CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
1.1.1 Chế phẩm nghiên cứu: bài thuốc DDHV
Thành phần của bài thuốc DDHV
STT Tên Thuốc Tên khoa học Liều lƣợng
1 Hoài sơn Tuber Dioscoreae persimilis 16g
2 Bạch truật Rhizoma Atractylodis macrocephalae
3 Tam thất Radix Panasis notoginseng 06g
6 Trần bì Pericarpium Citri reticulatae perenne
7 Đẳng sâm Radix Codonopsis pilosulae 10g
8 Mạch nha Fructus Hordei germinates 06g
10 Mộc hương Radix Saussureae lappae 06g
Các dược liệu trong bài thuốc được dùng dưới dạng dược liệu khô và đạt tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam V
Nghiên cứu chiết xuất và bào chế cao đặc DDHV từ các dược liệu khô của bài thuốc DDHV nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng Cao đặc DDHV đạt tiêu chuẩn cơ sở sẽ được sử dụng làm chế phẩm nghiên cứu để đánh giá tác dụng thực nghiệm.
Cao đặc DDHV được pha loãng với nước cất để tạo ra các dung dịch có nồng độ khác nhau, phù hợp với liều lượng sử dụng cho chuột uống, nhằm đánh giá tác dụng trong các thí nghiệm.
Liều dùng dược liệu được tính theo g dược liệu khô/kg/ngày hoặc g cao đặc/kg/ngày, với liều dự kiến cho người là 84g/người/ngày Tính toán cho một người 50kg, liều dùng tương đương là 1,68g/kg/ngày Khi quy đổi sang chuột nhắt với hệ số 12, liều dự kiến là 20,16g/kg/ngày Đối với chuột cống, với hệ số quy đổi là 07, liều tương đương là 11,76g/kg/ngày Từ các mức liều này, ta có thể tính được liều dùng theo g cao đặc/kg/ngày dựa trên tỷ lệ điều chế từ g dược liệu khô.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, Chuột cống trắng chủng Wistar với số lượng được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Số lượng động vật thực nghiệm Động vật n Tiêu chuẩn Nghiên cứu
Chuột nhắt trắng chủng Swiss
40 Mô hình gây đau quặn bằng acid acetic
Wistar 50 khỏe mạnh, trọng lượng 160 - 180g
Mô hình gây viêm loét dạ dày
Chuột khỏe mạnh được đánh giá qua các tiêu chí như lông mượt, mắt trong, hậu môn khô, và hoạt động bình thường Việc lựa chọn chuột nghiên cứu được thực hiện bởi hai kỹ thuật viên có kinh nghiệm, sau đó cán bộ nghiên cứu sẽ kiểm tra và đánh giá lại Động vật thí nghiệm được cung cấp bởi Ban chăn nuôi - Học viện Quân y, được nuôi dưỡng trong phòng thí nghiệm ít nhất một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Chúng được cho ăn theo tiêu chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu và uống nước sạch đã đun sôi Hàng ngày, quá trình thí nghiệm được theo dõi và ghi chép cẩn thận.
Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, 18 - 22g Chuột cố ng trắng, chủ ng Wistar, 160 – 180g
- Dung dịch chuẩn độ NaOH 0,1N
- Các thuốc thử Toper và Phenophtalein
- Thạch nuôi cấy vi khuẩn
- Một số hóa chất khác
2.1.4 Dụng cụ , máy móc, thi ế t b ị
- Cân phân tích 10-4, model CP224S (Sartorius - Đức)
- Kính hiển vi soi nổi Luxeo 2S (Labomed - Mỹ)
- Máy đo đau bản nóng lạnh - Hot Cold Plate (Ugo Basile 35100 - Ý)
Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ bao gồm kim tiêm cho chuột uống thuốc và các dụng cụ thí nghiệm khác Hình ảnh minh họa bao gồm kính hiển vi soi nổi Luxeo 2S và máy đo đau bản nóng lạnh - Hot Cold Plate.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Bào chế cao đặc DDHV và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao đặc DDHV
* Bào chế cao đặc DDHV
- Cân các dược liệu đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm đầu vào theo công thức
- Chiết theo phương pháp sắc với dung môi chiết là nước
- Gộp các dịch chiết, cô dịch chiết thành cao đặc
* Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc
Xây dựng TCCS của cao đặc DDHV trên các chỉ tiêu sau:
- Hình thức: Về màu sắc, mùi vị, độ đồng nhất, độ tan trong nước, cặn bã dược liệu hoặc tạp chất lạ
- Mất khối lượng do làm khô: Không quá 20%
- Định tính: Có phản ứng định tính của hoài sơn, bạch truật, ô tặc cốt và đẳng sâm
- Giới hạn nhiễm khuẩn: Theo yêu cầu của DĐVN V
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày của cao đặc DDHV được thực hiện trên mô hình thực nghiệm gây loét dạ dày bằng Aspirin kết hợp thắt môn vị ở chuột cống trắng Đánh giá hiệu quả bảo vệ niêm mạc dạ dày của cao đặc DDHV được thực hiện theo phương pháp mô tả của Vijayakumar AR và cộng sự (2016), với những điều chỉnh phù hợp với điều kiện nghiên cứu hiện tại.
