy hóa, cường độ phát huỳnh quang giảm, và độ giảm này được đo liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxy hóa Sự có mặt của chất chống oxy hóa làm chậm quá trình phân rã fluorescein Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian được xây dựng, từ đó tính toán được kết quả dưới dạng mmol Trolox/g mẫu Ưu điểm của phương pháp ORAC là khả năng xác định sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa, điều này rất hữu ích khi đo các mẫu thực phẩm có hợp chất chống oxy hóa với tốc độ phản ứng khác nhau.
Hình 1.3 Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian
1.4.4 Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential)
Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp bẫy các gốc tự do (TRAP) được phát triển lần đầu tiên để xác định tổng công suất chống oxy hóa của huyết tương hoặc huyết thanh (Wayner và cộng sự, 1985) Phương pháp này sử dụng gốc peroxyl từ 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), khi AAPH được thêm vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa Quá trình oxy hóa được đo thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng điện cực, và sự có mặt của chất chống oxy hóa sẽ làm chậm quá trình này Giá trị TRAP được tính toán dựa trên độ dài pha lag của mẫu thí nghiệm so với mẫu trắng và mẫu chuẩn là dung dịch Trolox, với kết quả được biểu thị là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/l mẫu lỏng.
1.4.5 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power)
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa dựa trên khả năng khử phức Fe 3+ -TPTZ thành phức Fe 2+ -TPTZ trong môi trường acid, với màu sắc chuyển từ tím sang xanh Độ tăng cường màu xanh tỷ lệ thuận với hàm lượng chất chống oxy hóa trong nguyên liệu, được đo ở bước sóng 593 nm so với dung dịch chuẩn FeSO4 hoặc BHT (Butylated Hydroxy Toluene).
Khi cho phức Fe 3+ -TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất này sẽ nhường điện tử cho phức, tạo ra Fe 2+ -TPTZ, và kết quả tính toán sẽ là mmol Fe 2+ / g chất khô Nếu kết quả tính toán lớn, chúng ta có thể suy đoán rằng số lượng phân tử có khả năng nhường điện tử trong môi trường phản ứng cao Tuy nhiên, một hạn chế của phương pháp FRAP là một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe 3+ -TPTZ cùng lúc, điều này có thể dẫn đến hiểu lầm trong việc đánh giá khả năng chống oxy hóa.
Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxy hóa acid linoleic bởi gốc ABAP so với chất chuẩn tocopherol Nhiệt độ của hỗn hợp, bao gồm 70 μl acid linoleic (2,3 mmol/l) và 100 ml đệm phosphate 0,05 M (Natri phosphate hòa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4), được duy trì ở 40°C trong suốt quá trình phản ứng Sau khi thêm 2 μl dung dịch vào 0,01 ml ABAP (0,04 M) và để phản ứng trong 2-5 phút, 0,02 ml dịch chiết được đưa vào hỗn hợp Cuối cùng, độ hấp thu của hỗn hợp được đo ở 236 nm để xây dựng đường chuẩn tocopherol.
1.4.7 Phương pháp FTC (ferric thiocyanat )
Phương pháp này nhằm khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hóa lipid của chất kháng oxy hóa Các gốc oxy tự do thường gây peroxide hóa lipid, dẫn đến sự hình thành peroxide Peroxide có khả năng oxy hóa Fe 2+ thành Fe 3+, và phức hợp Fe 3+ với SCN - có giá trị hấp thu tối đa tại 500 nm Giá trị hấp thu cao cho thấy mức độ peroxide hóa lipid cao trong quá trình ủ dung dịch Mẫu dung dịch chứa chất kháng oxy hóa sẽ có giá trị hấp thu thấp hơn mẫu trắng không có chất kháng oxy hóa.
1.4.8 Tổng năng lực khử (reducing power)
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6 thành K4Fe(CN)6 Phức K4Fe(CN)6 sau đó tác dụng với FeCl3 để tạo ra KFe[Fe(CN)6] (xanh Pruss).
