TỔNG QUAN NỘI DUNG ĐỀ TÀI
GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG
Cây Đinh lăng, thuộc họ Araliaceae và chi Polyscias, có nguồn gốc từ Thái Bình Dương với gần 100 loài, chủ yếu phân bố ở khu vực này Mặc dù nhiều cây cảnh mang tên Đinh lăng, chỉ một số loài được sử dụng làm thuốc Loài phổ biến nhất, Polyscias fruticosa (L.) Harms, hay còn gọi là Đinh lăng lá nhỏ, không chỉ được trồng làm cây cảnh và rau ăn mà còn là một vị thuốc nam quý giá Đinh lăng đã được ghi nhận trong Dược điển Việt Nam với công dụng bổ dưỡng, tăng lực và sinh thích nghi Ngoài Việt Nam, cây còn được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Liên Xô và Ấn Độ, nhờ vào các tác dụng giải độc, kháng khuẩn và kháng viêm.
Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam, Đinh lăng có 6 loài:
(Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007)
Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng hương, Đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá) Polyscias balfouriana Bailey (Đinh lăng lá tròn, Đinh lăng lá xà cừ)
Polyscias filicifolia (Merr et Fourn) Bailey (Đinh lăng đuôi phƣợng, Đinh lăng lá rách)
Polyscias guilfeylei var licinita Bailey (Đinh lăng lá xoan xẻ, Đinh lăng lá xà cừ nhỏ)
Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Baylei (Đinh lăng lá trổ)
Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Đinh lăng đĩa)
Một số hình ảnh về các loài Đinh lăng:
Hình 2.1 Đinh lăng lá nhỏ
Hình 2.2 Đinh lăng lá tròn
5 Hình 2.3 Đinh lăng đuôi phƣợng
Hình 2.4 Đinh lăng lá xoan xẻ
Hình 2.5 Đinh lăng lá trổ
Hình 2.6 Đinh lăng đĩa Ngoài ra còn có Aralia chinensis L Araliacea – Đinh lăng Trung Quốc có ở rừng Đà Lạt
Theo nghiên cứu của Ngô Ứng Long và cộng sự tại Viện Y học Quân sự, rễ và lá của cây Đinh lăng chứa nhiều hợp chất quý giá như saponin, alkaloid, glucosid, flavonoid, tanin, cùng với các vitamin B1, B2, B6, C, phytosterol, acid hữu cơ, tinh dầu, và nhiều nguyên tố vi lượng Đặc biệt, cây này còn cung cấp các acid amin thiết yếu như lysin, cystein, methionin và chứa 21,1% đường.
Võ Duy Huấn đã phân lập đƣợc một số saponin mới từ rễ và lá Đinh lăng
Trần Công Luận và cộng sự đã phân lập thành công 5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng, bao gồm panaxydol, panaxynol, (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, và (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Đặc biệt, hai hợp chất cuối chỉ được tìm thấy trong lá Đinh lăng, chưa từng phát hiện ở các cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae Ngoài ra, trong lá còn chứa saponin triterpen với tỷ lệ 1,65%, có genin dạng oleanolic.
The roots contain five polyacetylene compounds, with panaxydol, panaxynol, and (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol being the three notable substances that exhibit strong antibacterial properties and potential anti-cancer effects.
Cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyacetylen:
(8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on
(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on panaxynol panaxydol
2.1.3 Tác dụng dƣợc lý (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2009; Trần Cao Sơn, 2015) Ở Việt Nam, các loài Đinh lăng đƣợc trồng rất nhiều và đa phần đều có thể sử dụng làm thuốc Nhƣng có rất ít tài liệu nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của từng loài Chỉ có cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về thành phần hóa học cũng nhƣ tác dụng dƣợc lý Đinh lăng đã đƣợc các nhà nghiên cứu ở Liên Xô thử nghiệm tác dụng tăng lực và chống stress trên các phi công, nhà du hành vũ trụ và công nhân làm việc dưới môi trường có bức xạ siêu tần, tác nhân độc hại
Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy rễ Đinh lăng có khả năng tăng cường sức dẻo dai và sức đề kháng cho cơ thể, giúp chống lại mệt mỏi, theo Viện Y học quân sự.
Năm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự đã nghiên cứu độc tính của Đinh lăng, cho thấy liều gây chết LD 50 qua đường tiêm phúc mạc là 32,9 g/kg chuột, chứng tỏ Đinh lăng có độc tính rất thấp Khi so sánh với Nhân sâm, LD 50 của Nhân sâm là 16,5 g/kg, cho thấy Đinh lăng ít độc hơn gấp đôi Tuy nhiên, saponin trong Đinh lăng có thể gây huyết tán, dẫn đến hiện tượng vỡ hồng cầu Ở người, việc tiêu thụ quá nhiều Đinh lăng có thể gây ra triệu chứng say, mệt mỏi và tiêu chảy, nhưng không gây tăng huyết áp như Nhân sâm.
Các nghiên cứu trên chuột cho thấy Đinh lăng có khả năng tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, nâng cao sức đề kháng đối với bức xạ cao tầng, kéo dài thời gian sống khi nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei, và tăng cường hiệu quả của thuốc chống sốt rét chloroquine.
Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy Đinh lăng có khả năng cải thiện sức bền cho bộ đội và vận động viên thể thao Ngoài ra, tác dụng của Đinh lăng trong việc tăng cân và tăng cường sức lực đã được xác nhận qua các thí nghiệm trên người và chuột.
Đinh lăng là một loại thảo dược hữu ích giúp phục hồi sức khỏe cho những người suy mòn hoặc mới khỏi bệnh, cải thiện ăn ngon và giấc ngủ Việc sử dụng Đinh lăng để nấu nước uống hàng ngày như một loại thuốc bổ mang lại nhiều lợi ích Các hợp chất polyacetylen, chẳng hạn như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol, có trong cây Đinh lăng cũng góp phần vào tác dụng tích cực của nó đối với sức khỏe.