Chuột cống trắng được đánh số thứ tự và được chia thành 5 lô, mỗi lô 9 con với tỷ lệ đực/cái như nhau ở mỗi lô
Các lô chuột được uống thuốc như sau:
+ Lô 1 (lô chứng): không gây loét dạ dày, uống nước cất
+ Lô 2 (lô mô hình): gây loét dạ dày, uống nước cất
Lô 3, được sử dụng làm lô tham chiếu, gây loét dạ dày và được điều trị bằng omeprazole với liều 20mg/kg/ngày Trong khi đó, lô 4, lô trị 1, cũng gây loét dạ dày nhưng sử dụng dung dịch DDHV với liều 0,84g cao đặc/kg/ngày, dự kiến sẽ có tác dụng điều trị.
+ Lô 5 (lô trị 2): gây loét dạ dày, uống DDHV liều 1,68g cao đặc/kg/ngày (gấp 2 liều 1)
Chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 được gây loét dạ dày bằng cách cho uống Aspirin với liều 200mg/kg hòa tan trong dung dịch sodium carboxymethyl cellulose (CMC 1%) trong 5 ngày liên tiếp Vào ngày thứ 6, tiến hành thắt môn vị chuột trong điều kiện gây mê ngay sau khi uống Aspirin lần cuối Thuốc tham chiếu omeprazole và thuốc nghiên cứu DDHV với hai liều được cho uống hàng ngày 30 phút trước khi chuột uống Aspirin.
Sau 4 giờ kể từ khi thắt môn vị, tất cả chuột được gây mê bằng thiopental Chuột được mổ bụng, bộc lộ dạ dày Cắt mở dạ dày dọc theo bờ cong lớn Dịch chứa bên trong dạ dày được ly tâm, thu lấy phần dịch trong để xác định thể tích và độ acid của dịch vị Bề mặt dạ dày được rửa sạch bằng dung dịch nước muối lạnh, thấm bề mặt vết loét bằng Fomaldehyd 5% để đánh giá mức độ loét
- Các chỉ tiêu đánh giá về chức năng bài tiết dịch vị trong dạ dày
Để đo thể tích dịch vị ở chuột cống trắng, chúng tôi tính toán thể tích dịch vị theo 100g cân nặng Sau đó, trị số trung bình của từng lô chuột được lấy để thực hiện so sánh.
+ pH dịch vị: đo bằng máy đo pH
Để xác định độ acid dịch vị, cần đo lường độ acid tự do và độ acid toàn phần thông qua phương pháp chuẩn độ acid – base với dung dịch NaOH 0,01N Độ acid tự do được xác định khi chuẩn độ NaOH cho đến khi thuốc thử Toper chuyển sang màu cam Sau đó, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi thuốc thử phenolphthalein chuyển màu hồng Tổng lượng NaOH đã sử dụng trong quá trình chuẩn độ sẽ được dùng để tính toán độ acid toàn phần.
- Các chỉ tiêu đánh giá tổn thương loét:
Quan sát bằng kính lúp với độ phóng đại 10 lần là phương pháp quan trọng để đánh giá chỉ số loét dạ dày Theo nghiên cứu của V Prasanth Reddy và cộng sự (2012), hệ thống cho điểm được áp dụng như sau: 0 điểm cho niêm mạc dạ dày bình thường, 0,5 điểm cho niêm mạc dạ dày xung huyết đỏ, 1 điểm cho chấm loét nhỏ dưới 3mm, 1,5 điểm cho vệt xuất huyết, 2 điểm cho vết loét kích thước từ 3 đến 5 mm, và 3 điểm cho vết loét có kích thước lớn hơn 5 mm.
Chỉ số loét được đánh giá theo công thức:
The Ulcer Index (UI) measures the severity of ulcers, while the Average Number of Ulcers per Animal (UN) indicates the mean count of ulcers observed in each animal Additionally, the Average Number of Severity Score (US) reflects the average severity of the lesions, and the Percentage of Animals with Ulcers (UP) represents the proportion of animals affected by ulcers.
+ Phần trăm ức chế loét: được tính theo công thức
Trong đó I (%) là phần trăm ức chế loét; UIc là chỉ số loét ở lô chứng gây loét; UIT là chỉ số loét ở lô ở lô dung thuốc
- Đánh giá tổn thương mô bệnh học
Mẫu mô dạ dày được cố định trong dung dịch formalin đệm trung tính trong 24 giờ, sau đó được đúc khối paraffin và cắt lát dày 5 µm để làm tiêu bản nhuộm HE Việc soi tiêu bản trên kính hiển vi giúp đánh giá các thay đổi mô bệnh học của dạ dày chuột ở các lô khác nhau.
2.2.3 Nghiên cứu tác dụng giảm đau của cao đặ c DDHV theo phương pháp
Tác dụng giảm đau trung ương của cao đặc DDHV được đánh giá trên chuột nhắt trắng theo phương pháp “mâm nóng” (Hotplate), được mô tả bởi Woolfe G và
Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên làm 4 lô, mỗi lô 10 con
+ Lô 1 (lô chứng): uống nước cất, thể tích 10ml/kg
Lô 2 (tham chiếu) sử dụng morphin tiêm dưới da với liều 10 mg/kg, tương đương 0,1ml cho mỗi 10g chuột Trong khi đó, lô 3 (trị 1) áp dụng liệu pháp uống dung dịch hạt vừng với liều 19,44g dược liệu/kg, tương ứng với liều điều trị được tính theo hệ số 12.