Độ tăng cường độ màu xanh liên quan trực tiếp đến hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu, được đo ở bước sóng 690 nm và so sánh với dung dịch acid ascorbic làm chất chuẩn.
Giới thiệu về cá thu Scomberomorus commerson
Tên khoa học: Scomberomorus commerson
Tên tiếng Anh: Narrow barred Spanish Mackerel
Tên tiếng Việt: Cá thu vạch
Cá thu vạch thường được gọi ngắn gọn là cá thu-là một loài cá thuộc:
Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Scombridae Chi: Scomberomorus Loài: Scomberomorus commerson
Hình 1.4 Cá thu Scomberomorus commerson
1.5.1 Đặc điểm sinh học và phân bố
Cá thu là loài cá có thân hình thuôn dài và dẹt hai bên, bao gồm 5 loài thuộc hai giống khác nhau, trong đó cá thu vạch, cá thu chấm và cá thu Nhật là những loài phổ biến Cá thu vạch có sản lượng cao nhất, tiếp theo là cá thu chấm Chúng thuộc hai họ chính là họ cá thu ngừ và họ cá thu rắn, với cá thu vạch thuộc họ cá thu ngừ Về đặc điểm hình thái, cá thu có thân hình thoi dài, phần trên kéo dài đến ria dưới mắt hoặc gần sau mắt, với răng và hàm rất nhọn và chắc Cá thu có hai vây lưng, vây lưng thứ nhất có 14-17 gai cứng và vây lưng thứ hai có 14-19 tia mềm, cùng với 8-10 vây phụ, trong khi vây hậu môn bắt đầu từ dưới điểm giữa của vây thứ hai và có 14 tia.
Cá có 18 tia và 8-10 vây phụ, với đường bên gấp khúc ngay sau góc vây lưng thứ hai Màu lưng của cá thường là xám hoặc xanh thẫm, trong khi hai bên thân có màu trắng bạc ánh nâu, với nhiều vạch thẳng đứng từ 20 đến 65 vạch.
Phân bố của khu vực này trải dài từ Ấn Độ Dương đến Tây Thái Bình Dương, bao gồm các quốc gia như Đông Phi, Ấn Độ, Sri Lanka, Úc, Indonesia, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc và Việt Nam, với các khu vực cụ thể như Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, Đông và Tây Nam Bộ.
Cá thu vạch ở Việt Nam được khai thác quanh năm, với chính vụ Bắc diễn ra từ tháng 4 đến tháng 7 và chính vụ Nam từ tháng 8 đến tháng 10.
9 đến tháng 4 Vùng khai thác ở Vịnh bắc Bộ, Trung, Đông và Tây nam Bộ Ngư cụ đánh bắt bằng lưới 4, 14
Cá thu vạch sinh sản theo mùa, thường tập trung ở vùng khơi có dòng nước ấm, gần các rạn san hô và đá ngầm Khi còn nhỏ, chúng sống thành đàn cùng loài, nhưng khi trưởng thành, có thể hòa lẫn với các loài cá khác trong cùng họ Cá thu vạch đạt chiều dài trung bình 80 cm và nặng khoảng 5 kg sau 2 năm phát triển, với một số cá thể có thể dài hơn.
240 cm và nặng 70 kg Cá thu vạch là loài cá săn mồi,chủ yếu là cá nhỏ 14
1.5.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng
Thịt cá thu chứa các thành phần hóa học quan trọng như nước, protein, lipid, gluxit, khoáng chất và vitamin Những thành phần này có sự biến đổi tùy thuộc vào giống loài, độ trưởng thành sinh lý, ngư trường và mùa vụ khai thác Hóa học của thịt cá thu không chỉ ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng mà còn tác động lớn đến giá trị cảm quan của sản phẩm.
