TỔNG QUAN
Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì
Bánh mì là sản phẩm từ bột mì, nước, muối và nấm men, được lên men và nướng hoặc hấp chín Khoảng một nửa dân số thế giới sử dụng bánh mì như nguồn lương thực chính, cung cấp tinh bột và protein Có nhiều loại bánh mì với công thức chế biến khác nhau tùy thuộc vào thói quen ăn uống từng vùng, bao gồm bánh mì đen, bánh mì trắng, bánh mì vỏ cứng và bánh mì mềm Một số loại bánh mì còn được bổ sung thêm sắt, canxi và omega-3.
Bánh mì chủ yếu được làm từ bột mì và nấm men, cùng với các thành phần khác như muối, đường, sữa, trứng, chất béo, chất thơm, vitamin C và enzyme Ngoài ra, các phụ gia bổ sung có thể được sử dụng để nâng cao giá trị dinh dưỡng hoặc phục vụ các mục đích kỹ thuật.
❖ Hệ enzyme trong bột mì:
Enzyme trong bột mì đóng vai trò quan trọng, đặc biệt là protease và amylase Protease giúp phân giải protein cấu trúc bậc ba, nhưng nếu hoạt động quá mạnh ở nhiệt độ 45 - 47°C và pH 4,5 - 5,6, có thể làm giảm chất lượng bột nhào do gluten bị vụn nát Việc bổ sung chất khử sẽ tăng cường hoạt động của protease, trong khi chất oxy hóa và muối ăn lại kìm hãm enzyme này Ngược lại, amylase có tác dụng tích cực trong việc thủy phân tinh bột thành maltose, giúp bột lên men nhanh và cải thiện chất lượng bánh, đặc biệt khi lượng đường trong bột không đủ cho quá trình lên men.
4 bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt, do đó làm giảm chất lượng bánh
1.1.2 Quy trình làm bánh mì
Sữa tươi không đường 135 ml
❖ Quy trình làm bánh mì:
Hình 1.1: Quy trình làm bánh mì
Vê bột Lên men ổn định sơ bộ
Nhào bột là bước quan trọng quyết định chất lượng bánh thành phẩm, giúp phân phối nước, gia vị và phụ gia đều trong khối bột Quá trình này không chỉ nâng cao giá trị cảm quan mà còn tạo ra khối bột đồng nhất, làm cho các sợi gluten trở nên dẻo dai và chắc chắn hơn Gluten khỏe sẽ giữ lại hơi khí trong bột, giúp bánh nở đều khi nướng.
Để tiến hành làm bột, trước tiên, rây các nguyên liệu khô như bột mì, đường, muối và men, sau đó trộn đều chúng lại với nhau Tiếp theo, cho hỗn hợp nhũ tương gồm sữa, trứng và bơ vào Sau khi tất cả nguyên liệu được cho vào máy nhào bột, nhào với tốc độ chậm trong 13 phút Khi bột không còn dính vào thành và đáy máy, có nghĩa là nguyên liệu đã liên kết chặt chẽ và độ dính đã giảm.
Để tạo ra khối bột hoàn hảo, cần nhào trộn các nguyên liệu đúng công thức, giúp protein trong bột mì kết hợp với nước và hình thành gluten ướt Khối bột sau khi nhào xong phải có độ dẻo và đàn hồi tốt Để kiểm tra, bạn có thể ấn nhẹ lên mặt bột; nếu bột đàn hồi trở lại và không dính vào tay khi nhấc ngón tay lên, thì bột đã đạt yêu cầu.
❖ Các biến đổi trong quá trình nhào trộn
Trong quá trình nhào trộn, hỗn hợp nguyên liệu ban đầu chuyển từ hai pha rắn và lỏng thành một pha nhão đồng nhất, dẻo và có độ xốp nhất định Quá trình này không chỉ làm giảm độ dính mà còn tạo ra pha khí do sự tích lũy bọt khí và hoạt động của nấm men, dẫn đến sự gia tăng thể tích khối bột.