Panax vietnamensis và Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng chuẩn khuẩn
Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được chủng khuẩn Gram âm
Từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về cao Đinh lăng, tập trung chủ yếu vào lá do dễ thu hái Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống stress và trầm cảm Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có khả năng chống trầm cảm và phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress với liều lượng từ 45 đến 180 mg/kg thể trọng Ở khoảng liều này, cao Đinh lăng còn có các tác dụng tích cực khác như tăng cường sức lực và kích thích hoạt động.
10 động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch
Theo dân gian, Đinh lăng là một loại thảo dược quý được sử dụng để bồi bổ sức khỏe, giúp chữa trị các tình trạng như suy nhược cơ thể, mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho ra máu và đau tử cung Ngoài ra, Đinh lăng còn có tác dụng lợi tiểu và chống độc Nhiều bài thuốc dân gian cũng đã ứng dụng Đinh lăng trong việc cải thiện sức khỏe.
Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g Thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 - 3 lần uống trong ngày
Để chữa trị các triệu chứng như sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau tức ngực và nước tiểu vàng, bạn có thể sử dụng bài thuốc từ các vị thuốc tự nhiên Cụ thể, kết hợp 30 g đinh lăng tươi (rễ, cành), 10 g lá vỏ chanh, 10 g vỏ quýt, 20 g sài hồ (rễ, lá, cành) và 20 g lá tre tươi Sau khi cắt nhỏ các vị thuốc, cho vào nồi, đổ ngập nước và sắc đặc cho đến khi còn khoảng 250 ml Chia lượng thuốc này ra uống 3 lần trong ngày để đạt hiệu quả tốt nhất.
Chữa sƣng vú: cành lá Đinh lăng 30 – 40 g Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống nóng Ngày uống 1 - 2 lần
Thuốc lợi sữa: lá Đinh lăng tươi 50 – 100 g, bong bóng lợn 1 cái, thái nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn
Chữa đau tử cung: cành và lá Đinh lăng rửa sạch, sao vàng, sắc uống thay chè
Chữa mẩn ngứa do dị ứng: lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, đổ 500 ml nước sắc còn 250 ml uống trong ngày Dùng liên tục trong 2 – 3 tháng
Chữa thiếu máu: rễ Đinh lăng, hà thủ ô, thục địa, hoàng tinh, mỗi vị 100 g, tam thất
20 g Tán bột, sắc uống ngày 100 g
Để chữa viêm gan mạn tính, có thể sử dụng bài thuốc gồm các thành phần sau: rễ Đinh lăng 12 g, nhân trần 20 g, ý dĩ 16 g, hoài sơn, biển đậu, rễ cỏ tranh, xa tiền tử, ngũ gia bì, mỗi vị 12 g, cùng với uất kim, nghệ, ngưu tất, mỗi vị 8 g Hỗn hợp này nên được sắc uống hàng ngày một thang để đạt hiệu quả tốt nhất.
Chữa liệt dương hiệu quả với bài thuốc từ các vị thuốc tự nhiên như rễ Đinh lăng, hoài sơn, ý dĩ, hoàng tinh, hà thủ ô, kỷ tử, long nhãn và cám nếp, mỗi vị 12 g Thêm vào đó, sử dụng trâu cổ và cao ban long, mỗi vị 8 g, cùng với sa nhân 6 g Tất cả các vị thuốc này được sắc uống hàng ngày, tạo thành một thang thuốc bổ trợ cho sức khỏe sinh lý nam giới.
Chữa sốt rét: rễ Đinh lăng, sài hồ, mỗi vị 20 g Rau má 16 g Lá tre, cam thảo nam, mỗi vị 12 g Bán hạ sao vàng 8 g, gừng 6 g Sắc uống
GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp quốc (FAO) định nghĩa thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là bất kỳ hợp chất hoặc hỗn hợp nào được sử dụng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại Điều này bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh cho con người và động vật, cũng như các bộ phận không mong muốn của động vật và thực vật có thể gây hại hoặc ảnh hưởng đến quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển và mua bán thực phẩm, nông sản gỗ và sản phẩm từ gỗ, cũng như thức ăn chăn nuôi.
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) được sử dụng để kiểm soát côn trùng, nhện và các sinh vật khác trên động vật, đồng thời còn có vai trò trong việc điều hòa sinh trưởng thực vật, làm rụng lá, thưa cây, và ngăn chặn rụng sớm Ngoài ra, thuốc BVTV cũng được áp dụng cho cây trồng trước và sau thu hoạch nhằm bảo vệ sản phẩm khỏi hư hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ngày càng được sử dụng phổ biến với đa dạng về số lượng và chủng loại Để thuận tiện cho việc sử dụng và quản lý, thuốc BVTV thường được phân loại thành các nhóm khác nhau Sự phân loại này rất phong phú và có thể dựa trên nhiều tiêu chí như cấu tạo hóa học, mục đích sử dụng, nguồn gốc hoặc mức độ độc tính.
Theo công dụng thì thuốc BVTV đƣợc phân loại nhƣ sau: trừ sâu, trừ nấm, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ vi khuẩn, trừ ốc sên …
Thuốc trừ sâu là các chất hóa học hoặc sinh học được sử dụng để kiểm soát, tiêu diệt sâu bệnh và điều chỉnh sự phát triển của thực vật.
Thuốc trừ nấm là sản phẩm bảo vệ cây trồng và hạt giống, giúp ngăn chặn sự xâm nhập và gây hại của nấm bệnh, đồng thời có khả năng tiêu diệt chúng khi cần thiết.