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của cá thu4
Thành phần Nước Protein Lipid Gluxit Khoáng
1.5.3 Hư hỏng thường gặp của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh Đặc tính của động vật thủy sản là dễ ươn hỏng, biến chất Nguyên liệu thủy sản sau khi chết xảy ra các biến đổi làm giảm chất lượng, giảm giá trị của nguyên liệu Do đó, nguyên liệu thủy sản sau khi thu hoạch cần phải được bảo quản nhanh chóng để kéo dài thời gian sử dụng Tuy nhiên, thời gian bảo quản cũng có hạn, đặc biệt là bảo quản lạnh chỉ giữ tươi nguyên liệu được trong thời gian ngắn Bảo quản lạnh cá thu sẽ làm giảm sự phát triển của vi sinh vật, enzyme gây hư hỏng thịt cá Mặc dù bảo quản ở nhiệt độ thấp nhưng các biến đổi về cảm quan, hóa lý và vi sinh vẫn xảy ra ở tốc độ thấp Đây chính là nguyên nhân gây hư hỏng ở động vật thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh mà cá thu có hàm lượng lipid cao (12,2%) 4, trong đó hàm lượng acid béo chưa bão hòa cao gấp ba lần hàm lượng acid béo bão hòa Các acid béo tập trung chủ yếu ở phần da, phần cơ thịt màu sáng, phần đầu, bụng và gan Vì vậy thịt cá thu rất dễ hư hỏng, nhanh bị phân hủy, nhất là trong môi trường nhiệt đới nóng ẩm Trong quá trình bảo quản lạnh đông các axit béo tự do được sinh ra từ photpholipid và triglyxerit, có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của cá Axit béo tự do gây ra mùi vị xấu, ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng giữ nước của protein cơ thịt.
Quá trình oxy hóa lipid và lipid trên cá thu
1.6.1 Khái quát chung về lipid ở cá thu
Lipid là các hợp chất hữu cơ tự nhiên phổ biến trong tế bào động vật và thực vật, đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho sự sống.
Lipid là các este của glycerine và acid béo cao phân tử, với chuỗi mạch từ C1 đến C36, có thể có ít hoặc nhiều liên kết đôi Thành phần chính quyết định tính chất của lipid là các acid béo no và không no, trong đó số lượng và vị trí của các nối đôi trong acid béo không no ảnh hưởng đến màu sắc và mùi vị của lipid Đặc biệt, lipid chứa nhiều acid béo không no với nhiều nối đôi dễ bị oxy hóa hơn.
Lipid trong cá xương, như cá thu, được phân thành hai nhóm chính: phospholipid và triglycerid Phospholipid đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc màng tế bào, trong khi triglycerid là nguồn dự trữ năng lượng nằm trong các tế bào mỡ, được bao quanh bởi màng phospholipid và mạng lưới collagen Lipid của cá có sự khác biệt so với lipid của động vật có vú, chủ yếu do chứa đến 40% acid mạch dài (14-22 nguyên tử carbon) và có mức độ không no cao Tỷ lệ acid béo không no với 4, 5 hoặc 6 nối kép trong lipid cá nước ngọt khoảng 70%, thấp hơn so với lipid cá biển với khoảng 88% (Stansbi và Hall, 1967).
Trong dinh dưỡng, acid béo linoleic và linolenic là rất quan trọng vì cơ thể không tự tổng hợp được Mặc dù trong cá biển, hai loại acid béo này chỉ chiếm khoảng 2% lipid tổng số, nhưng dầu cá lại chứa nhiều acid béo không no khác cần thiết để phòng ngừa các bệnh ngoài da, tương tự như acid linoleic và arachidonic.
1.6.2 Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid
Quá trình oxy hóa là quá trình phản ứng hóa học xảy ra, trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa 3, 10
Lipid cá chứa nhiều acid béo không no đa nối đôi, khiến chúng nhạy cảm với quá trình oxy hóa qua cơ chế tự xúc tác Quá trình này bắt đầu khi một nguyên tử hydro được giải phóng từ carbon trung tâm của cấu trúc pentadien, cấu trúc phổ biến trong các nhánh acyl của acid béo có hơn một nối đôi.