Ngoài ra, sự ma sát và các phản ứng hóa học xảy ra trong quá trình nhào làm cho nhiệt độ của khối bột nhào sẽ tăng
Khi nhào bột, gliadin và glutenin hấp thụ nước, tạo ra gluten, giúp cấu trúc bánh trở nên xốp, dẻo và đàn hồi Tinh bột liên kết với nước trong quá trình này, trong khi muối ăn phân ly thành các ion, làm tăng độ chặt của khung gluten Đồng thời, đường và muối cũng hòa tan, góp phần vào sự phát triển của bột.
Hô hấp yếm khí trong quá trình lên men sản sinh khí CO2, rượu ethanol và các acid hữu cơ như acid lactic, oxalic, acetic, succinic, malic và formic, tạo nên vị chua và hương vị đặc trưng Sự tích tụ khí CO2 trong khối bột nhào hình thành các túi khí, khiến khối bột trở nên xốp và tăng thể tích Khi lượng khí sinh ra nhiều, khung gluten giữ cho các túi khí không bị vỡ, đảm bảo độ nở của bột.
2 Lên men ổn định sơ bộ
Trong quá trình lên men bột nhào, nấm men chuyển hóa đường và tinh bột thành các sản phẩm trung gian, cuối cùng sản sinh ra CO2, giúp bột nhào nở.
8 sản phẩm phụ như acid lactic, acetic, rượu etylic, aldehyt, ester tạo cho bánh mì có mùi thơm đặc trưng
Trong quá trình lên men bột nhào, tinh bột và các chất cao phân tử khác được thủy phân thành những hợp chất có phân tử lượng thấp, điều này giúp tăng cường độ tiêu hóa của bánh mì.
Sau khi nhào bột đạt yêu cầu, tiến hành lên men sơ bộ bằng cách cho bột vào tô và đậy kín bằng màng bao thực phẩm Quá trình lên men này diễn ra trong môi trường yếm khí, giúp bột phát triển tốt hơn Để bột ủ trong khoảng thời gian nhất định cho đến khi đạt yêu cầu.
Hình 1.3: Khối bột nhào sau khi lên men ổn định sơ bộ
Quá trình tạo hình bán thành phẩm bánh mì bao gồm các bước chia, vê, ổn định cấu trúc và tạo hình Bước chia bột giúp định lượng và tạo ra sản phẩm đồng đều, với sai số cho phép từ 1 đến 1,5% Sau khi chia, bột cần được lăn vê ngay để cải thiện cấu trúc và đảm bảo ruột bánh xốp đều Mỗi phần bột được chia thành các viên 50 g, làm đứt mạng gluten và thải khí carbonic Việc vê tròn giúp củng cố mạng gluten, cải thiện cấu trúc bột và tạo ra bề mặt nhẵn mịn, tránh tình trạng bánh bị nứt sau khi nướng.
9 men Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình lên men
Hình 1.4: Bột nhào sau khi tạo hình
Lên men cuối là giai đoạn quan trọng trong quy trình sản xuất bánh mì, nhằm hoàn thiện sản phẩm Trong quá trình chia và tạo hình, một lượng lớn khí CO2 trong “bánh sống” đã thoát ra Mục đích của lên men cuối là tích lũy thêm khí CO2 do nấm men tạo ra, giúp “bánh sống” nở lên và hình thành kết cấu bánh như mong muốn.
Sau khi nhào bột thành hình tròn, xếp đều lên khay nướng có lót giấy nến, bạn cho vào lò nướng ủ ở nhiệt độ 40°C trong khoảng 40 phút Để giữ ẩm cho bột, hãy đặt một cốc nước vào lò, giúp bề mặt bột không bị khô trong quá trình ủ Đóng kín cửa lò để giữ hơi ẩm và ổn định nhiệt độ Khi bột ủ xong, nó sẽ nở gấp rưỡi đến gấp đôi kích thước ban đầu.
Hình 1.5: Bột nhào sau khi lên men kết thúc
Tổng quan về bột chua
Lên men bột và nước để tạo ra bột nhào chua là một phương pháp quan trọng trong sản xuất bánh mì hiện nay Quá trình này bao gồm việc bổ sung chủng khởi động vào khối bột lỏng, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm mới men cái theo chu kỳ Trong số các vi khuẩn lên men, vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) đóng vai trò quan trọng bên cạnh nấm men Trong phương pháp truyền thống, một phần bột được trộn với men và nước, sau đó để lên men trong vài giờ, thường qua đêm và tiếp xúc với không khí Khối bột xốp sau đó được trộn với phần bột còn lại, nước, muối và chất béo, rồi lên men ngắn trước khi nướng Kết quả là bánh mì có hương vị tuyệt vời nhờ vi khuẩn lên men từ không khí hoặc việc bổ sung 2-5% sản phẩm lên men từ mẻ trước Mật độ vi khuẩn lactic trong khối bột nhào xốp là yếu tố quan trọng trong quá trình chuẩn bị nướng bánh mì.