2.2.3 Mức dƣ lƣợng tối đa trong dƣợc liệu
Trên toàn cầu, nông nghiệp sạch, đặc biệt là rau sạch, đang trở thành mối quan tâm hàng đầu, cùng với đó là dược liệu sạch trong ngành Dược để sản xuất thuốc Điều này nhằm loại bỏ dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người Tuy nhiên, nghiên cứu về thuốc bảo vệ thực vật tại Việt Nam hiện vẫn còn hạn chế.
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp quốc (FAO) cùng với Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã thiết lập quy định Codex về mức độ tối đa cho phép của một số hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) trong nông sản Quy định này cụ thể hóa lượng thuốc BVTV trên từng nền mẫu, bao gồm phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất và nước sau một thời gian nhất định dưới tác động của hệ sinh thái và điều kiện môi trường.
MRL (Giới hạn Tồn dư Tối đa) là lượng tối đa của một loại thuốc bảo vệ thực vật được phép có mặt trong nông sản và thực phẩm mà không gây hại cho sức khỏe con người MRL được đo lường bằng miligam thuốc bảo vệ thực vật trên mỗi kilogam thực phẩm (mg/kg) theo quy định của Bộ Y Tế năm 2016.
ADI (Lượng chất độc chấp nhận hấp thu hàng ngày) là mức tối đa chất độc mà cơ thể con người hoặc động vật có thể tiếp nhận mà không gây hại, được tính bằng mg hoặc µg trên đơn vị trọng lượng cơ thể (Bộ Y Tế, 2016)
Mỗi loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có mức giới hạn dư lượng (MRL) riêng trên các nền mẫu khác nhau Tuy nhiên, với sự phát triển của ngành công nghệ hóa học, nhiều thuốc BVTV mới ra đời chưa có quy định MRL cụ thể Để giải quyết vấn đề này, nhiều quốc gia như Nhật Bản, Mỹ và châu Âu đã áp dụng giá trị MRL chung là 0,01 mg/kg cho tất cả thuốc BVTV Do đó, các phòng thí nghiệm tại Việt Nam cũng đã áp dụng giá trị này trong quá trình kiểm nghiệm dược liệu.
Tên hóa học: 1-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-nitroimidazolidin-2-ylideneamine Khối lượng phân tử: 255,7 g/mol
Công thức phân tử: C 9 H 10 ClN 5 O 2
Imidacloprid là một loại thuốc bảo vệ thực vật thuộc nhóm Neonicotinoid, có phổ rất rộng và được sử dụng từ giữa những năm 1990 tại Đông Nam Á và châu Âu Nhóm này bao gồm các chất như acetamiprid, nitenpyram, thiamethoxam và thiacloprid, gây kích thích thần kinh trung ương tương tự như nicotin Imidacloprid thường được áp dụng trong nông nghiệp để tăng trưởng cây thông qua phun lên lá, xử lý giống và đất với liều lượng thấp Tuy nhiên, gần đây, nhiều quốc gia đã hạn chế sử dụng do mối liên hệ với hội chứng CDD ở ong mật, khi các chất này làm suy yếu hệ thống miễn dịch của chúng, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao Tại Việt Nam, các chất này vẫn được phép sử dụng trong nông nghiệp theo quy định của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
Bảng 2.2 Nghiên cứu về độc tính cấp của imidacloprid (Robert Krieger, 2001) Động vật thí nghiệm Đường dùng LD 50 /LC 50 (mg/kg thể trọng / mg/m 3 không khí)
Thỏ Da Không bị kích ứng
Thỏ Mắt Không bị kích ứng
Chuột lang Da Không thấy nhạy cảm
Bảng 2.3 Giới hạn tối đa dƣ lƣợng imidacloprid trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
ADI (mg/kg thể trọng) Thực phẩm MRL (mg/kg)
Các loại rau từ rễ và củ 0,5
2.2.5 Azoxystrobin (Ehab M.H Abdelraheem, 2015; T Nageswara Rao, 2012)
Tên hóa học: Methyl (E)-2-{2[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4- yloxy]phenyl}3-methoxyacrylate
Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol
Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm thuộc nhóm Strobin, được sử dụng chủ yếu để bảo vệ cây trồng khỏi sự hư hại do nấm Thuốc có nguồn gốc tự nhiên, có tác dụng rộng rãi và thuộc nhóm Strobilurin Cơ chế hoạt động của Azoxystrobin là ức chế hô hấp ở ty thể của nấm, giúp ngăn chặn sự phát triển của chúng Thuốc được hấp thu qua rễ và di chuyển trong mạch gỗ đến thân, lá, hoặc thấm qua bề mặt lá đến mép và rìa lá đang phát triển Azoxystrobin hiệu quả trong việc hạn chế nguy cơ gây bệnh trên lá và đất, bao gồm các bệnh như nấm lá, bệnh đốm trắng, bệnh rụng lá và nhiều mầm bệnh khác trên nhiều loại cây trồng.
Bảng 2.4 Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin Động vật thí nghiệm Giới Đường dùng LD 50 (mg/kg) LC 50 (mg/l)
Chuột nhắt Đực, cái Uống >5000
Chuột cống Đực, cái Uống >5000
Chuột cống Đực, cái Da >2000
Chuột cống Đực, cái Hít trong 4h Đực 0,698
Thỏ Cái Kích ứng da Không đáng kể
Thỏ Cái Kích ứng mắt Không đáng kể
Chuột lang Cái Trên da nhạy cảm
Bảng 2.5 Giới hạn tối đa dƣ lƣợng azoxystrobin trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
ADI (mg/kg thể trọng) Thực phẩm MRL (mg/kg)
Các loại rau họ bắp cải, cải bắp, cải bông
Các loại rau bầu bí 1
Các loại rau họ đậu, rau xà lách, lá rau diếp
Sâm khô (kể cả sâm đỏ) 0,3
2.2.6 Ƣu, nhƣợc điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay (Michelangelo
Anastassiades et al., 2003) Ưu điểm:
- Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng và phòng trừ khi xảy ra các trận dịch
- Cho hiệu quả trực tiếp, rõ rệt và tương đối triệt để
- Nâng cao năng suất rõ rệt
- Dễ ứng dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều vùng khác nhau
- Dễ gây độc cho người trực tiếp sử dụng thuốc (pha chế, phun thuốc …)
- Ảnh hưởng sâu sắc đến các quần thể sinh vật gây mất cân bằng sinh thái
Các loại thuốc trừ sâu có độ bền cao và thời gian lưu giữ lâu trong đất, như DDT, có tác động nghiêm trọng đến môi trường sống xung quanh Cụ thể, DDT cần tới 10 năm để phân hủy 95% lượng thuốc trong đất.