+ Lô 4 (trị 2): Uống DDHV liều 38,88g dược liệu/kg (liều gấp 2 lần so với liều tương đương với liều điều trị theo hệ số 12)
Chuột ở lô 1 được uống nước cất, chuột ở lô 3, 4 được uống thuốc nghiên cứu mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 5 ngày liên tục
Nguyên lý của phương pháp nghiên cứu được mô tả như sau:
Chuột được đặt lên mâm nóng ở nhiệt độ 56°C của Máy đo đau bản nóng, lạnh, và sau một thời gian tiếp xúc, chúng sẽ cảm thấy đau ở bàn chân Khi cảm giác đau xuất hiện và được truyền về não, chuột sẽ phản ứng bằng cách đưa chân sau lên liếm để giảm đau Chỉ hành động liếm chân sau mới được tính, trong khi liếm chân trước không được xem là phản ứng đau, vì đó là hành vi bình thường của chuột, được gọi là “hành vi làm duyên”, khi chúng thường xuyên vuốt ve râu, mép và liếm chân trước mà không liên quan đến cảm giác đau.
Thời gian tiềm là khoảng thời gian từ khi chuột được đặt lên bản nóng đến khi chuột đưa chân sau lên liếm Thời gian tiềm kéo dài cho thấy ngưỡng đau của chuột có thể cao hơn hoặc khả năng chịu đau của chúng tốt hơn, dẫn đến phản ứng với cảm giác đau chậm hơn Do đó, các loại thuốc giảm đau có tác dụng làm kéo dài thời gian tiềm này.
Các thuốc giảm đau trung ương, chẳng hạn như Morphine, sẽ cho thấy tác dụng của chúng trong mô hình này, do đó đây là mô hình lý tưởng để sàng lọc các loại thuốc có khả năng giảm đau trung ương.
Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm bằng cách đo thời gian tiềm ở hai thời điểm: trước và sau khi chuột được cho uống thuốc thử trong 5 ngày.
- Trước khi cho chuột uống thuốc: tiến hành đo thời gian tiềm của từng chuột, loại bỏ những chuột phản ứng trước 8 giây và sau 30 giây
Sau 5 ngày cho chuột uống thuốc thử, vào ngày thứ 5, chuột được cho uống thuốc lần cuối 1 giờ trước hoặc tiêm Morphin 30 phút trước khi được đặt lên mâm nóng ổn định ở 56°C của Máy đo đau bản nóng, lạnh Thời gian tiêm của từng chuột trong các lô nghiên cứu sẽ được đo để đánh giá tác dụng giảm đau thông qua chỉ tiêu mức tăng thời gian tiềm Kết quả sẽ được so sánh giữa các lô và tính phần trăm kéo dài thời gian tiềm.
2.2.4 Nghiên cứu tác dụng giảm đau của cao đặ c DDHV theo phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic (phương pháp Koster)
Xử lý số liệu
Các số liệu được phân tích bằng các phương pháp thống kê y sinh học, sử dụng ANOVA test thông qua phần mềm SPSS 16.0 Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày của cao lỏng
3.1.1 Ảnh hưởng của DDHV lên các chỉ tiêu đánh giá về chức năng bài tiết dịch vị.
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1, bảng 3.2, bảng 3.3 và bảng 3.4
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của DDHV lên thể tích dịch vị của chuột nghiên cứu (n = 9)
Lô nghiên cứu Thể tích dịch vị
(ml/100g) P so với (1) P so với
Thuốc tham chiếu (3) 0,488 ± 0,199 > 0,05 < 0,05 - DDHV liều 1 (4) 0,495 ± 0,085 > 0,05 < 0,05 > 0,05 DDHV liều 2 (5) 0,486 ± 0,089 > 0,05 < 0,05 > 0,05
- So với lô chứng, thể tích dịch vị của lô mô hình tăng cao có ý nghĩa thống kê với p < 0,01
So với lô mô hình, thể tích dịch vị của thuốc tham chiếu (omeprazole) và thuốc nghiên cứu (DDHV) đều giảm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Cả hai loại thuốc này đều cho thấy tác dụng rõ rệt trong việc giảm thể tích dịch vị ở các mức liều đã sử dụng.
So với lô thuốc tham chiếu omeprazole liều 100mg/kg/ngày, thể tích dịch vị ở nhóm dùng DDHV mức liều 1 và 2 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tuy nhiên, DDHV ở cả hai mức liều này đều có tác dụng làm giảm thể tích dịch vị tương đương với lô thuốc tham chiếu.
So sánh hai lô sử dụng DDHV cho thấy lô với mức liều cao có thể tích dịch vị ít hơn lô dùng mức liều thấp Điều này chứng tỏ rằng DDHV có xu hướng đáp ứng theo liều, mặc dù sự khác biệt giữa hai lô chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của DDHV lên pH dịch vị của chuột nghiên cứu (n = 9)
Lô nghiên cứu pH dịch vị P so với (1) P so với
Thuốc tham chiếu (3) 3,44 ± 0,42 > 0,05 < 0,01 - DDHV liều 1 (4) 3,31 ± 0,63 > 0,05 < 0,05 > 0,05 DDHV liều 2 (5) 3,41 ± 0,52 > 0,05 < 0,05 > 0,05
- So với lô chứng, pH dịch vị của lô mô hình thấp hơn có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
Nghiên cứu cho thấy pH dịch vị của thuốc tham chiếu (omeprazole) và thuốc nghiên cứu (DDHV) đều tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,01 và p < 0,05) so với lô mô hình Cả hai loại thuốc đều có tác dụng làm tăng pH dạ dày ở chuột gây loét, cho thấy hiệu quả tích cực trong việc cải thiện tình trạng này.