Nấm men có mật độ từ 10^8 đến 10^9 cfu/g, trong khi vi khuẩn axit lactic (LAB) có mật độ từ 10^6 đến 10^7 cfu/g, đóng vai trò quan trọng trong quá trình acid hóa và lên men khối bột, giúp bột nở tốt hơn LAB có thể xâm nhập vào bột một cách tự nhiên, thông qua sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại chứa các dòng LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens).
1.2.1 Đặc tính của bột chua Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ bản đại diện bởi LAB và nấm men Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước Cơ chế chua rất phức tạp (Hammes và Gọnzle, 1998) Trong quỏ trỡnh lờn men, cỏc thay đổi
Sự sinh hóa trong bột chua chủ yếu xảy ra nhờ hoạt động của vi khuẩn axit lactic (LAB) và enzyme, dẫn đến các quá trình như lên men lactic, thủy phân protein và tổng hợp hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc Các hoạt động trao đổi chất của LAB đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men bột (Spicher, 1983; Hammes và Gọnzle, 1998; Gobbetti và cộng sự, 1999) Sự phát triển của bột chua được chi phối bởi LAB với nồng độ tối ưu khoảng 10^8 cfu/g, có khả năng cộng sinh với nấm men thông thường có nồng độ thấp hơn, thường với tỷ lệ nấm men/LAB là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng sự, 2002; Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996).
1.2.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua
Quá trình lên men bột chua đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương vị cho bánh mì, nhờ vào hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật, dẫn đến sự acid hóa có ảnh hưởng đến kết cấu và thời hạn sử dụng của bánh Sự acid hóa này không chỉ giảm sự phát triển của nấm mốc trong quá trình bảo quản mà còn tạo ra các thành phần hương vị đặc trưng, mang lại cảm quan chua đặc sắc cho bánh Trong quá trình lên men, hai loại hợp chất hương vị được sản xuất, bao gồm acid hữu cơ từ vi khuẩn đồng hình và dị hình.
Các hợp chất dễ bay hơi trong bột bánh mì từ bột chua, bao gồm rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh, được sản xuất qua quá trình lên men sinh học, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương vị đặc trưng cho bánh mì Quá trình acid hóa cũng giúp giảm độ pH, góp phần tăng cường hương vị của sản phẩm (De Vincenzi, 1995b; Barber et al., 1985; Galal et al., 1978; Spicher, 1983).
❖ Hợp chất không bay hơi
Phản ứng giữa vi khuẩn lactic và enzyme ngoại bào có tác động quan trọng đến hoạt tính vi sinh vật trong quá trình acid hóa và sản xuất acid acetic, đồng thời ảnh hưởng đến đặc tính kết cấu của bánh mì Sự kết hợp giữa LAB và các enzyme như glucose oxidase, lipase, endo xylanase, amylase và protease giúp tăng cường hoạt động của các enzyme nội sinh trong bột, từ đó cải thiện chất lượng sản phẩm.
Sự chuyển hóa ở vi khuẩn lactic chứng minh khả năng sản xuất các hợp chất dễ bay hơi khác nhau trong quá trình lên men Các sản phẩm chính bao gồm 2-metyl-1-propanol, 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkohol khác Các dòng LAB thể hiện sự khác biệt trong trao đổi chất và sản xuất hợp chất thơm Nghiên cứu đã thử nghiệm sự kết hợp giữa các chủng S cerevisiae, C guilliermondii và L plantarum trong bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose (Stolz và cộng sự, 1993) Trong quá trình lên men chỉ sử dụng men bánh mì, đã phát hiện bảy hợp chất dễ bay hơi đáng chú ý: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu isobutyl và propanol.