- Gây ra hiện tƣợng kháng thuốc Là một vấn đề đang cần đƣợc quan tâm hàng đầu, do sử dụng một loại thuốc liên tục trong nhiều năm
Hiện nay, xu hướng toàn cầu đang dần hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có độc tính cao, nhằm bảo vệ môi trường Thay vào đó, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực tìm ra những loại thuốc mới với nhiều ưu điểm vượt trội và giảm thiểu nhược điểm của các sản phẩm hiện tại.
2.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV
2.3.1 Tình hình sử dụng HCBVTV trên thế giới (Trần Cao Sơn, 2015)
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ngày càng trở nên quan trọng trong việc phòng trừ sâu bệnh và bảo vệ sản xuất, góp phần đảm bảo an ninh lương thực Theo các chuyên gia, trong các thập kỷ 70, 80, và 90 của thế kỷ 20, thuốc BVTV đã giúp tăng năng suất từ 20 đến 30% cho các loại cây trồng chủ yếu như lương thực, rau và hoa quả.
Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), ở các nước châu Á trồng nhiều lúa, 10 năm qua
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THUỐC BVTV
2.4.1 Phương pháp truyền thống (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013) Để chống lại các loài sinh vật gây hại, từ lâu người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu một cách rộng rãi trong nông nghiệp nhƣ: trồng lúa, rau, cây ăn quả và phổ biến hiện nay là dược liệu Mục đích của phương pháp phân tích đa dư lượng là phân tích đồng thời nhiều thuốc BVTV trong cùng một lần thực hiện, do đó kỹ thuật chiết cũng hướng đến chiết được càng nhiều thuốc BVTV càng tốt Đồng thời phương pháp phải được thực hiện nhanh chóng và dễ dàng, cùng với việc sử dụng một lƣợng dung môi tối thiểu mà vẫn chiết đƣợc tất cả thuốc BVTV có trong nền mẫu Đã có một vài phương pháp được sử dụng để xác định dư lượng thuốc trừ sâu tồn dư trong trái cây và nước ép trái cây như: chiết lỏng, chiết với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết vi pha rắn, chiết siêu tới hạn…Các phương pháp này thường tốn rất nhiều thời gian
Phương pháp phân tích đa dư lượng đầu tiên và nổi tiếng nhất là phương pháp Mills, được phát triển vào những năm 1960 bởi Cục quản lý dƣợc và thực phẩm Mỹ (FDA) bởi nhà hóa học P.A Mills Phương pháp này chủ yếu phân tích thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ bằng cách chiết xuất trên mẫu thực phẩm không chứa chất béo bằng acetonitril, sau đó pha loãng với H2O và phân tách vào dung môi không phân cực như petroleum ether Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là mất một phần thuốc trừ sâu phân cực trung bình, đặc biệt là nhóm phospho hữu cơ Do đó, cần phát triển các phương pháp thay thế để xác định các hợp chất không được chiết xuất bởi phương pháp Mills, thường chỉ đơn giản là thay đổi dung môi chiết xuất ban đầu.
19 nhau bởi bước phân vùng, làm sạch và xác định thuốc BVTV (Anastassiades et al.,
Phương pháp chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật sử dụng dung môi để tách chất hoặc nhóm hợp chất từ hỗn hợp nghiên cứu, sau đó chuyển chất phân tích sang dung môi thứ hai không hòa tan với dung môi đầu tiên Việc lựa chọn dung môi phù hợp rất quan trọng để tránh hao hụt chất cần phân tích và loại bỏ tạp chất Các yếu tố như độ tan của chất trong dung môi, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất hòa tan khác cũng ảnh hưởng đến quá trình chiết Để cải thiện hiệu quả, có thể sử dụng các tác nhân vật lý như lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc hoặc sóng siêu âm Đối với mẫu có nhiều tạp chất, có thể kết hợp với các quy trình làm sạch khác.
Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng thường được áp dụng để
- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu
Phân chia cao thô ban đầu chứa nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực, và quá trình này nhằm tách chúng thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Năm 2009, Tiến sĩ Nguyễn Thị Bích Thu công bố nghiên cứu về việc ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật Nghiên cứu này áp dụng phương pháp chiết mẫu bằng siêu âm, tiếp theo là làm sạch mẫu bằng cột nhồi silicagel kết hợp với 10% than hoạt, và cuối cùng định lượng bằng phương pháp GC/MS.
2.4.2 Phương pháp QuEChERS (Trần Cao Sơn, 2015)
Trong những năm gần đây, phương pháp QuEChERS (viết tắt của quick - nhanh, easy - dễ, cheap - rẻ, effective - hiệu quả, rugged - ổn định, và safe - an toàn) đã có sự phát triển đáng kể Được báo cáo lần đầu bởi Anastassisdes và Lehotay, phương pháp này được phát triển bởi Sở Nông nghiệp Hoa Kỳ vào năm 2003 QuEChERS là một phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc trừ sâu trên nhiều loại nền mẫu khác nhau, chỉ cần khoảng 70 – 100% nước trong thành phần, với mẫu khô được bổ sung nước.
