Tình hình nghiên cứu
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra tiềm năng của vi khuẩn phân hủy cellulose trong việc sản xuất etanol nhiên liệu Sinh khối lignocellulosic được xem là một nguồn tài nguyên quý giá cho quá trình này.
Trang 3 nguyên tái tạo phong phú với tiềm năng lớn cho bioconversion để gia tăng gía trị chế phẩm sinh học
Việc đốt cháy dầu mỏ và nhiên liệu hóa thạch đang gây ra lo ngại về khí hậu toàn cầu và nguồn cung dầu khí không ổn định, cùng với chi phí nhiên liệu tăng cao Những vấn đề này đã thúc đẩy nỗ lực toàn cầu trong việc nghiên cứu và phát triển nguồn tài nguyên tái tạo để đáp ứng nhu cầu năng lượng ngày càng tăng Tại Canada, tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo đã được nâng lên, yêu cầu các nhiên liệu phải chứa 5% ethanol từ năm 2010.
Vào năm 2009, Cơ quan Bảo vệ Môi trường đã nâng cao tiêu chuẩn về nhiên liệu tái tạo, cho phép sản xuất ethanol với tỷ lệ 10,21% trong hỗn hợp nhiên liệu Hiện nay, tỷ lệ ethanol trong nhiên liệu tại Brazil đã đạt 25%, theo quy định được thiết lập vào năm 2007.
Sinh khối chứa lignocellulosic là nguồn tài nguyên tiềm năng cho sản xuất nhiên liệu sinh học nhờ vào sự phong phú và giá thành rẻ Phế phẩm nông nghiệp như lá, thân cây từ các loại cây như phế thải ngô, bã mía, vỏ trấu và cây thân gỗ là những nguồn lignocellulosic dồi dào Ngoài ra, một số loại cỏ chuyên dụng như cỏ Miscanthus và cỏ Bermuda cũng được sử dụng để sản xuất năng lượng sinh học Quá trình chuyển đổi nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose thành đường dễ lên men bao gồm ba bước chính.
Thủy phân enzyme (Pluz Wyman, 1999; Zhang và Lynd, 2004 B)
Một trong những thách thức lớn nhất trong công nghệ hiện nay là cải thiện tính bền của vật liệu tự nhiên chứa lignocellulose Việc sử dụng enzyme có khả năng thủy phân để sản xuất các loại đường lên men trong điều kiện thường là một giải pháp tiềm năng (Chang và cộng sự, 1981).
Numerous studies have contributed to the understanding of various topics in the field, including key research by Demain et al (2005), Fan et al (1982), Grethlein (1984), and Hsu (1996) Additional insights have been provided by Lin et al (1981), McMillian (1994), Millett et al (1976), and Moreira (2005) Furthermore, Mosier et al (2005) and colleagues, along with Weil et al (1994) and Wyman (1999), have also made significant contributions, culminating in further findings by Wyman et al (2005a).
Gần đây, Genencor và Novozymes đã phát triển một quy trình công nghệ mới giúp giảm chi phí sản xuất enzyme cellulase, từ 5,40 USD/gallon ethanol xuống chỉ còn khoảng 20 cent/gallon ethanol Công nghệ này không chỉ giảm chi phí sản xuất cellulase mà còn nâng cao hiệu suất lên men và rút ngắn thời gian lên men.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng nghiêm trọng ở Việt Nam, với lượng rác thải tăng cao và nguy cơ ô nhiễm lớn Việc áp dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã mang lại nhiều lợi ích, nhưng việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên thường kéo dài thời gian xử lý và tốn kém diện tích Để cải thiện hiệu quả xử lý rác, cần tối ưu điều kiện phát triển cho vi sinh vật và tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, cũng như chịu nhiệt độ cao, nhằm rút ngắn thời gian và giảm chi phí xử lý.
Năm 1999, Nguyễn Lan Hương cùng các cộng sự đã phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng hoạt động cellulase, giúp rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5 đến 7 ngày khi bổ sung vào bể ủ rác.
Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã nghiên cứu các điều kiện lên men và tác động của yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt, được phân lập từ bể ủ rác thải.
Năm nay, Phạm Thị Ngọc Lan và các cộng sự đã nghiên cứu và lựa chọn một số chủng xạ khuẩn ưa ấm, được phân lập từ mùn rác tại nhiều địa điểm, có khả năng phân giải cellulose hiệu quả.