So với lô thuốc tham chiếu, pH dịch vị ở các lô dùng DDHV không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cả hai mức liều DDHV đều làm tăng pH dịch vị tương đương với thuốc tham chiếu omeprazole ở liều 100mg/kg/ngày.
So sánh giữa hai lô sử dụng DDHV cho thấy, ở lô có mức liều cao, pH dịch vị cao hơn so với lô dùng mức liều thấp Điều này chứng tỏ DDHV có xu hướng đáp ứng theo liều, mặc dù sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của DDHV lên độ acid tự do của dịch vị (n = 9)
Lô nghiên cứu Độ acid tự do
(Meq/l/100g) P so với (1) P so với
Thuốc tham chiếu (3) 10,42 ± 1,01 > 0,05 < 0,01 - DDHV liều 1 (4) 11,12 ± 1,32 > 0,05 < 0,01 > 0,05 DDHV liều 2 (5) 10,55 ± 1,35 > 0,05 < 0,01 > 0,05
- So với lô chứng, độ acid tự do của dịch vị ở lô mô hình cao hơn có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
So với lô mô hình, cả thuốc tham chiếu (omeprazole) và thuốc nghiên cứu (DDHV) đều cho thấy sự giảm đáng kể về độ acid tự do của dịch vị (p < 0,01) Các mức liều của cả hai loại thuốc đều có hiệu quả trong việc giảm acid tự do của dịch vị trên chuột gây loét.
So với lô thuốc tham chiếu, độ acid tự do của dịch vị ở các lô dùng DDHV không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cả hai mức liều DDHV đều cho thấy tác dụng giảm acid tự do của dịch vị tương đương với thuốc tham chiếu omeprazole liều 100mg/kg/ngày.
Khi so sánh hai lô sử dụng DDHV, lô có mức liều cao cho thấy nồng độ acid tự do trong dịch vị thấp hơn lô dùng mức liều thấp Điều này chứng tỏ rằng DDHV có xu hướng đáp ứng theo liều, mặc dù sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của DDHV lên độ acid toàn phần của dịch vị (n = 9)
Lô nghiên cứu Độ acid toàn phần
Thuốc tham chiếu (3) 22,34 ± 2,36 > 0,05 < 0,01 - DDHV liều 1 (4) 23,08 ± 2,11 > 0,05 < 0,05 > 0,05 DDHV liều 2 (5) 22,68 ± 2,12 > 0,05 < 0,01 > 0,05
- So với lô chứng, độ acid toàn phần của dịch vị ở lô chứng gây loét cao hơn có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
So với lô chứng gây loét, độ acid toàn phần của dịch vị ở cả hai nhóm thuốc tham chiếu (omeprazole) và thuốc nghiên cứu (DDHV) đều giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0.05).
< 0,01 và p < 0,05) Thuốc tham chiếu và thuốc nghiên cứu ở các mức liều đã dùng đều có tác dụng làm giảm acid toàn phần của dịch vị trên chuột gây loét
So với lô thuốc tham chiếu, độ acid toàn phần của dịch vị ở các lô dùng DDHV không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cả hai mức liều DDHV đều cho thấy tác dụng giảm acid toàn phần của dịch vị tương đương với thuốc tham chiếu omeprazole liều 100mg/kg/ngày.
Trong một nghiên cứu so sánh giữa hai lô sử dụng DDHV, kết quả cho thấy ở lô có mức liều cao, độ acid toàn phần của dịch vị thấp hơn so với lô dùng mức liều thấp Điều này chứng tỏ DDHV có xu hướng đáp ứng theo liều lượng Tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.1.2 Ảnh hưởng của DDHV lên các chỉ tiêu đánh giá tổn thương loét
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của DDHV lên các chỉ tiêu đánh giá tổn thương loét (n = 9)
Lô nghiên cứu Chỉ số loét Phần trăm ức chế loét
Số chuột không phát hiện loét/tổng số chuột
Lô chứng Không có vết loét - 9/9
* pso với mô hình < 0,05; ** pso với mô hình < 0,01
Kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy
- Lô 1 (lô chứng): tất cả các chuột đều không quan sát thấy ổ loét, dạ dày hoàn toàn bình thường
- Lô 2 (lô mô hình): quan sát thấy các ổ loét dạ dày ở toàn bộ chuột Chỉ số loét đánh giá theo V Prasanth Reddy là 18,00 ± 3,47
Trong nghiên cứu, chuột được cho uống omeprazole với liều 20mg/kg/ngày, kết quả cho thấy loét xuất hiện ở 6 trên 9 chuột So với lô mô hình, chỉ số loét giảm có ý nghĩa thống kê với p < 0,01, cho thấy hiệu quả rõ rệt của omeprazole trong việc ức chế loét, đạt tỷ lệ 33,64%.
Trong thí nghiệm với lô 4 (DDHV liều 1), chuột được cho uống DDHV với liều 0,84g cao đặc/kg/ngày Kết quả cho thấy loét xuất hiện ở 7/9 chuột, với chỉ số loét giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05) Tỷ lệ ức chế loét đạt 25,62%.
Trong nghiên cứu trên lô 5 (DDHV liều 2), chuột được cho uống DDHV với liều lượng 1,68 g cao đặc/kg/ngày, kết quả cho thấy loét xuất hiện ở 6/9 chuột Chỉ số loét giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình với p < 0,01, cho thấy phần trăm ức chế loét đạt 36,11%.