Phương pháp chiết xuất thuốc BVTV trên trái cây và rau quả được phát triển nhằm cải thiện quá trình làm sạch mẫu, bao gồm các thành phần như đường, acid béo, acid hữu cơ, sterol, protein, chất màu và nước thừa So với các phương pháp truyền thống như chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn, phương pháp này mang lại sự thuận tiện hơn Nó đơn giản và hiệu quả trong việc chiết và làm sạch các mẫu có nền phức tạp, với quy trình bao gồm hai bước.
Quá trình chiết xuất bao gồm 20 chiết xuất và phân chia bằng dung môi hữu cơ và dung dịch muối Sau đó, phần nổi trên bề mặt được tách ra và làm sạch thông qua kỹ thuật chiết phân tán pha rắn (d-SPE).
Vào năm 2005, Lehotay và các cộng sự đã nghiên cứu và thẩm định một phương pháp phân tích, cho thấy phương pháp này đạt kết quả tốt với 207 trong số 235 loại thuốc trừ sâu trên các mẫu rau quả, tuy nhiên, độ thu hồi của những chất nhạy cảm với pH bị ảnh hưởng rõ rệt Để cải thiện độ thu hồi, Lehotay đã điều chỉnh phương pháp bằng cách sử dụng đệm acetat với pH 4,8 - 5,0, và phương pháp này đã được nghiên cứu tại 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia, trở thành phương pháp chính thức của AOAC 2007.01 vào năm 2007 Đồng thời, Anastassiades và các cộng sự phát triển một phương pháp QuEChERS khác sử dụng đệm citrat với pH khoảng 5, phương pháp này đã được thẩm định liên phòng tại nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và trở thành phương pháp châu Âu CEN 15662.
Hiện nay, phương pháp chiết thuốc BVTV theo QuEChERS vẫn được áp dụng với ba quy trình chính Đầu tiên là phiên bản gốc do Anastassiades và Lehotay phát triển Thứ hai là phiên bản sử dụng đệm acetat theo tiêu chuẩn AOAC Cuối cùng là phiên bản dùng đệm citrat theo tiêu chuẩn châu Âu.
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
Phương pháp gốc ban đầu
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
+ 50mg C18; 7,5mg GCB (lựa chọn thêm)
Phương pháp AOAC 2007.01 (Đệm acetat pH 4,8-5)
15g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Phân tích GC-MS; LC-MS
Na 3 citrat + 1,5 g Na 2 citrat; 1,5g NaCl
+ 50 mg C18; 7,5 mg GCB (lựa chọn thêm)
Phương pháp EN 15662 (Đệm citrat pH 5)
21 Ưu điểm của phương pháp QuEChERS (Michelangelo Anastassiades, 2003)
Nhanh (8 mẫu trong khoảng 30 phút)
Đơn giản (các bước thực hiện không quá khó, sai số tối thiểu)
Rẻ (không tốn kém nhiều khi chuẩn bị mẫu)
Lƣợng dung môi sử dụng thấp (10 ml acetonitril)
Hầu nhƣ không cần dụng cụ thủy tinh
Đƣợc dùng trên phạm vi rộng các thuốc trừ sâu (chất phân cực, chất phụ thuộc vào pH)
Chiết xuất bằng acetonitril được phân tích qua sắc ký khí và sắc ký lỏng là một phương pháp mới trong phân tích đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tại Việt Nam Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều tác giả đã áp dụng các phương pháp tiên tiến, trong đó có QuEChERS, và điều chỉnh một số bước để phù hợp với điều kiện thực tế nhằm tối ưu hóa quy trình phân tích một cách hiệu quả nhất.
Năm 2005, Ths Trần Việt Hùng đã tiến hành nghiên cứu nhằm xác định thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) trong dược liệu bằng các phương pháp chiết nóng, chiết lạnh và chiết Soxhlet Nghiên cứu cũng áp dụng cột chiết pha rắn (SPE) để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi phân tích bằng sắc ký khí.
KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS
HPLC, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao, được phát triển từ năm 1967-1968 dựa trên phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay, HPLC ngày càng hiện đại hóa nhờ vào sự tiến bộ của công nghệ máy móc phân tích Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm, đặc biệt là trong ngành dược phẩm, cho phép phân tích định tính và định lượng các thuốc đa thành phần Ngoài ra, HPLC cũng được áp dụng nhiều trong lĩnh vực dược liệu.
Phương pháp HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật phân tích hóa lý quan trọng, được sử dụng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha không hòa lẫn: pha tĩnh và pha động Khi dung dịch hỗn hợp được đưa vào cột HPLC, các chất sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào tính chất của cột và chất phân tích Việc bơm dung môi pha động vào cột sẽ tạo ra sự di chuyển khác nhau của các chất, dẫn đến sự phân tách hiệu quả Cuối cùng, các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện, giúp xác định và định lượng chính xác các thành phần trong mẫu.
22 gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC diễn ra nhờ sự vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển qua cột sắc ký, nó sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh giữ lại ra khỏi cột Tốc độ rửa giải và khả năng tách các chất phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, chất tan và pha động Sự tách biệt xảy ra khi hỗn hợp các chất tương tác khác nhau với pha tĩnh, và do tính chất lý hóa cùng cấu trúc phân tử, các chất này di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến việc phân tách hiệu quả.
2.5.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC
Hình 2.8 Cấu tạo hệ thống HPLC
Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động 2 - Bộ phận khử khí 3 - Bơm cao áp 4 -
Bộ phận tiêm mẫu sử dụng syringe hoặc auto sampler để đưa mẫu vào hệ thống Cột sắc ký với pha tĩnh được giữ ở nhiệt độ ổn định nhờ vào thiết bị điều nhiệt Đầu dò detector có nhiệm vụ nhận tín hiệu từ quá trình sắc ký Hệ thống máy tính điện tử được cài đặt phần mềm để nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống Cuối cùng, thiết bị in dữ liệu giúp ghi lại kết quả phân tích.