-CH=CH-CH2-CH=CH- -CH=CH-C•H-CH=CH- + H•
Gốc tự do (L•) phản ứng nhanh chóng với oxy không khí để tạo thành peroxy gốc tự do (LOO•), từ đó có thể lấy một hydro từ nhánh acyl khác, hình thành lipid hydroperoxyt (LOOH) và một gốc lipid tự do mới (L•) Phản ứng dây chuyền này tiếp tục cho đến khi một gốc tự do được loại bỏ qua các phản ứng với gốc tự do khác, tạo thành gốc (A•) kém hoạt động hơn Quá trình này sản sinh ra một lượng lớn hydroperoxyt, dễ dàng bị bẻ gãy thành các sản phẩm tự oxy hóa thứ cấp với mạch carbon ngắn hơn dưới sự xúc tác của các ion kim loại nặng Các sản phẩm thứ cấp chủ yếu là aldehyt, xeton, rượu, và một phần nhỏ là acid carboxylic và alkan, gây ra những mùi khác nhau và có thể làm sản phẩm có màu hơi vàng.
Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình tự oxy hóa lipid, xúc tác sự hình thành các gốc phản ứng với oxy như gốc hydroxyl (OH•), gốc này ngay lập tức phản ứng với lipid hoặc các phân tử khác tại vị trí tạo ra Hydroperoxyt của acid béo cũng có thể hình thành dưới tác động của enzyme lipoxygenaze, với hàm lượng enzyme này khác nhau ở các mô cơ cá Enzyme này có hoạt độ cao thường được tìm thấy trong mang và dưới da của nhiều loài cá, nhưng không bền và có thể chỉ quan trọng đối với sự oxy hóa lipid ở cá tươi.
Hình 1.5 Quá trình tự oxy hóa của lipid không no
1.6.3 Tác hại của quá trình oxy hóa lipid
Oxy hóa lipid là nguyên nhân chính dẫn đến suy giảm chất lượng cơ thịt cá, gây ảnh hưởng xấu đến hương vị, mùi, màu sắc và cấu trúc của sản phẩm Quá trình này cũng tạo ra các hợp chất độc hại, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm (Kanner, 1994) 40.
Quá trình oxy hóa lipid tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau, trong đó hợp chất không mùi hydroperoxyde là sản phẩm cấp một chủ yếu Tuy nhiên, các hợp chất này không bền và dễ dàng bị oxy hóa thành các sản phẩm cấp hai như malondialdehyde, alkanes, ketones, esters, rượu, acid và hydrocarbons, với aldehydes là thành phần chính gây mùi ôi thiu Các sản phẩm cấp hai tiếp tục bị oxy hóa thành sản phẩm cấp ba hoặc liên kết với protein như acid nucleic, acid amine, và peptide, tạo ra phức chất màu nâu sẫm Do đó, quá trình oxy hóa lipid là một nguyên nhân chính làm giảm chất lượng thực phẩm, ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm.
Khi thực phẩm bị oxy hóa lipid, chúng sẽ thay đổi màu sắc và kết cấu, phát sinh mùi ôi khét và mất đi các acid béo thiết yếu như acid oleic, acid linoleic, acid palmitoleic, cùng với các vitamin tan trong dầu như A, D, E và carotenoids Điều này không chỉ làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm mà còn gây khó khăn trong tiêu hóa và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng, đồng thời gây thiệt hại kinh tế cho người sản xuất.
1.6.4 Các chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm, ngăn chặn hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa trong các tế bào của cơ thể, góp phần bảo vệ sức khỏe và ngăn ngừa lão hóa.
Các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại dựa trên nguyên tắc hoạt động: bậc một và bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một có khả năng khử hoặc kết hợp với các gốc tự do, từ đó kìm hãm quá trình oxy hóa Trong khi đó, các chất chống oxy hóa bậc hai ngăn chặn sự hình thành gốc tự do bằng cách hấp thụ tia cực tím, tạo phức với các kim loại như Cu và Fe, và vô hoạt oxy đơn.