1.2.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì
Các phản ứng Maillard và Caramel hóa đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương vị của sản phẩm thực phẩm khi được đun nóng, liên quan đến các tiền chất như acid amin và đường đơn giản như aldose hoặc ketose.
Trong quá trình lên men bột chua, sự kết hợp giữa vi khuẩn axit lactic (LAB) và S exigus M14 đã tạo ra lượng acid amin tự do cao nhất (Gobbetti, Corsetti và cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983; Rothe, 1974) Những acid amin này đóng vai trò quan trọng như là các thành phần cấu tạo của iso-alcohols.
De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị
Quá trình lên men và nướng bánh mì tạo ra nhiều sản phẩm phản ứng Maillard, bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa lưu huỳnh, cũng như alkanals và alkenals (Bredie, Mottram & Guy, 2002; Damiani và cộng sự, 1996) Khi nhiệt độ tăng cao, sự hình thành pyrrole, thiophenes, thiophenones, thiapyrans và thiazolines gia tăng, trong khi đó furan và aldehyde lại giảm (Parker, Hassell, Mottram, & Guy, 2000).
Pyrazin là hợp chất chứa nitơ, nổi bật với mùi và hương vị mạnh mẽ, ảnh hưởng lớn đến hương vị của bánh mì (Ji và Berhard, 1992) Việc sản xuất các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương vị đặc trưng cho sản phẩm.
1.2.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua
Bột mì chứa nhiều loại carbohydrate, bao gồm maltose, sucrose, glucose, fructose và một số trisaccharides như maltotriose và raffinose Trong quá trình lên men, lượng glucose tăng lên, trong khi sucrose giảm do tác động của vi sinh vật (VSV) và nấm men Mặc dù nấm men trong bột chua không thể lên men maltose, nhưng chúng vẫn có thể phát triển nhờ vào glucose được cung cấp bởi một số loài vi khuẩn axit lactic (LAB).
L sanfranciscensis Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất, ngoài acid lactic, CO2, acid acetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6- phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình) Hexoses khác với glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6- phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson,
Disaccharides are broken down by specific hydrolases and/or phosphohydrolases into monosaccharides, which then enter the primary metabolic pathway Pentoses undergo phosphorylation and are converted to ribulose-5-phosphate or xylulose-5-phosphate by epimerases or isomerases, subsequently being metabolized in the latter part of the 6-PG/PK pathway.
1999) Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men
Tổng quan về vi khuẩn lactic
Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:
− Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua
− Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic
− Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là
Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic)
− Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram (+), không di động và không tạo bào tử Chúng thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, không chứa cytochrom và enzyme catalase, nhưng lại có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase mạnh mẽ Vi khuẩn này phân giải H2O2 thành H2O và O2 để phát triển Nhờ vào việc sinh ra acid lactic, một acid yếu, vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm lên men nhằm ức chế sự phát triển của các tác nhân gây hư hỏng.
Có 22 loại monosaccharide và disaccharide, nhưng không phải tất cả các chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng lên men đường disaccharide Một số chủng không thể lên men saccharose, trong khi một số khác lại không thể sử dụng lactose Ngoài ra, các vi khuẩn lactic cũng không lên men được tinh bột, trừ chủng Lactobacillus delbrueckii, và các loại polysaccharide khác.
Việc phân loại vi khuẩn lactic chủ yếu dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men, cũng như khả năng phát triển ở nhiệt độ và nồng độ muối khác nhau Ngoài ra, quy trình sản xuất acid lactic và khả năng chịu acid hoặc kiềm cũng là những yếu tố quan trọng Phân loại còn dựa vào thành phần acid béo, cấu trúc thành tế bào và phương pháp sinh học di truyền hiện đại Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn lactic được sắp xếp thành các nhóm khác nhau dựa trên những tiêu chí này.
Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae
− Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc
− Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus
Vi khuẩn lactic xuất hiện rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt là trong cỏ khô, cơ thể người và động vật, cũng như trong khoang miệng và ruột Mặc dù một số loài như Streptococcus có thể gây bệnh, nhưng nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng với nhiều giống khác nhau, bao gồm cả tế bào hình cầu và hình que Chúng được phân biệt dựa trên khả năng lên men đồng hình hoặc dị hình, tuy nhiên, khả năng tổng hợp các hợp chất cần thiết cho sự sống của chúng lại khá yếu.