Nghiên cứu về phân lập và định danh các dòng vi khuẩn trong dạ cỏ bò của Võ Văn Phước Duệ và Cao Ngọc Diệp năm 2011
Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trên địa bang tỉnh Thừa Thiên Huế của tác giả Phạm Thị Ngọc Lan
Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng vi khuẩn phân hủy cellulose có thể được phân lập từ các nguồn giàu xơ khác, chẳng hạn như trấu đang hoai mục, vỏ và bã tiêu.
Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định và chọn lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose hiệu quả nhất, nhằm phát triển chế phẩm sinh học Chế phẩm này sẽ được sử dụng trong sản xuất phân compost, góp phần xử lý rác thải môi trường giàu xơ.
Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ mụn dừa và vỏ tiêu
Sàng lọc và tuyển chọn các chủng làm nguồn giống cho quá trình ủ compost từ mụn dừa.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu tiến hành sử dụng phần mềm Statgraphics plus 3.0.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Việc chọn lựa chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose không chỉ nâng cao hiệu quả xử lý phụ phế phẩm giàu xơ mà còn góp phần cải thiện ô nhiễm môi trường Sản phẩm thu được từ quá trình ủ compost có thể được sử dụng làm phân bón hữu cơ vi sinh, giúp cải tạo và tăng cường dinh dưỡng cho đất Ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất không chỉ bảo vệ môi trường mà còn thúc đẩy sự phát triển bền vững của nền nông nghiệp.
Kết quả đạt được
Đã thu được 5 chủng vi sinh vật (4 chủng vi khuẩn và 1 chủng xạ khuẩn) có khả năng phân hủy cellulose và tannic acid, đồng thời lựa chọn các chủng có tiềm năng để ủ compost từ mụn dừa Nội dung bài viết được chia thành 4 chương.
Chương 1: Tổng quan đề tài nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 01/04/2012-21/06/2012
Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
Vật liệu
Mụn dừa, hay còn gọi là mùn dừa (coco peat), là một loại phế phẩm nông nghiệp được thu thập từ Thành phố Cao Lãnh và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp, với mẫu 1 từ Cao Lãnh và mẫu 2 từ Lai Vung.
Vỏ tiêu: thu thập ở Bà Rịa Vũng Tàu (ký hiệu: mẫu 3)
Các hóa chất pha môi trường, NaCl, HCl 1N, NaOH 1N
2.2.3.1 Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Ống nghiệm không nắp Đĩa petri
Cốc 100ml, cốc 250ml, cốc 1000ml Ống đong
Pipet man 200àl Đầu tớp 200àl Ống ly tâm
Nhiệt kế Đũa thủy tinh
Bao hấp, giấy gói, thun
2.2.4.1 Mục tiêu Đồ án tốt nghiệp hướng đến 4 mục tiêu:
Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu
Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập
Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào,bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase
Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa
2.2.4.2 Thiết kế thí nghiệm Để hoàn thành tất cả các mục tiêu, tôi tiến hành thiết kế các thí nghiệm cho từng mục tiêu
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1
Mụn dừa 1 Mụn dừa 2 Vỏ tiêu
Tăng sinh trong môi trường chọn lọc với mẫu mụn dừa, vỏ tiêu và thành phần khoáng của môi trường BHM được thực hiện thông qua quá trình xử lý nhiệt.
Sàng lọc những mẫu có chứa quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch (Thí nghiệm 2.1.1.2 )
Phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC để lựa chọn sơ bộ vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose (Thí nghiệm 2.1.1.3 )
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2
Khảo sát khả năng tiết enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC (cấy điểm)
Khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch chứa giấy lọc (cấy ria) (Thí nghiệm 2.1.2.2 )
5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose
Trang 45 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3
Khả năng biến dưỡng citrate
Nuôi cấy khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử
Khảo sát một số phản ứng sinh hóa (Thí nghiệm 2.1.3.2 )
Nhuộm Gram Nhuộm bào tử
Khả năng sinh Indol Khả năng sinh enzyme gellatinase
5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose
Trang 46 Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4
Khả năng thủy phân giấy lọc bằng nguyên tế bào vi khuẩn (Thí nghiệm 2.1.4.1.e)
Tăng sinh trên môi trường lỏng chứa mụn dừa