Pha động đóng vai trò quyết định trong quá trình sắc ký, ảnh hưởng đến khả năng tách các chất trong hỗn hợp Việc lựa chọn dung môi pha động với độ phân cực phù hợp là rất quan trọng, và có thể cần phối hợp từ 2 đến 3 dung môi trong một lần phân tích Nhiều yếu tố như pH, tỷ lệ và thành phần pha động, bọt khí, và sự hiện diện của dung môi không tinh khiết có thể làm giảm chất lượng kết quả phân tích Do đó, việc sử dụng dung môi tinh khiết trong sắc ký là điều cần thiết để đạt được kết quả chính xác.
23 khiết dựng cho HPLC Tất cả cỏc mẫu thử phải được lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi tiêm vào cột
Trong HPLC, bơm là bộ phận quan trọng nhất, yêu cầu khả năng cung cấp dòng chảy chính xác và ổn định Bơm cần chịu được áp lực cao lên đến 5000 psi và có khả năng cung cấp một lượng lớn dung môi pha động.
Bộ phận tiêm mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc đưa mẫu vào cột sắc ký với dung tích từ 5 đến 100 µl Có hai phương pháp tiêm mẫu chính: tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động, mỗi phương pháp đều có ưu điểm riêng.
Cột sắc ký, được coi là trái tim của quá trình sắc ký, thường được chế tạo từ thép không gỉ với hình dạng thẳng và thể tích có thể thay đổi Pha tĩnh bên trong cột được lựa chọn dựa trên kỹ thuật sắc ký cụ thể Trước khi mẫu đi vào cột chính, nó cần phải đi qua cột bảo vệ hay còn gọi là tiền cột, nhằm đảm bảo tuổi thọ cho cột phân tích.
Detector là bộ phận quan trọng trong hệ thống HPLC, giữ vai trò như não bộ để phát hiện chất cần phân tích Việc lựa chọn detector phù hợp phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích Hiện nay, có nhiều loại detector khác nhau như detector khối phổ (MS), detector chuỗi diod quang (DAD), detector huỳnh quang (FLD), detector khúc xạ và detector ion hóa ngọn lửa Tuy nhiên, detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) là loại được sử dụng rộng rãi nhất nhờ vào độ nhạy rất cao của nó.
2.5.4 Ứng dụng của HPLC trong dƣợc liệu
Định tính các thành phần trong dược liệu, dịch chiết dược liệu là ứng dụng quan trọng nhất, giúp phát hiện tạp chất và các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hoặc thành phẩm dược liệu.
Các phương pháp phân tích hiện đại cho phép xác định hàm lượng các chất thông dụng, với khả năng định lượng một hoặc nhiều chất cùng lúc nếu điều kiện thích hợp được chọn.
Có thể sử dụng để theo dõi và đánh giá sự thay đổi hàm lượng các chất trong dược liệu trong quá trình bảo quản hoặc trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất.
- Dùng để phân lập các chất tinh khiết từ dƣợc liệu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát dư lượng hai hóa chất bảo vệ thực vật imidacloprid và azoxystrobin trong dược liệu tươi và khô từ rễ và lá cây Đinh lăng được thực hiện vào tháng 06/2017 tại nhiều địa điểm khác nhau.
- Dược liệu lá tươi và rễ tươi lấy tại một số vườn trồng Đinh lăng ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp
- Dƣợc liệu lá khô và rễ khô thu mua tại một số cửa hàng dƣợc liệu ở Cần Thơ,
3.1.2 Chất chuẩn – Hóa chất – Dung môi
Silicagel cỡ hạt 40 – 63 àm (Merck) Bản mỏng silicagel 60 F 254 (Merck)
Dung môi: methanol, petrolium ether (60-90), diclorometan, cloroform, ethylacetat, aceton và một số dung môi cơ bản trong phòng thí nghiệm
Nước cất 2 lần, acetonitril, methanol JK Baker (Merck)
Chất chuẩn imidacloprid với độ tinh khiết 99,82%
Chất chuẩn azoxystrobin với độ tinh khiết 99,60%
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch hai chuẩn gốc azoxystrobin 160 àg/ml và imidacloprid 40 àg/ml được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 8,0 mg azoxystrobin và 2,0 mg imidacloprid, sau đó hòa tan trong acetonitril Dung dịch được chuyển vào bình định mức 50 ml và bổ sung acetonitril đến vạch Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc được tính toán dựa trên khối lượng thực tế và độ tinh khiết của các chất chuẩn Để đảm bảo chất lượng, các dung dịch chuẩn gốc cần được bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp với azoxystrobin 4 àg/ml và imidacloprid
Để chuẩn bị dung dịch 1 àg/ml (Dung dịch 2), bạn cần lấy chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn gốc 1 và cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm acetonitril đến vạch Dung dịch này nên được bảo quản trong tủ lạnh để đảm bảo chất lượng.
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp chứa azoxystrobin 0,8 àg/ml và imidacloprid 0,2 àg/ml được pha chế bằng cách lấy 10 ml dung dịch 2 cho vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm acetonitril đến vạch Dung dịch này cần được bảo quản trong tủ lạnh để đảm bảo tính ổn định.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, Nhật và đầu dò UV-Vis
Cột C18 RP ( 250 mm x 4,6 mm; 5 àm) và tiền cột tương ứng
Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 1800
Máy lắc siêu âm Elma S 100 H – Đức
Cân phân tích với độ chính xác 0,1 – 0,0001 g
Bếp đun cách thủy Memmert – Đức
Bình định mức, pipet thủy tinh và các dụng cụ cần thiết khác
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tùy thuộc vào tính chất của dược liệu và thuốc bảo vệ thực vật, cần áp dụng phương pháp xử lý mẫu phù hợp để đảm bảo tính chính xác trong nghiên cứu.