Đường kính của cầu khuẩn lactic dao động từ 0,5 đến 1,5 μm, với các tế bào hình cầu thường xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau Trong khi đó, kích thước của tế bào trực khuẩn lactic nằm trong khoảng từ 1 đến 8 μm, và chúng có thể tồn tại độc lập hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic có khả năng chịu đựng trong điều kiện khô hạn và bền với CO2 cũng như cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có nồng độ cồn từ 10 – 15% hoặc cao hơn, trong khi một số trực khuẩn có thể chịu được NaCl tới 7 – 10% Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ thấp (5 o C hoặc thấp hơn), trong khi các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 25 - 35 o C, và các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu là 40 – 45 o C Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên 60 – 80 o C, hầu hết các vi khuẩn lactic sẽ chết sau 10 – 30 phút.
Vi khuẩn lactic, có mặt trong môi trường chứa peptone, acid amin và muối amin, yêu cầu dinh dưỡng giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men diễn ra tốt nhất ở pH acid từ 5,5 – 6; nếu pH thấp hơn 5,5, quá trình này sẽ dừng lại Chúng có hoạt tính protease, giúp phân huỷ protein sữa thành peptit và acid amin, với sự khác biệt giữa các loài Ngoài khả năng lên men disacarit, một số loài vi khuẩn lactic còn tạo thành màng nhầy và có khả năng kháng lại vi sinh vật gây bệnh Đặc biệt, chúng sản sinh ra bacteriocin, các hợp chất kháng sinh không dùng trong y học nhưng hiệu quả trong bảo quản thực phẩm Một số loài vi khuẩn lactic như Streptococcus diacetylactic còn tạo ra chất thơm như diacetyl và acetoin.
1.3.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus
Vi khuẩn lactic được phân loại dựa trên hình dạng tế bào thành hai loại chính: hình cầu và hình que Kích thước của các vi khuẩn này cũng khác nhau tùy thuộc vào từng loài.
Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus
Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,
Vi khuẩn lactic là các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có đặc điểm catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy Chúng chủ yếu trao đổi chất qua con đường lên men và không hô hấp do thiếu cytochromes.
Lactobacillus là vi khuẩn có mặt trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là sữa, cũng như trong ruột, hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục của con người Các thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng thường chứa các vi khuẩn này, và chúng thuộc nhóm vi khuẩn lactic, được sử dụng rộng rãi trong nhiều ứng dụng.
Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake và Lactobacillus plantarum là những loài vi khuẩn lactic quan trọng Sự phân chia của các vi khuẩn này dựa trên các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất carbohydrate.
Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm
Nhóm I bao gồm các vi khuẩn lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium, có khả năng sản xuất fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) Chúng có khả năng lên men hexose để tạo ra acid lactic nhưng không thể lên men pentose, và phát triển tốt ở nhiệt độ 45 độ C.
Nhóm II, được biết đến với tên gọi Streptobacterium, thực hiện quá trình lên men dị hình tùy ý nhờ vào sự hiện diện của FDPaldolase và phosphoketolase Trong quá trình này, hexose tham gia vào lên men đồng hình, trong khi pentose được chuyển hóa thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.
− Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò quan trọng trong việc điều trị và ngăn ngừa các vấn đề sức khỏe như nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, và tiêu chảy do thuốc kháng sinh hoặc nhiễm khuẩn Clostridium difficile Ngoài ra, Lactobacillus còn giúp cải thiện tình trạng không dung nạp lactose và hỗ trợ điều trị các bệnh về da như eczema, mụn trứng cá và viêm loét da, cũng như ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp.
1.3.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao, với nhu cầu khác nhau tùy thuộc vào từng loại Để phát triển bình thường, chúng cần các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ (một phần dưới dạng acid amin), photphat, và lưu huỳnh, cùng với một số vitamin, chất sinh trưởng và khoáng chất.
❖ Nhu cầu dinh dưỡng carbon
MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu
Sử dụng Lactobacillus plantarum kết hợp với nấm men trong quá trình lên men bánh mì có thể giúp kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm Nghiên cứu này cũng khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn axit lactic (LAB) đến chất lượng của bánh mì, nhằm cải thiện hương vị và độ tươi ngon của sản phẩm.