Một số chất chống oxy hóa tự nhiên
Các hợp chất polyphenol là nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai quan trọng của thực vật, với cấu trúc và chức năng đa dạng Chúng không chỉ tạo màu sắc cho thực vật, bảo vệ khỏi tia cực tím và oxy hóa, mà còn đóng vai trò trong sự cộng sinh giữa thực vật và vi khuẩn nốt sần, cũng như bảo vệ cây trồng khỏi vi sinh vật gây hại Đối với thực phẩm, các hợp chất phenol quyết định hương vị và ảnh hưởng đến màu sắc, đồng thời tham gia vào quá trình tạo ra các hợp chất thơm mới, góp phần tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm thực phẩm.
Việc tiêu thụ thực phẩm chứa hợp chất phenol, như trà và rượu vang đỏ, đã được chứng minh mang lại lợi ích cho sức khỏe nhờ vào khả năng kháng oxy hóa của chúng.
Vitamin C có khả năng vô hiệu hóa các gốc tự do hiệu quả bằng cách cung cấp hai nguyên tử hydro, chuyển đổi thành dehydroascorbic acid Ngoài ra, vitamin C còn tương tác tích cực với các chất chống oxy hóa khác như vitamin E, carotenoid và flavonoid Khi vitamin E tiếp xúc với gốc tự do peroxide từ acid béo, nó sẽ chuyển electron cho gốc tự do nhưng cũng trở thành gốc tự do tocopheryl.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và hóa chất
2.1.1 Nguyên liệu rong mơ S mcclurei
Nguyên liệu chính trong nghiên cứu này là rong mơ (S mcclurei), được thu mua tại Thành phố Nha Trang, Khánh Hòa Rong mơ tươi (10 kg) được rửa sạch để loại bỏ tạp chất và muối, sau đó phơi khô dưới ánh nắng mặt trời cho đến khi đạt độ ẩm 16,51% Rong khô được nghiền nhỏ và bảo quản trong các túi PA dưới điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng.
2.1.2 Nguyên liệu cá thu S commerson
Cá thu (S commerson) nguyên con được mua tại chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa, được bảo quản trong thùng xốp có đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang để thực hiện các xử lý tiếp theo.
2.1.3 Hóa chất và thuốc thử
Trichloroacetic acid (TCA) and ethanol were produced in China, while 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin–Ciocalteu reagent, potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), aluminum chloride (AlCl3), and sodium carbonate (Na2CO3) were sourced from Sigma Aldrich in the United States Thiobarbituric acid (TBA) and gallic acid were purchased from Wako in Japan All chemicals used in the study met analytical grade standards.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH)
Bảo quản sản phẩm polyphenol từ dịch chiết rong mơ S mcclurei
Bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm
Bố trí thí nghiệm nhằm xác định ảnh hưởng của các điều kiện chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Nghiên cứu này sẽ giúp hiểu rõ hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất polyphenol, từ đó tối ưu hóa quy trình chiết để nâng cao giá trị dinh dưỡng và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm.
Bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết rong mơ S mcclurei để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu bảo quản lạnh Rửa
Rong mơ tươi được thu mua tại Nha Trang, Khánh Hòa, sau đó được rửa sạch và phơi khô đến độ ẩm 16,51% Rong khô được nghiền nhỏ và bảo quản trong túi PA hút chân không ở nhiệt độ phòng Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang cho thấy rong khô có hàm ẩm thấp giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật và ức chế quá trình tổng hợp trong rong Ngoài ra, rong khô gọn nhẹ, dễ bảo quản và thuận tiện cho việc vận chuyển Giảm hàm lượng ẩm trong nguyên liệu cũng làm tăng tốc độ trích ly, vì nước tác động đến protein và các chất háo nước khác, ngăn cản sự thấm sâu của dung môi và làm chậm quá trình khuếch tán.
Nghiền rong là quá trình sử dụng máy nghiền để làm nhỏ kích thước rong, giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa rong và dung môi Điều này không chỉ hỗ trợ trong việc phá vỡ cấu trúc tế bào của rong mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi.