3.1.3 Kết quả đại thể và mô bệnh học d ạ dày của chuột thí nghiệm
* Hình ảnh đạ i th ể d ạ dày c ủ a chu ột đạ i di ệ n cho các lô nghiên c ứ u Ảnh 3.1 Dạ dày chuột lô chứng
(chuột số 04) Ảnh 3.2 Dạ dày chuột lô mô hình
Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của DDHV theo phương pháp “mâm nóng” (Hotplate)
Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của DDHV theo phương pháp “mâm nóng” (Hotplate) trên chuột nhắt trắng được trình bày ở bảng 6
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của DDHV tới thời gian tiềm của chuột nhắt trắng (n = 10)
Thời gian tiềm (giây) p so sánh trước sau
Mean ± SD % tăng so với (1)
Morphin (2) 13,89 ± 2,29 35,86 ± 11,22 157,06 % < 0,001 DDHV liều 1 (3) 13,46 ± 1,58 16,85 ± 2,82 20,79 % < 0,05 DDHV liều 2 (4) 14,15 ± 2,72 19,38 ± 5,86 38,92% < 0,05 pso sánh giữa các lô p > 0,05 p 3,4 -1 < 0,05; p 2-1 < 0,001 p 3,4-2 < 0,001; p 3-4 > 0,05 -
- Trước khi uống thuốc NC: thời gian tiềm của chuột ở các lô nghiên cứu không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
- Sau uống thuốc nghiên cứu:
+ So sánh giữa các lô với nhau:
Thời gian tiềm của chuột ở các lô sử dụng DDHV với hai mức liều 1,44g và 2,88g cao đặc/kg/ngày dài hơn đáng kể so với lô chứng sinh lý, với p < 0,05 Điều này cho thấy cao đặc DDHV có tác dụng giảm đau hiệu quả khi thử nghiệm bằng phương pháp “mâm nóng” (Hotplate).
Thời gian tác dụng của morphin trên chuột kéo dài hơn so với các lô dung cao đặc DDHV Đặc biệt, hiệu quả giảm đau của cao đặc DDHV khi dùng đường uống kém hơn so với morphin tiêm dưới da với liều 10 mg/kg (p 3,4-2 < 0,001).
Giá trị trung bình thời gian tiềm ở lô chuột sử dụng DDHV liều cao dài hơn so với lô chuột sử dụng DDHV liều thấp, cho thấy tác dụng giảm đau của phương pháp mâm nóng theo DDHV có xu hướng phụ thuộc vào liều lượng, mặc dù sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p3-4 > 0,05).
Kết quả so sánh thời gian đáp ứng đau của chuột ở các lô sử dụng DDHV cho thấy sự gia tăng đáng kể tại thời điểm sau khi uống thuốc so với trước khi uống, với giá trị p < 0,05 Điều này khẳng định tác dụng giảm đau hiệu quả của DDHV khi áp dụng phương pháp thử nghiệm tự chứng.
“mâm nóng” (Hotplate) Ảnh 3.11 Chuột nhắt trắng trong thử nghiệm tác dụng giảm đau của DDHV theo phương pháp “mâm nóng”
(Hotplate) Chuột được đặt lên máy đo đau bản nóng-lạnh, nhiệt độ bề mặt đặt chuột được tự động duy trì ở nhiệt độ
Nhiệt độ là 56 0 C (±1 0 C) Hình ảnh 3.12 cho thấy chuột đưa chân sau lên liếm Thời gian từ khi đặt chuột lên bề mặt nóng cho đến khi chuột liếm chân sau được gọi là thời gian tiềm Thuốc được nghiên cứu có tác dụng giảm đau theo phương pháp này.
“mâm nóng” sẽ làm kéo dài tiềm của chuột.
Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của DDHV theo phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic (phương pháp Koster)
Tiêm acid acetic vào phúc mạc ổ bụng chuột gây ra viêm đau, dẫn đến cơn đau quặn khi kích thích vượt ngưỡng đau Biểu hiện của cơn đau quặn bao gồm uốn oằn thân, thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, và duỗi dài thân cùng chân sau Sử dụng thuốc giảm đau có tác dụng tăng ngưỡng đau, làm thời gian xuất hiện cơn đau quặn muộn hơn và giảm số lượng cơn đau quặn xảy ra.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của DDHV đến thời gian xuất hiện đau quặn của chuột nhắt trắng được trình bày trong bảng 3.7 Ảnh 3.13 cho thấy chuột nhắt trắng ở trạng thái bình thường, không có dấu hiệu đau quặn, trong khi Ảnh 3.14 minh họa các biểu hiện của cơn đau quặn, bao gồm uốn oằn thân, thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, và duỗi dài thân cùng chân sau.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của DDHV tới thời gian xuất hiện đau quặn của chuột nhắt trắng (n = 10)
Thời gian xuất hiện đau sớm nhất (giây)
Thời gian xuất hiện đau trễ nhất (giây)
Trung bình thời gian xuất hiện đau (giây)
Kết quả bảng 3.7 cho thấy:
Thời gian xuất hiện cơn đau quặn sớm nhất và muộn nhất ở các lô sử dụng thuốc đều dài hơn so với lô chứng sinh lý.
- So với lô chứng, các lô dùng DDHV và lô dùng thuốc tham chiếu Diclofenac có thời gian xuất hiện đau lớn hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
Như vậy, cao đặc DDHV và thuốc tham chiếu Diclofenac đều thể hiện tác dụng làm thời gian xuất hiện đau quặn muộn hơn so với lô chứng
So với lô tham chiếu sử dụng Diclofenac, các lô sử dụng DDHV cho thấy thời gian xuất hiện đau sau khi tiêm acid acetic tương đương, không có sự khác biệt thống kê có ý nghĩa (p > 0,05) Ở các mức liều nghiên cứu, cao đặc DDHV có tác dụng giảm đau tương đương với Diclofenac ở liều 20mg/kg cân nặng.