Hoạt tính phân huỷ CMC Hoạt tính phân huỷ giấy lọc
Khảo sát hoạt tính phân huỷ tannin của năm chủng ở pH7 và lắc 150 vòng/phút Đục lỗ thạch (thạch tannic acid)
Hoạt tính enzyme tannase (Thí nghiệm 2.1.4.3.c)
Khảo sát khả năng chịu tannic acid ở các nồng độ khác nhau (Thí nghiệm 2.1.4.3.d)
Không lắc và lắc 150 vòng/phút pH môi trường: pH3, pH5, pH7, pH9 Đục lỗ thạch
Xác định hoạt tính CMCase (Thí nghiệm 2.1.4.1.c)
Xác định hoạt tính FPase (Thí nghiệm 2.1.4.1.d)
Các chủng có tiềm năng sử dụng ủ compost mụn dừa
2.2.5 Các môi trườ ng s ử d ụ ng trong thí nghi ệ m
Môi trường tăng sinh mẫu trên môi trường lỏng (kí hiệu:môi trường TS) (g/l)
Môi trường phân lập và giữ giống trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường PL): (g/l)
Môi trường định tính hoạt tính CMC của vi khuẩn (kí hiệu : môi trường ĐT): (g/l)
Môi trường thử nghiệm khả năng mọc trên giấy lọc trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường M): (g/l)
Môi trường tăng sinh chứa giấy lọc (kí hiệu : môi trường GL): (g/l)
Giấy lọc kích thước 1x6 cm pH = 7.0
Môi trường tăng sinh chứa Tannic acid 1 % (kí hiệu : môi trường TA): (g/l)
Tiến hành thí nghiệm
2.3.1 M ụ c tiêu 1: Phân l ậ p vi khu ẩ n ch ị u nhi ệ t phân h ủ y cellulose trong m ụ n d ừ a và v ỏ tiêu
2.3.1.1 Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt
Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập
Trước khi tiến hành phân lập ta phải chuẩn bị mẫu Tăng sinh 3 mẫu: 2 mẫu mụn dừa và 1 mẫu vỏ tiêu trên môi trường TS
Để thực hiện quy trình, mỗi mẫu pha 100ml môi trường tăng sinh TS cần được hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung 5 g mụn dừa và vỏ tiêu vào mỗi erlen Tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày, sau đó đun ở 80 oC trong 15 phút và tiếp tục lắc trong 2 ngày Cuối cùng, thu được 3 erlen 100 ml dung dịch chứa mẫu phân lập.
Sơ đồ các bước tiến hành
Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt
Hấp khử trùng 121 o C/15phút Pha 100 ml môi trường TS
Bổ sung 5 g mụn dừa (hoặc vỏ tiêu)
Lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày
Xử lý nhiệt 80 o C/15 phút/mẫu
2.3.1.2 Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch
Pha 100ml môi trường ĐT, đun và khuấy đều để CMC và agar tan hoàn toàn Tiến hành hấp khử trùng môi trường, sau đó đổ vào đĩa petri và để nguội Tiến hành đục lỗ trên thạch, dùng pipet vô trùng hút khoảng 0,2 ml dịch tăng sinh và cho vào lỗ thạch Cuối cùng, ủ đĩa thạch ở 37 o C trong 1 ngày và thực hiện đổ lugol.
Sơ đồ các bước tiến hành
Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose Để nguội Ủ ở 37 o C trong 1 ngày
Hấp khử trùng 121 o C/15 phút Pha 100ml môi trường ĐT Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Đục lỗ thạch (3 lỗ/đĩa)
Cho 0,2 ml dịch tăng sinh vào lỗ thạch Đổ lugol
2.3.1.3 Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC
Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập:
Sau khi pha môi trường PL vào bình tam giác thì tiến hành hấp khử trùng ở
Tiến hành tiệt trùng môi trường và đĩa petri ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1 atm trong 15 phút Sau khi môi trường nguội xuống khoảng 45 – 50 độ C, đổ vào đĩa petri Để làm nguội, lật ngược đĩa và ủ ở 30 độ C trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn (nhiễm nấm men và nấm mốc) Chỉ sử dụng đĩa nếu không có dấu hiệu nhiễm.
Để chuẩn bị nước muối sinh lý, bạn cần pha 100 ml dung dịch muối sinh lý 0,85%, sau đó hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC và áp suất 1 atm Sau khi để nguội, sử dụng nước muối sinh lý này để pha loãng mẫu và tiến hành phân lập.
Sau khi tăng sinh mẫu xong , tiến hành pha loãng mẫu :
Thể tích nước muối sinh lý 0.85 % đã hấp khử trùng (ml)
Chọn 3 độ pha loãng 10 -3 , 10 -5 và 10 -7 Hút 0,1 ml mỗi độ pha loãng cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị ở trên, cấy trang cho đều và mặt thạch vừa khô rồi đem ủ ở 37 oC trong 3 ngày
Cấy chuyền là quá trình quan trọng trong vi sinh vật học, sau khi ủ, nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc, ta sẽ chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau Mỗi khuẩn lạc sẽ được cấy vào một đĩa riêng biệt theo phương pháp zigzag để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong việc phân lập các vi khuẩn mong muốn.
Trang 53 chỉ chạm vào đường cấy trước một vài điểm), sau khi cấy xong một đường cấy phải hơ nóng đầu que cấy trên ngọn đèn cồn Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong tủ ủ Cứ như thế cho đến khi các khuẩn lạc rời đều thì kiểm tra dưới kính hiển vi thấy khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, kích thước, khuẩn lạc rời là xem như đã thuần Nếu mẫu thuần thì trữ mẫu Nếu mẫu chưa thuần thì tiếp tục cấy đến khi thuần
Sơ đồ các bước tiến hành phân lập
Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC
2.3.2 M ụ c tiêu 2: Sàng l ọ c vi khu ẩ n phân h ủ y cellulose t ừ các ch ủ ng phân l ậ p
2.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC
Lật ngược đĩa Để nguội
Hấp khử trùng 121 o C/15phút Pha 300 ml môi trường PL Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng
Cấy trang đĩa bằng dịch tăng sinh đã pha loãng bằng nước muối sinh lý Ủ ở 37 o C trong 3 ngày
Quan sát và cấy chuyền các chủng vi sinh vật
Sau khi pha chế môi trường PL vào bình tam giác, tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC và áp suất 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri Khi môi trường nguội xuống khoảng 45 – 50 oC, thực hiện đổ môi trường vào đĩa petri.
Khi môi trường trong đĩa thạch đã nguội, chúng ta tiến hành cấy ba điểm các giống đã thu được vào mỗi đĩa Sau khoảng ba ngày, khi các điểm đã hình thành khuẩn lạc, chúng ta sẽ sử dụng dung dịch lugol để quan sát kích thước vòng halo.
Sơ đồ các bước tiến hành
Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng
2.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc
Sau khi chuẩn bị 200 ml môi trường M trong bình tam giác, tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C, áp suất 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri Đợi cho môi trường nguội trước khi sử dụng.
Lật ngược đĩa Để nguội
Hấp khử trùng 121 o C/15phút Pha 300ml môi trường PL Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng
Cấy điểm các giống (3 điểm/đĩa) Ủ ở 37 o C trong 3 ngày
Trang 55 khoảng 45 – 50 o C thỡ ta tiến hành đổ vào đĩa petri Tiếp theo từ từ ẵ miếng giấy lọc lên môi trường sao cho nằm một bên của đĩa thạch Chú ý giấy lọc cho vào chỉ vừa thấm trên bề mặt thạch vào môi trường không nằm sâu vào môi trường
Dũng vi khuẩn cú khả năng sinh enzyme cellulase sẽ mọc trờn giấy lọc, ẵ đĩa cũn lại không có giấy lọc dùng làm đối chứng
Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy lọc
Các chủng được chọn lọc chuyển sang giữ giống trên ống thạch nghiêng Tiến hành
Cấy ria các giống Ủ ở 37 o C trong 5 ngày
Hấp khử trùng 121 o C/15phút Pha 200 ml môi trường M
Phối môi trường vào các đĩa petri vô trùng
Cho ẵ miếng giấy lọc vào một bờn đĩa
Các bước pha môi trường giữ giống tương tự như quy trình thực hiện môi trường phân lập (môi trường PL) Tiếp theo, chúng ta cần phối trộn môi trường PL và tiến hành hấp khử trùng các ống nghiệm để đảm bảo môi trường vô trùng.
121 o C trong 15 phút Trong thời gian chờ đông thạch ta để nghiêng các ống nghiệm rồi cấy ria các ống thuần vào
2.3.3 M ụ c tiêu 3: Kh ả o sát hình thái khu ẩ n l ạ c t ế bào, bào t ử và ph ả n ứ ng sinh hóa vi khu ẩ n phân l ậ p có ho ạ t tính cellulase
2.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase a Khảo sát hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập có hoạt tính cellulase Tiến hành
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn:
Nhỏ 5 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật
Khử trùng dao lam trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
Dùng dao lam lấy một khuẩn lạc riêng lẻ và thạch rồi trải đều lên giọt nước trên lame
Quan sát hình thái khuẩn lạc vi khuẩn ở hai vị trí vuông góc và song song với vật kính tại độ phóng đại 10x và 40x Tiến hành nhuộm Gram cho các chủng phân lập có hoạt tính cellulase.
Tiến hành theo phương pháp nhuộm của Hans Cristian Joachim Gram
Sử dụng que cấy để lấy nước vô trùng và một ít sinh khối cho vết bôi Sau đó, để vết bôi khô tự nhiên trong không khí hoặc cố định nhẹ bằng đèn cồn.