Sau khi nghiền nhỏ rong, một phần được dùng để xác định độ ẩm Quá trình chiết xuất polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm Do đó, trong giai đoạn chiết, các thí nghiệm sẽ được thực hiện để khảo sát tác động của những yếu tố này nhằm tìm ra môi trường chiết tối ưu cho hoạt tính mong muốn cao.
Sau khi chiết xuất, mẫu sẽ được lọc qua giấy lọc để thu được dịch chứa các hợp chất cần thiết, đồng thời loại bỏ những tạp chất không tan như cặn và bã rong.
Dịch chiết thu được sẽ được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm nhằm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa, bao gồm tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
Sau khi xác định môi trường chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sử dụng dịch chiết từ rong để hạn chế quá trình oxy hóa lipid trong thịt cá thu bảo quản lạnh.
Phần dịch chiết chưa sử dụng sẽ được bảo quản lạnh
2.2.2 Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô
Sơ đồ bố thí nghiệm xác định độ ẩm được mô tả ở hình 2.2
Để đạt được khối lượng không đổi cho cốc, trước tiên cốc cần được rửa sạch và để khô Sau đó, cốc được sấy ở nhiệt độ 105C trong khoảng 1 giờ Sau khi sấy, cốc được lấy ra và làm nguội trong bình hút ẩm trước khi cân Quá trình này được lặp lại cho đến khi sự khác biệt về khối lượng giữa hai lần cân không vượt quá 5.10 -4 g, đảm bảo cốc đạt khối lượng ổn định.
Cân khoảng 5 g mẫu vào cốc đã sấy khô và đánh tơi bằng đũa thủy tinh, sau đó dàn đều mẫu Đặt cốc vào tủ sấy ở 60C trong 2 giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên 105C và sấy liên tục trong 3 giờ, nhớ đảo mẫu sau mỗi giờ Cuối cùng, để mẫu nguội trong bình hút ẩm, cân trên cân phân tích và tiếp tục sấy cho đến khi đạt khối lượng không đổi.
Sấy đến khối lượng không đổi
Tính kết quả Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ)
Tính kết quả: Công thức xác định hàm ẩm: W=(G1-G2)/(G1-G)*100(%) Trong đó: W: Độ ẩm của nguyên liệu (%)
G: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng đổi (g)
G1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)
G2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) 2.2.3 Bố trí thí nghiệm nhằm xác định ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ.
Trong quá trình thí nghiệm, cần chú ý tránh để rong tiếp xúc với ánh sáng mặt trời vì polyphenol dễ bị phân hủy Ngoài ra, cần thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình chiết xuất và theo dõi các điều kiện khác để đảm bảo độ chính xác, đặc biệt khi thời gian thực hiện kéo dài.
2.2.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hiện ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ Nghiên cứu này nhằm xác định mối liên hệ giữa nồng độ dung môi và các chỉ số chất lượng của dịch chiết, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất polyphenol.
Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn nồng độ dung môi ethanol thích hợp
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được trình bày trong hình 2.3 Trong thí nghiệm, 2 g rong khô được cân chính xác và cho vào bình nón thủy tinh 50 ml, sau đó chiết bằng dung môi ethanol với các nồng độ 0, 30, 70 và 100% Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu được thiết lập là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết được xác định để tối ưu hóa kết quả.
Quá trình chiết được thực hiện trong 30 phút tại bể ổn nhiệt Elma S300H, Elmasonic, Germany, với hỗn hợp sau đó được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 Dịch chiết thu được được bổ sung dung môi đến thể tích 40 ml và được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử, cũng như khả năng khử gốc tự do DPPH Thí nghiệm cũng nhằm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến các chỉ tiêu này.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ Nghiên cứu này nhằm xác định mối liên hệ giữa nhiệt độ chiết và các chỉ số chất lượng của dịch chiết, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất.
Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ)
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Chọn nhiệt độ chiết thích hợp
Phương pháp phân tích
Hàm ẩm của rong mơ được xác định thông qua phương pháp sấy khô đến khi đạt khối lượng không đổi Phân tích này được thực hiện hai lần, và kết quả được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình cùng với độ lệch chuẩn.
2.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh Cụ thể, 0,1 ml dịch chiết rong được trộn với 0,9 ml nước cất, sau đó thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5% Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia) Kết quả được báo cáo dưới dạng mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô, với mỗi phân tích được lặp lại hai lần và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
2.3.3 Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
Phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH được sử dụng phổ biến để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003).
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một số điều chỉnh Đầu tiên, 0,3 ml mẫu được trộn với nước cất để đạt tổng thể tích 3 ml Tiếp theo, thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM pha trong ethanol 99,5%, lắc đều và để yên trong bóng tối trong 30 phút Cuối cùng, độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ Carry 50 của Varian, Australia.
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:
DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT Trong đó:
ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết;
ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết
Giá trị IC50 thể hiện thể tích dịch chiết cần thiết để loại bỏ 50% gốc tự do DPPH, với giá trị IC50 thấp hơn chỉ ra hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao hơn, đồng nghĩa với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ hơn Mỗi phân tích được thực hiện hai lần để đảm bảo độ chính xác, và kết quả được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
2.3.4 Xác định tổng năng lực khử
Năng lực khử được xác định theo phương pháp Oyaizu (1986) với một số điều chỉnh nhỏ Để thực hiện thí nghiệm, 1 ml dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH 6,6, tạo thành thể tích cuối cùng là 1,5 ml Sau đó, thêm 0,5 ml K3(Fe[CN] 6) 1% vào hỗn hợp và ủ để tiến hành phân tích.
Nhiệt độ 50C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10%, 2 ml nước cất và cuối cùng là 0,4 ml AlCl3 0,1%, sau đó lắc đều Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 700 nm, với độ hấp thu quang học cao hơn cho thấy năng lực khử mạnh hơn Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị IC50, phản ánh lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50 Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần và kết quả được báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
2.3.5 Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S mcclurei trên thịt cá thu bảo quản lạnh
Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S mcclurei được kiểm tra trên thịt cá thu bảo quản lạnh thông qua chỉ số TBARS, phản ánh các chất phản ứng với acid Thiobarbituric Phân tích TBARS đã được đề xuất từ lâu để đánh giá sự oxy hóa trong thực phẩm.
Phương pháp đo Malonaldehyde (MDA) đã được sử dụng rộng rãi trong 40 năm qua để xác định sự oxy hóa lipid MDA là sản phẩm tách ra từ endoperoxide của các acid béo không bão hòa trong quá trình oxy hóa lipid Khi MDA phản ứng với acid thiobarbituric (TBA), nó tạo ra chất màu hồng (TBARS) có thể được đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 532-535nm.
Các chất phản ứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon
Vào năm 1957, một nghiên cứu đã được thực hiện với một sự điều chỉnh nhỏ, trong đó khoảng 2 gram thịt cá thu được xay nhuyễn và trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% Quá trình chiết xuất này được tiến hành trong một khoảng thời gian nhất định.
Sau khi lọc dịch qua giấy lọc Whatman No.40 trong 10 phút, phần dịch thu được được trộn với dung dịch TBA 0.02 M theo tỷ lệ thể tích bằng nhau, tạo thành tổng thể tích 10 ml trong ống nghiệm Hỗn hợp này được giữ ở nhiệt độ 90C trong 30 phút, sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng Cuối cùng, xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia).
Malonaldehyde (MAD) được xác định thông qua đường cong chuẩn với nồng độ từ 0,01 đến 0,05 M Kết quả được trình bày dưới dạng M MAD/g thịt cá Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần và kết quả được báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được tính toán dựa trên trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập Đồ thị được tạo ra bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0, và giá trị trung bình được phân tích thông qua phép thử ANOVA theo phương pháp Duncan Giá trị p cũng được xác định trong quá trình phân tích.
< 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.