Để làm giàu đối tượng phân tích trong mẫu dược liệu khô, cần áp dụng phương pháp xử lý phù hợp do mẫu có pH đa dạng và chứa nhiều chất diệp lục Giai đoạn làm sạch mẫu đóng vai trò quan trọng, giúp tăng khả năng phát hiện và giảm ảnh hưởng của nền mẫu.
Phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong các mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng về thành phần của các loại dược liệu khác nhau.
Mục tiêu của quá trình xử lý mẫu không chỉ là chiết xuất tối đa thuốc bảo vệ thực vật mà còn phải giảm thiểu tạp chất Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được áp dụng, bao gồm chiết bằng dung môi, chiết siêu tới hạn, chiết pha lỏng dưới áp suất, chiết vi sóng, chiết pha rắn, chiết phân tán pha rắn, vi chiết pha rắn và phương pháp QuEChERS.
3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ, rửa sạch để khô (đối với mẫu tươi)
Qui trình chiết mẫu HCBVTV trên nền mẫu dược liệu tươi:
Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dược liệu tươi
Để chiết mẫu HCBVTV từ dược liệu khô, theo nghiên cứu của Anastassiades, độ ẩm tối ưu của dược liệu là khoảng 80% để đạt hiệu suất cao nhất Do đó, trước khi tiến hành chiết, cần bổ sung nước để làm ẩm bột dược liệu Mỗi lần chiết nên sử dụng khoảng 3 g dược liệu khô và thêm nước để đảm bảo độ ẩm cần thiết.
Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn
+ 20 ml dung môi chiết/ 3 lần
Lắc với khoảng 10 ml H 2 O (lớp dưới)
Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dưới)
Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 àm
+ Hòa cắn với 10 ml ACN
Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút
Hình 3.2 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu khô
3.2.3 Khảo sát dung môi chiết:
Trong kỹ thuật chiết bằng dung môi, độ phân cực của dung môi cần phải phù hợp với chất phân tích để đạt hiệu quả cao Acetonitril là dung môi phổ biến nhất được sử dụng trong quá trình này Ngoài acetonitril, còn nhiều loại dung môi khác như n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether, methanol, dicloromethan và aceton cũng được áp dụng để chiết xuất thuốc bảo vệ thực vật từ dược liệu.
3 g mẫu/bình nón 100 ml (Làm ẩm vừa đủ)
Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn
+ 20 ml dung môi chiết/ 3 lần
Lắc với khoảng 10 ml H 2 O (lớp dưới)
Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dưới)
Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 àm
+ Hòa cắn với 10 ml ACN
Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút
Để chọn dung môi chiết thích hợp, cần dựa vào độ tan của hai hoạt chất trong dung môi Tiến hành chiết trên mẫu thử bổ sung chuẩn nhằm tối đa hóa việc chiết xuất hai hoạt chất và giảm thiểu tạp chất Đánh giá sơ bộ hiệu quả chiết xuất có thể thực hiện thông qua quan sát trên sắc ký lớp mỏng (SKLM).
Bảng 3.1 Độ tan của hai hoạt chất trong nước và dung môi hữu cơ (Ursula Banasiak,
2011) Độ tan ở 20 o C Imidacloprid (g/L) Azoxystrobin (g/L) n-hexan < 0,1 0,057
3.2.4 Khảo sát phương pháp làm sạch mẫu thử
Chấm dịch chiết mẫu thử lên SKLM giúp quan sát imidacloprid, azoxystrobin và các chất khác trong nền mẫu Đối với mẫu dược liệu tươi hoặc các bộ phận trên mặt đất, cần áp dụng phương pháp xử lý phù hợp do pH đa dạng và sự hiện diện của nhiều chất như diệp lục, nhựa, và chất béo Giai đoạn làm sạch mẫu đóng vai trò quan trọng, tăng khả năng phát hiện và giảm ảnh hưởng của nền mẫu.
3.2.4.1 Loại tạp bằng SPE (chiết pha rắn)
Chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) là phương pháp chiết xuất dựa trên sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn Trong quy trình này, các chất phân tích từ pha lỏng được giữ lại trên pha rắn, thường là các hạt nhỏ, xốp trong ống nhỏ Khi pha lỏng chảy qua ống, các chất tương tác với pha rắn sẽ bị giữ lại, và sau đó được rửa giải bằng một dung môi phù hợp, thường có thể tích nhỏ hơn nhiều so với dịch ban đầu Nhờ vào SPE, không chỉ có tác dụng làm sạch mà còn có thể thực hiện bước làm giàu mẫu hiệu quả.
Kỹ thuật tinh chế dịch chiết lỏng – lỏng đã được sử dụng từ lâu và hiện nay không chỉ là một phương pháp tách chiết độc lập mà còn được tích hợp vào hệ thống GC hoặc HPLC.
Kỹ thuật này có nguyên tắc cơ bản giống như sắc ký cột Thường được áp dụng để đạt mục đích khác nhau:
- Để xác định mức độ phân cực của hợp chất chƣa biết
- Để làm đậm đặc một hợp chất đang ở trong một dung dịch rất loãng với thể tích lớn
- Để phân chia cao thô ban đầu thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau
Để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên từ cao thô ban đầu hoặc trong giai đoạn tinh chế, kỹ thuật chiết xuất pha rắn (SPE) mang lại nhiều ưu điểm Kỹ thuật này giúp tăng cường độ tinh khiết của hợp chất, giảm thiểu tạp chất và cải thiện hiệu suất thu hồi, từ đó hỗ trợ quá trình nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên.