Kết quả đánh giá tác động của cao đặc DDHV đến số lượng cơn đau quặn của chuột nhắt trắng được ghi nhận trong các khoảng thời gian 5 phút sau khi tiêm acid acetic, được trình bày chi tiết trong các bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12.
Bảng 3.8 trình bày ảnh hưởng của cao đặc DDHV đến số cơn đau quặn của chuột nhắt trắng trong 5 phút đầu tiên sau khi tiêm acid acetic (n = 10).
Lô nghiên cứu Số chuột không có cơn đau quặn
Số chuột có cơn đau quặn
Trung bình số cơn đau quặn
Sau khi tiêm acid acetic, cần một khoảng thời gian để kích thích gây viêm đau vượt ngưỡng đau của chuột, dẫn đến sự xuất hiện cơn đau Trong 5 phút đầu tiên, nhiều chuột chưa cảm thấy đau, với lô chứng có 3 chuột không có cơn đau, trong khi các lô dùng thuốc có số chuột không đau nhiều hơn (6, 7 chuột) Một số chuột bắt đầu cảm thấy đau với số cơn đau từ 1 đến 2, trong khi một số khác có thể lên đến 6, 7 cơn đau trong lô chứng Sự biến động lớn trong số cơn đau trong khoảng thời gian này dẫn đến độ lệch chuẩn cao ở các lô Mặc dù trung bình số cơn đau ở lô chứng cao hơn rõ rệt so với các lô dùng thuốc, nhưng so sánh thống kê không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05).
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của DDHV tới số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 5 đến 10 phút sau khi tiêm acid acetic (n = 10)
Lô nghiên cứu Số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 5 đến 10 phút
Tỷ lệ (%) giảm số cơn đau quặn so với lô chứng sinh lý
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy:
So với lô chứng, các lô sử dụng DDHV (cả hai mức liều) và lô dùng thuốc tham chiếu diclofenac liều 20 mg/kg/ngày có số cơn đau quặn trong khoảng 5 đến 10 phút sau tiêm acid acetic thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Trong khoảng thời gian 5 phút, tỷ lệ phần trăm giảm số cơn đau quặn ở lô dùng diclofenac liều 20 mg/kg/ngày là 30,51%, trong khi các lô dùng DDHV với liều 1,44g cao đặc/kg/ngày và 2,88g cao đặc/kg/ngày có tỷ lệ giảm lần lượt là 25,42% và 27,97%.
So với nhóm tham chiếu sử dụng diclofenac liều 20 mg/kg/ngày, số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 5 đến 10 phút sau khi tiêm acid acetic ở các nhóm dùng DDHV với hai mức liều (1,44g cao đặc/kg/ngày và 2,88g cao đặc/kg/ngày) không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
So với lô dùng DDHV liều thấp, lô sử dụng DDHV liều cao cho thấy số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 5 đến 10 phút sau khi tiêm acid acetic ít hơn; tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của DDHV tới số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ
10 đến 15 phút sau khi tiêm acid acetic (n = 10)
Lô nghiên cứu Số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 10 đến 15 phút
Tỷ lệ (%) giảm số cơn đau quặn so với lô chứng sinh lý
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy:
So với lô chứng, lô sử dụng DDHV (cả hai mức liều) và lô dùng thuốc tham chiếu diclofenac với liều 20 mg/kg/ngày cho thấy số cơn đau quặn giảm rõ rệt trong khoảng thời gian nghiên cứu.
Sau 10 đến 15 phút tiêm acid acetic, kết quả cho thấy có sự khác biệt thống kê đáng kể (p < 0,01) Trong khoảng thời gian 5 phút, tỷ lệ phần trăm giảm số cơn đau quặn ở nhóm dùng diclofenac liều 20 mg/kg/ngày đạt 38,71%, trong khi các nhóm dùng DDHV với hai mức liều 1,44g cao đặc/kg/ngày và 2,88g cao đặc/kg/ngày lần lượt là 30,65% và 32,26%.
So với lô tham chiếu sử dụng diclofenac liều 20 mg/kg/ngày, số cơn đau quặn trong khoảng thời gian 10 đến 15 phút sau khi tiêm acid acetic ở các lô dùng DDHV với hai mức liều 1,44g cao đặc/kg/ngày và 2,88g cao đặc/kg/ngày không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p 3,4-2 > 0,05).
So với nhóm sử dụng DDHV liều thấp, nhóm sử dụng DDHV liều cao cho thấy số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 10 đến 15 phút sau khi tiêm acid acetic ít hơn, tuy nhiên sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của DDHV tới số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ
15 đến 20 phút sau khi tiêm acid acetic (n = 10)
Lô nghiên cứu Số cơn đau quặn trong khoảng thời gian từ 15 đến 20 phút
Tỷ lệ (%) giảm số cơn đau quặn so với lô chứng sinh lý
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy:
So với lô chứng, lô sử dụng DDHV ở cả hai mức liều và lô dùng thuốc tham chiếu diclofenac với liều 20 mg/kg/ngày cho thấy sự khác biệt rõ rệt về số cơn đau quặn trong khoảng thời gian nghiên cứu.
Mô hình loét dạ dày bằng Asprine kết hợp thắt môn vị
Hiện nay, nhiều mô hình thực nghiệm gây loét dạ dày - tá tràng trên động vật, trong đó mô hình gây loét bằng thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) trên chuột cống trắng được sử dụng phổ biến để đánh giá tác dụng của các thuốc chống loét Các thuốc như indomethacin và aspirin ức chế enzyme cyclooxygenase, dẫn đến giảm tổng hợp prostaglandin, làm giảm bài tiết chất nhầy và bicarbonate, từ đó tạo điều kiện cho HCl và pepsin tấn công niêm mạc, gây loét Các thuốc có tác dụng giảm tiết dịch vị và tăng khả năng tái sinh niêm mạc sẽ có hiệu quả tốt trong mô hình này Mô hình thắt môn vị giúp đánh giá tác dụng trên dịch vị dạ dày, khi dịch bị ứ trệ sẽ kích thích viêm loét Sự kết hợp của mô hình NSAIDs và thắt môn vị cho phép tạo ra tổn thương rõ ràng hơn và lượng dịch vị nhiều hơn, từ đó dễ dàng đánh giá tác dụng của các bài thuốc y học cổ truyền có nhiều vị thuốc phối hợp, vừa làm liền tổn thương loét, vừa giảm tiết và trung hòa acid dạ dày.
Thuốc đối chứng omeprazol
Acid HCl được tiết ra bởi tế bào viền thông qua quá trình bài tiết H+ và Cl- H+ được vận chuyển tích cực từ tế bào viền vào dịch vị, trong khi K+ từ dịch vị được trao đổi vào tế bào viền nhờ tác dụng của enzym.
H + -K + -ATPase, hay còn gọi là bơm proton, là enzym quan trọng trong việc điều trị loét dạ dày Các thuốc ức chế enzym này, được biết đến là thuốc ức chế bơm proton như Omeprazol, Lansoprazol, Pantoprazol, Rabeprazol và Esomeprazol, giúp giảm bài tiết acid HCl từ tế bào viền Những thuốc này hoạt động bằng cách chuyển đổi thành các chất có hoạt tính trong môi trường pH acid của dạ dày, gắn vào bơm proton và ức chế một cách đặc hiệu và không hồi phục Nhờ đó, chúng làm giảm bài tiết axit dạ dày do bất kỳ nguyên nhân nào, vì chúng tác động ở giai đoạn cuối cùng của quá trình bài tiết acid.
Tác dụng của cao đặc DDHV
Độ pH là chỉ số đo hoạt động của các ion hydro (H+) trong dung dịch, phản ánh tính axít hoặc bazơ của nó Một dung dịch trung hòa có pH bằng 7, trong khi các dung dịch có pH nhỏ hơn 7 được xem là có tính axít Đặc biệt, acid càng mạnh thì pH càng thấp; ví dụ, pH trong dịch dạ dày dao động từ 2 đến 2,5.
Nghiên cứu cho thấy, việc điều trị bằng omeprazol và DDHV cho các lô gây loét đã đạt được độ pH tương đương với lô chứng không gây loét, cao hơn so với lô gây loét không điều trị (p 0,05).
Khi so sánh độ pH của lô trị 1 và 2 được điều trị bằng DDHV với liều 0,84g cao đặc/kg/ngày và 1,68g cao đặc/kg/ngày, chúng tôi nhận thấy kết quả tương đương nhau và không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Do đó, liều thông thường vẫn có thể được sử dụng hiệu quả mà không cần tăng liều điều trị.
HCl dịch vị không phải là enzym tiêu hóa nhưng có vai trò quan trọng trong việc kích hoạt pepsin và tạo môi trường pH thích hợp cho hoạt động của pepsin Nó giúp phá vỡ mô liên kết xung quanh các khối cơ, cho phép pepsin phân giải protid hiệu quả Sự kết hợp giữa HCl và pepsin tạo ra tác dụng tiêu hóa protid mạnh mẽ, đồng thời HCl còn có tác dụng sát khuẩn, tiêu diệt vi khuẩn từ thức ăn, ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiêu hóa, thủy phân cellulose và hỗ trợ cơ chế đóng mở tâm vị và môn vị.
Acid HCl có thể gây hại cho niêm mạc dạ dày khi bài tiết tăng hoặc sức đề kháng giảm, dẫn đến loét dạ dày Nghiên cứu cho thấy sau 15 ngày điều trị, độ acid tự do ở các nhóm chứng tham chiếu và nhóm điều trị 1, 2 đã giảm gần về mức bình thường, không khác biệt so với nhóm chứng sinh lý (p > 0,05) và thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng gây loét (p < 0,01) Điều này chứng tỏ cao đặc DDHV có tác dụng giảm acid tự do dạ dày tương đương với omeprazol (p > 0,05).
- Ảnh hưởng đế n th ể tích d ị ch v ị d ạ dày
Thể tích dịch vị cao có thể dẫn đến tổn thương niêm mạc dạ dày, gây ra loét Ngoài ra, sự gia tăng này còn gây ợ chua, gây khó chịu cho bệnh nhân và có khả năng dẫn đến viêm loét thực quản.
Nghiên cứu cho thấy thể tích dịch vị ở lô chứng gây loét cao hơn so với lô chứng sinh lý, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Điều này chứng tỏ rằng mô hình gây loét đã làm tăng thể tích dịch vị.
Thể tích dịch vị ở các lô sử dụng cao đặc DDHV giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng gây loét (p < 0,05) Mặc dù sự khác biệt giữa thể tích dịch vị của các lô dùng cao đặc DDHV và lô chứng tham chiếu không đạt ý nghĩa (p > 0,05), nhưng kết quả cho thấy cao đặc DDHV có tác dụng giảm thể tích dịch vị tương đương với thuốc đối chứng omeprazol.
Nghiên cứu cho thấy cao đặc DDHV có khả năng giảm thể tích dịch vị, tăng độ pH và giảm acid tự do trong mô hình loét dạ dày Tuy nhiên, việc xác định thành phần cụ thể và cơ chế tác dụng của bài thuốc là một thách thức Chúng tôi tin rằng tác dụng này có thể do sự hiện diện của các vị thuốc như cam thảo và mai mực, vốn nổi tiếng với khả năng trung hòa acid dạ dày, cũng như các vị thuốc khác như mạch nha có tác dụng ức chế tiết acid Những vị thuốc này thường được áp dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến dạ dày và tá tràng.
- Ảnh hưởng đế n t ổn thương loét
Nghiên cứu cho thấy 100% chuột ở lô chứng gây loét đều có ổ loét, xác nhận mô hình gây loét đạt yêu cầu nghiên cứu Trong lô tham chiếu, có 6/9 chuột bị loét, với chỉ số loét giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01), phần trăm ức chế loét đạt 33,64% Khi chuột được cho uống cao đặc DDHV liều 0,84 g/kg/ngày, loét xuất hiện ở 7/9 chuột; chỉ số loét giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05), với phần trăm ức chế loét là 25,62% Ở liều 1,68 g/kg/ngày, loét xuất hiện ở 6/9 chuột, chỉ số loét cũng giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) và phần trăm ức chế loét đạt 36,11% Tuy nhiên, chỉ số loét giữa hai lô uống DDHV không khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng tham chiếu, chứng minh rằng cao đặc DDHV có tác dụng làm nhỏ hoặc mất tổn thương loét trên chuột thực nghiệm.
Cao đặc DDHV có tác dụng chống loét nhờ vào khả năng ức chế tiết dịch vị và giảm acid tự do, cùng với các vị thuốc như hoài sơn, phục linh và mộc hương, giúp giảm hoạt tính pepsin tác động lên niêm mạc dạ dày và ổ loét Ngoài ra, bài thuốc còn chứa nhiều vị thuốc như hoài sơn, cam thảo và ô tặc cốt, có tác dụng băng phủ và bảo vệ niêm mạc dạ dày, cùng với các vị thuốc kháng loét như hoài sơn, ô tặc cốt và mạch nha.
Chế phẩm cao đặc DDHV có tác dụng trung hòa acid dạ dày, ức chế bài tiết dịch vị, từ đó giảm độ acid tự do và tăng pH dịch vị Ngoài ra, sản phẩm còn làm giảm hoạt độ pepsin, băng phủ niêm mạc dạ dày, chống loét và kích ứng, đồng thời cải thiện vi tuần hoàn, nhanh chóng phục hồi tổn thương, góp phần điều trị viêm loét dạ dày hiệu quả.
Xây dựng bài thuốc dựa trên biện chứng luận trị theo y lý YHCT và nghiên cứu theo mô hình YHHĐ để đánh giá hiệu quả đang là xu hướng nghiên cứu hiện nay trong lĩnh vực thuốc YHCT Nghiên cứu này hy vọng sẽ đóng góp vào quá trình hiện đại hóa thuốc YHCT và bổ sung thêm một lựa chọn điều trị cho bệnh lý dạ dày.
Về tác dụng giảm đau của cao đặc DDHV
Tác dụng giảm đau của cao đặc DDHV được đánh giá trên mô hình gây đau quặn
Mô hình Writhing Tests và Phiến nóng (Hot plate test) là hai phương pháp quan trọng trong nghiên cứu dược lý để đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc Trong đó, Writhing Tests được sử dụng để đo lường hiệu quả giảm đau ngoại vi, đặc biệt là đối với đau do viêm, trong khi Hot plate test giúp xác định tác dụng giảm đau có nguồn gốc trung ương Cao đặc DDHV cho thấy khả năng giảm đau cả ở mức ngoại vi và trung ương, có thể nhờ vào cơ chế ức chế prostaglandin và các chất trung gian hóa học như histamin, bradykinin, đồng thời có tác dụng chống viêm giúp giảm phù nề và chèn ép Nhờ đó, cao đặc DDHV không chỉ giảm đau mà còn làm giảm kích thích tại các ngọn dây cảm giác, đồng thời ức chế các trung tâm nhận cảm đau.
Về tác dụng ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori của DDHV
Trong điều trị viêm loét dạ dày hành tá tràng, việc ức chế vi khuẩn HP là rất quan trọng, vì đây là nguyên nhân phổ biến gây bệnh Các loại thuốc giảm tiết dịch vị và trung hòa acid không chỉ làm giảm acid dịch vị mà còn ức chế sự phát triển của vi khuẩn HP Hiệu quả này được tăng cường khi thuốc có tác dụng ức chế HP tương tự như kháng sinh trong các thử nghiệm invitro.
Cao đặc DDHV đã được thử nghiệm trên mô hình in vitro và cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn HP Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao đặc DDHV có tác dụng giảm tiết dịch vị và trung hòa acid dịch vị Những kết quả này hứa hẹn cao đặc DDHV sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong điều trị viêm loét dạ dày hành tá tràng có nhiễm HP.