Khảo sát đặc điểm hình thái; sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1, khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn
Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men
Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì:
+ Khảo sát mật độ của LAB bổ sung vào bánh mì
+ Khảo sát thời gian lên men của bột nhào
+ Khảo sát nhiệt độ nướng bánh
+ Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích giữa các loại bánh.
Vật liệu – thiết bị - hóa chất
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được phân lập từ nem chua, cơm mẻ (Nguyễn Hoài Hương và Huỳnh Phương Quyên, 2018)
Nấm mốc Aspergillus niger được phân lập từ đậu nành nhiễm mốc do phòng thí nghiệm trường cung cấp
Nấm men Saccharomyces cerevisiae của nhà sản xuất Saf-Instant.
2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng
− Thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), Fushin, Malachite green
− Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate
2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1)
− Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS – broth)
− Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe cải tiến (MRS cải tiến)
− Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe Agar (MRS agar)
− Môi trường Potato Dextrose agar (PDA)
− Môi trường Potato Dextrose broth (PDB)
− Môi trường Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)
2.2.3 Thiết bị và dụng cụ
− Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
− Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
− Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 henesis (USA)
− Máy nước cất (Branstead USA)
− Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh
− Pipet thuỷ tinh 5 ml, 10 ml, 20 ml, pipetman 100 – 1000 μl
− Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1 ml, ống ly tâm lớn
− Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa.
Phương pháp nghiên cứu
Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua và cơm mẻ có tính an toàn thực phẩm, được ứng dụng trong việc đồng lên men với nấm men để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì mà không cần sử dụng chất bảo quản hóa học Để đạt được điều này, cần xác định mật độ vi khuẩn lactic, thời gian lên men và nhiệt độ nướng Các chỉ tiêu hoá lý như thể tích, pH, độ ẩm và acid tổng của bột nhào trước và sau lên men cũng như bánh sau nướng sẽ được theo dõi Thí nghiệm so sánh bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì chứa chất bảo quản hóa học và bánh mì không chất bảo quản nhằm làm rõ vai trò ức chế nấm mốc của vi khuẩn lactic Các thí nghiệm cảm quan cũng sẽ được thực hiện để chọn mật độ và chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho quá trình đồng lên men trong sản xuất bánh mì.
2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu
Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1
Khảo sát khả năng kháng nấm
A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men
Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng đối kháng Aspergillus niger in vitro
− Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men bột nhào
− Khảo sát nhiệt độ nướng bánh
− Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích các loại bánh
Khảo sát ảnh hưởng của
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì
2.3.3 Thuyết minh quy trình tổng quát
Khảo sát mật độ LAB tối ưu bổ sung vào sản phẩm
− Thể tích khối bột nhào
Khảo sát thời gian lên men
− Thể tích khối bột nhào
Khảo sát nhiệt độ nướng bánh
− Mật độ vi khuẩn Lactic
− Mật độ nấm men nấm mốc
Khảo sát thời gian bảo quản và mức độ ưa thích
− Mật độ nấm men nấm mốc
− Khảo sát hình thái vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1
− Khả năng đối kháng in vitro và đối kháng in vivo
− Khảo sát ảnh hưởng các mật độ của LAB lên tính chất bột nhào trước và sau lên men, thời gian lên men bột nhào
− Khảo sát ảnh hưởng các mật độ của LAB lên cảm quan sản phẩm
Chọn mật độ lab tối ưu và thời gian lên men đáp ứng các yêu cầu về cảm quan và độ nở của bánh mì
− Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nướng bánh lên tính chất hoá lý và cảm quan
− Khảo sát thời gian bảo quản và đánh giá cảm quan mức độ ưa thích giữa các loại bánh mì
Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm
2.4.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus plantarum
2.4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus plantarum
Mục đích của thí nghiệm là xác định độ thuần khiết và khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic, vì chúng có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản Thí nghiệm được thực hiện trong khoảng thời gian ủ từ 24 đến 48 giờ.
Tăng sinh trong môi trường MRS-broth
Cấy truyền sang môi trường MRS agar
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa
❖ Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc:
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được kích hoạt và phát triển trong môi trường MRS broth đã được khử trùng ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút, sau đó ủ ở 37℃ trong 24 giờ Sau thời gian nuôi cấy, các mẫu được chuyển sang môi trường MRS agar và tiếp tục ủ ở 37℃ trong 48 giờ để quan sát hình thái khuẩn lạc lactic.
Tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn lactic, bao gồm các phương pháp như nhuộm gram, nhuộm bào tử và thử nghiệm catalase.
Sau khi xác định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng, tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng Quá trình này được ủ ở nhiệt độ 37℃ trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ và sau đó được bảo quản trong tủ lạnh của phòng thí nghiệm.
❖ Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá
Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến
Để chuẩn bị vết bôi, sử dụng que cấy vô trùng để lấy một ít vi khuẩn từ thạch sau 24 giờ cấy, sau đó hòa vào 1 giọt nước cất đặt ở giữa phiến kính và để khô trong không khí.
− Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần
− Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
− Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
− Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô
− Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí
− Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ
Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton
− Nuôi cấy vi khuẩn ở 37 o C, 5 - 7 ngày
− Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram
− Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước
− Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô
− Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ
Chuẩn bị dung dịch H 2 O 2 nồng độ 3 - 10%, nhỏ một giọt lên phiến kính
Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O 2 trên phiến kính
Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính
Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O 2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự
2.4.1.2 Khả năng sinh acid
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus plantarum
Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus plantarum Tiến hành:
− Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút và ủ ở 37℃ trong 24 giờ
− Hút 10 ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần) Ly tâm 4000 vòng / 15 phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen Ủ 37 0 C 24h
Tăng sinh trong môi trường MRS - broth
− Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8,3
- Số ml NaOH: thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng đổ chuẩn độ
- Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus plantarum
Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4
2.4.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum in vitro
Hình 2.5 trình bày sơ đồ chi tiết về khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối với nấm mốc, được thực hiện theo phương pháp cấy hai đường vi khuẩn Quá trình này bao gồm việc đặt thạch nấm để đánh giá sự tương tác giữa vi khuẩn và nấm mốc.
Hoạt hóa chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS - broth
Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS - broth
Tăng sinh A.Niger trên môi trường PDB
Cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA Đo đường kính ức chế nấm
Tỷ lệ ức chế nấm bệnh Ủ 72h ở nhiệt độ phòng
Hoạt hóa A.Niger trên môi trường PDB ĐC âm (Không ria vi khuẩn)
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn
• Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
Hoạt hóa hai chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ Sau đó, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong cùng môi trường MRS broth tại 37 độ C trong 24 giờ tiếp theo.
• Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng:
Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 37 0 C trong 24h Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 37 0 C trong 24h
Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng
• Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:
Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15 ml
Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm các đĩa Mỗi đĩa lặp lại 3 lần Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng
Sau 24 giờ, tiến hành cấy hai vạch vi khuẩn cách mép đĩa 1,5 cm, đảm bảo hai vạch vi khuẩn nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính Mẫu đối chứng chỉ cấy nấm vào tâm đĩa mà không cấy hai vạch vi khuẩn Tiếp tục ủ mẫu trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng.
Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày
Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm:
Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn
- Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng
- Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm
Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4
2.4.2 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men
1,5 cm Đường cấy vi khuẩn
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì
Cấy truyền sang môi trường PDA
Cạo bào tử trên đĩa petri Định mức 100 ml Đo OD620nm
Xịt nấm lên bề mặt mẫu
TH1: 10 3 TH2: Không cảm nhiễm plantarum L5 và C1
Tăng sinh trong môi trường MRS - Broth Ủ + lắc 24h
Pha loãng 2 lần Đo OD600nm
Rửa nước muối sinh lý
Theo dõi ngày đầu tiên xuất hiện tơ nấm sau nướng
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus plantarum trên bánh mì
Chủng Lactobacillus plantarum L5 và Lactobacillus plantarum C1 được cấy truyền với tỷ lệ 5% vào môi trường MRS để tăng sinh Sau đó, các chủng này được ủ và lắc đồng thời ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Hút 2 ml dịch tăng sinh đem ly tâm, bỏ dịch và pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,9% vô trùng
Tiếp tục pha loãng 2 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% vô trùng, sau đó đo
OD600nm Ghi nhận kết quả và thế vào phương trình đường chuẩn tính được lượng tế bào cần bổ sung vào bánh mì
Lấy thể tích dịch tăng sinh cần ly tâm đem ly tâm 4000 vòng trong 15 phút trong ống Falcon, sau đó bỏ dịch
Để làm sạch sinh khối, cho nước muối vô trùng vào ống và lắc nhẹ, sau đó ly tâm ở 4000 vòng trong 15 phút Tiếp tục lặp lại quy trình rửa bằng nước muối vô trùng và ly tâm thêm một lần nữa nhằm loại bỏ tối ưu các tạp chất còn sót lại từ môi trường nuôi cấy.
Sinh khối thu được sẽ được hòa với sữa không đường, lắc nhẹ cho hòa tan rồi bổ sung vào với các thành phần bánh mì
➢ Trường hợp 1: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 10 3 (tb/ml)
− Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường
Sau khi thu được đĩa nấm nuôi cấy, hãy hút 5 ml nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung Tween 80 vô trùng vào đĩa nấm Sử dụng muỗng inox đã được hấp khử trùng để cạo bề mặt đĩa nấm, sau đó đổ vào bình định mức 100 ml Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần cho đến khi bề mặt đĩa nấm được cạo sạch.
− Định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween 80 đến 100 ml, ta
48 được mẫu dung dịch nấm cần
− Sau đó đo OD620nm, ghi nhận kết quả đo và tính toán lượng bào tử cần phun lên bề mặt bánh
− Cho 11 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và tiến hành xịt nấm lên bề mặt mẫu
− Đóng kín miệng bao rồi theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả
➢ Trường hợp 2: Không cảm nhiễm nấm, để ngoài tự nhiên
− Cho 11 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và đóng kín miệng bao
− Theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả
Số liệu được xử lí bằng phần mềm JMP
2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của LAB
2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào
❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát mật độ LAB tối ưu và thời gian lên men của bột nhào
Nguyên liệu Lên men sơ bộ
Vê bột Lên men kết thúc
Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lactic và thời gian lên men đến các yếu tố như thể tích bột nhào, độ ẩm, pH và tổng acid trong khối bột nhào trước và sau quá trình lên men Đồng thời, đánh giá cảm quan các mẫu bánh từ các mật độ vi khuẩn khác nhau tương ứng với ba mức thời gian lên men khác nhau Mục tiêu là tìm ra mật độ vi khuẩn lactic và thời gian lên men tối ưu để đạt được thể tích bột nhào nở cao nhất, pH thấp, sinh acid nhiều và độ ẩm cao nhất.
Để làm bánh mì, cần cân đo chính xác các nguyên liệu theo công thức Sau đó, trộn các nguyên liệu chung theo từng mẻ bột với các mật độ vi khuẩn khác nhau, bao gồm Lactobacillus plantarum L5-10 7, L5-10 8, L5-10 9 và L5-10 10.
− Khi trộn tất cả nguyên liệu lại với nhau, bắt đầu nhào bột bằng máy nhào trộn trong 13 phút ở tốc độ chậm nhất của máy
− Sau khi nhào, ủ sơ bộ khối bột nhào trong 30 phút ở nhiệt độ thường, rồi chia bột 50 g, vê bột, tạo hình khối cầu tròn
− Tiến hành lên men kết thúc ở 40 o C với ba mốc thời gian khác nhau: T1
Lấy mẫu bột nhào trước và sau quá trình lên men để khảo sát các chỉ tiêu quan trọng, từ đó xác định mật độ vi khuẩn tối ưu và thời gian lên men phù hợp, đáp ứng yêu cầu về cảm quan và độ nở của bánh mì.
− Sau đó, đem nướng bánh để khảo sát cảm quan bánh mì thành phẩm c) Khảo sát các thông số đo
2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ nướng bánh
❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nướng bánh
− Mật độ vi khuẩn lactic
Nguyên liệu Lên men sơ bộ
Vê bột Lên men kết thúc
Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nhiệt độ nướng đến thể tích bột nhào, độ ẩm, độ acid tổng, màu sắc và mật độ vi khuẩn lactic trong bánh mì thành phẩm Mục tiêu là xác định nhiệt độ nướng tối ưu để đạt được chất lượng bánh mì tốt nhất.