- Đơn giản, nhanh, không tạo nhũ, tiết kiệm dung môi
- Khả năng tinh chế cao, không hƣ hay mất mẫu thích hợp với GC, HPLC đặc biệt với các mẫu phân cực
- Kết quả lặp lại, tỷ lệ hồi phục cao
- Tin cậy, không nhiễm vì không sử dụng lại
- Có thể làm hàng loạt, có thể tự động hóa
Kỹ thuật này ngày càng phổ biến nhờ khả năng làm sạch và làm giàu mẫu hiệu quả Tuy nhiên, việc phân tích đa dạng lượng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) vẫn gặp một số hạn chế, do mỗi loại kỹ thuật chỉ phù hợp với các hoạt chất nhất định, gây khó khăn trong việc phân tích đồng thời nhiều loại thuốc BVTV thuộc các nhóm khác nhau.
3.2.4.2 Loại tạp bằng sắc ký cột cổ điển
Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lƣợng lớn từ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần
Tách sản phẩm bằng sắc ký cột silicagel với kích thước hạt 40-60 micromet, sử dụng hệ dung môi cloroform – methanol (97:3) Xác định phân đoạn chứa hai chất phân tích thông qua HPLC và so sánh với hỗn hợp chuẩn, đồng thời loại bỏ các phân đoạn không mong muốn Tiến hành tập trung các phân đoạn chứa sản phẩm, sau đó cô thu hồi dung môi để thu được mẫu phân tích Cuối cùng, hòa mẫu vào dung môi thích hợp để thực hiện phân tích.
3.2.4.3 Loại tạp bằng than hoạt tính
Để tẩy màu dung dịch chiết, có thể cho dung dịch chảy qua một cột ngắn chứa than hoạt tính hoặc sử dụng becher chứa dung dịch chiết và thêm than hoạt tính vào Sau đó, để yên và lọc bỏ bột than.
Than hoạt tính có khả năng hấp phụ hiệu quả các chất màu trong thực vật như chlorophyll a và b, caroten, xantophyl Tuy nhiên, nhược điểm của nó là có thể hấp thu cả những hợp chất cần khảo sát, chẳng hạn như alcaloid như morphin, strychnin và quinin.
3.2.5 Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
Việc thẩm định quy trình định lượng cần tuân thủ các tiêu chí quan trọng như tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng Những tiêu chí này được hướng dẫn theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc và Quyết định số 07/QĐ-QLD của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế, ban hành ngày 11 tháng.
3.3.1 Tính phù hợp hệ thống
Tính phù hợp hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp Được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp
Pha dung dịch hai chuẩn với nồng độ azoxystrobin là 0,8 àg/ml và nồng độ imidacloprid là 0,2 àg/ml Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần
Tính phù hợp của hệ thống được xác định qua các thông số sắc ký, bao gồm diện tích pic (S), thời gian lưu (t R), độ phân giải (R S) và hệ số đối xứng (A S).
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tối đa đƣợc phép cho các lần tiêm lặp lại là 2% Ngoài ra, hệ thống phải đạt các yêu cầu sau:
- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ A S ≤ 1,5)
- Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5)
Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu tự tạo ở mục 3.2.5
- Sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
Sắc ký đồ mẫu tự tạo yêu cầu thời gian lưu của pic phải tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn Nếu có pic tạp xuất hiện trên sắc ký đồ mẫu tự tạo, độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (R S ≥ 1,5) theo quy định của phương pháp sắc ký lỏng trong Dược điển Việt Nam IV.
Chuẩn bị cỏc mẫu thử cú nồng độ azoxystrobin/imidacloprid là 0,32/0,08 àg/ml; 0,64/0,16 àg/ml; 0,8/0,2 àg/ml; 0,96/0,24 àg/ml; 1,28/0,32 àg/ml tương ứng với 40 %,
80 %, 100 %, 120 % và 160 % so với nồng độ sử dụng ở thử tính phù hợp hệ thống, mỗi mẫu tiêm 3 lần, xác định diện tích pic, tính giá trị trung bình Đánh giá:
- Vẽ đường biểu diễn của diện tích pic trung bình theo nồng độ phân tích
- Xác định các hệ số B o (độ dốc), B (tung độ gốc), R 2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy (ŷ = B 0x + B) Thường chấp nhận sự tuyến tính khi 0,995 ≤ R 2 ≤ 1
- Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy
3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
Phương pháp phân tích thuốc BVTV phải đáp ứng yêu cầu để phân tích được ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng MRL (0,01 mg/kg hay 10 àg/kg)
LOD là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng không nhất thiết để có thể định lƣợng đƣợc
LOQ (Limit of Quantification) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử mà có thể được định lượng với độ chính xác và độ đúng thích hợp Thông số này rất quan trọng trong việc định lượng các chất có nồng độ thấp, đặc biệt là trong việc xác định tạp chất và sản phẩm phân hủy.
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) là một chỉ số quan trọng để đánh giá giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trong phân tích Trong công thức này, S đại diện cho chiều cao tín hiệu của chất phân tích, trong khi N là giá trị nhiễu của đường nền.
- LOD đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 3
- LOQ đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 10
3.3.5 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần
- Độ chính xác trung gian
Tiến hành nhƣ độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc và người thực hiện
Để đảm bảo độ chính xác trong phương pháp phân tích, giá trị RSD của hàm lượng hai hoạt chất cần được xác định từ 6 mẫu thử trong một ngày và 6 mẫu thử trong ngày khác phải đạt yêu cầu RSD ≤ 2%.
3.3.6 Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %)
Chuẩn bị 9 mẫu thử chuẩn với 3 mức nồng độ khác nhau: 80%, 100% và 120%, mỗi mức có 3 mẫu Mỗi mẫu sẽ được tiến hành sắc ký một lần để tính diện tích pic Dựa vào phương trình hồi quy, nồng độ tìm thấy sẽ được suy ra và so sánh với nồng độ khi pha để tính tỷ lệ phục hồi.
Ms: nồng độ khi pha (àg/ml)
Mt: nồng độ tỡm thấy (àg/ml) từ phương trỡnh hồi quy của đường tuyến tớnh
- Tỷ lệ phục hồi phải trong khoảng 98 –102%
- RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp