QUAN TÀI LIỆU
Chu trình nitơ
Cơ bản của vòng tuần hoàn nitơ là quá trình nitrate hóa (nitrification), phản nitrate hóa (denitrification) và cố định nitơ (nitrogen fixation)
Nitơ chiếm 78% khí quyển nhưng chỉ 0,3% trong sinh quyển Các muối vô cơ của nitơ như ammon, nitrate, và nitrite có độ hòa tan cao, dễ dàng tham gia vào vòng tuần hoàn Chất mùn trong đất ôn đới chuyển hóa thành N vô cơ qua quá trình khoáng hóa chậm, trong khi vùng nhiệt đới có tốc độ khoáng hóa nhanh nhưng ít tích lũy chất mùn Khí nitrogen là khí trơ và khó mở nối N≡N, chỉ một số ít sinh vật có khả năng cố định nitơ Ngoài ra, nitơ cũng có thể được cố định qua tia chớp, phun trào núi lửa, và tại các nhà máy phân đạm hóa học, mặc dù quá trình này tiêu tốn nhiều năng lượng.
Khoảng 85% quá trình cố định nitơ trên trái đất được thực hiện bởi vi sinh vật, với 60% xảy ra trên đất liền và 40% trong đại dương Cây trồng hấp thụ nitơ vô cơ, chủ yếu là nitrate, để tổng hợp protein thực vật Động vật tiêu thụ protein từ thực vật để tạo ra protein động vật Xác thực vật và chất bài tiết chứa nitơ được vi sinh vật phân hủy thành nitơ vô cơ, trong đó một phần được cây hấp thụ, còn lại được vi khuẩn phản nitrate hóa chuyển đổi thành khí nitơ, trở lại khí quyển.
Vi sinh vật dị dưỡng có khả năng thực hiện quá trình nitrate hóa, và một số còn kết hợp với phản nitrate hóa kỵ khí, trong đó NH4+ được oxy hóa trong điều kiện thiếu oxy, tạo ra N2O và N2 Điều này cho thấy rằng quá trình nitrate hóa không chỉ diễn ra trong môi trường hiếu khí mà còn có thể tồn tại trong điều kiện thiếu oxy.
Nitrate hóa là một quá trình hiếu khí, oxy hóa ion ammon (NH4 +) thành nitrite (NO2 –), rồi sau đó oxy hóa thành nitrate (NO3 –) Chẳng hạn, vi khuẩn thuộc
Trang 4 các chi Nitrosomonas và Nitrosococcus đóng vai trò quan trong trong giai đoạn trước, còn vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter và các vi khuẩn dị dưỡng hóa năng tương ứng sẽ thực hiện giai đoạn sau Gần đây người ta phát hiện thấy vi khuẩn
Nitrosomonas eutropha trong phản ứng phản nitrate hóa tương quan, sẽ dùng
NO2 làm chất oxy hóa, trong điều kiện kỵ khí oxy hóa ion ammon thành nitrite và
NO Ngoài ra, quá trình nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) thực hiện bởi vi khuẩn và nấm đóng vai trò quan trọng trong những môi trường acid
Quá trình phản nitrate hóa (denitrification) là một quá trình dị hóa quan trọng, thường do các vi khuẩn dị dưỡng như Pseudomonas denitrificans thực hiện trong điều kiện hô hấp kỵ khí Trong quá trình này, nitrate được sử dụng làm chất oxy hóa, dẫn đến sự hình thành các sản phẩm chính là N2 và N2O, mặc dù nitrite cũng có thể tích lũy Nitrite là một yếu tố môi trường quan trọng vì nó có khả năng tạo ra các hợp chất gây ung thư (carcinogenic) như nitrosamin Hơn nữa, nitrite có thể bị chuyển hóa thành ammon nhờ vào hoạt động khử dị hóa của nhiều loài vi khuẩn khác nhau.
Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp., và Clostridium
Quá trình đồng hóa nitơ là việc sử dụng nitơ vô cơ làm nguồn dinh dưỡng để tạo ra sinh khối mới cho vi sinh vật Ion ammon có thể thâm nhập trực tiếp mà không tốn nhiều năng lượng, trong khi việc đồng hóa nitrate yêu cầu nhiều năng lượng để khử Trong quá trình này, nitrite có thể được tích lũy như một sản phẩm trung gian.
Sinh vật nhân nguyên thủy, bao gồm cả hiếu khí và kỵ khí, có một số loài có khả năng cố định nitơ, nhưng khả năng này không xuất hiện ở sinh vật nhân thực (eucaryotes) Trong môi trường hiếu khí, nhiều loài vi sinh vật tự do như Azitobacter và Azospirillum tham gia vào quá trình cố định nitơ Ngược lại, trong điều kiện kỵ khí, vi khuẩn thuộc chi Clostridium là những tác nhân chính trong việc cố định nitơ Ngoài ra, vi khuẩn lam như Anabaena và Oscillatoria cũng góp phần tăng cường hàm lượng nitơ trong môi trường nước thông qua quá trình cố định nitơ, bên cạnh đó còn có sự cố định nitơ từ mối quan hệ cộng sinh với thực vật.
Trang 5 vật và vi sinh vật Ví dụ sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần (Rhizobium,
Bradyrhizobium) với cây bộ Đậu, của xạ khuẩn Frankia với nhiều cây thân gỗ, của vi khuẩn lam Anabaena azollae với bèo hoa dâu (Azolla)
Quá trình cố định nitơ bao gồm nhiều bước khử liên tiếp, trong đó amoniac, sản phẩm của quá trình này, được chuyển hóa thành amin trong chất hữu cơ Các bước khử rất nhạy cảm với O2 và cần diễn ra trong điều kiện kỵ khí, ngay cả khi có vi sinh vật hiếu khí Để bảo vệ các enzyme cố định nitơ, nhiều cơ chế khác nhau được áp dụng, bao gồm các rào cản vật lý như dị bào tử (heterocysts) ở vi khuẩn lam.
Quá trình oxy hóa ammon thiếu oxy (quá trình anamox) sử dụng NH4+ và NO2- để sản sinh N2, giúp loại bỏ nitơ trong nước thải tại các nhà máy xử lý Điều này không chỉ giảm thiểu sự mẫn cảm với nitơ ở các hệ sinh thái nước ngọt và nước biển mà còn nhấn mạnh vai trò quan trọng của tập đoàn vi sinh vật phù du (planctomycetes) trong quá trình này.
Lượng nitơ trong quá trình tuần hoàn tính theo tỷ tấn (10 15 g) được thống kê như sau:
Trên lục địa, quá trình phản nitrate hóa đạt 0,12 kg/năm, trong khi xác hữu cơ đóng góp 300 kg/năm Ammon từ phân giải chất hữu cơ chuyển vào khí quyển là 0,075 kg/năm Cố định sinh học đạt 0,14 kg/năm, cố định công nghiệp là 0,036 kg/năm, và cố định do tia chớp là 0,004 kg/năm Ngoài ra, nitơ theo sông ra biển bao gồm NO3 – với 0,008 kg/năm và NH4 + với 0,005 kg/năm.
Trong đại dương, quá trình cố định sinh học đạt 0,10 kg N/năm, trong khi cố định do tia chớp là 0,004 kg N/năm Tổng lượng xác hữu cơ là 550 kg N, và chất vô cơ hình thành từ ammon hóa và nitrate hóa đạt 577 kg N Phản nitrate hóa diễn ra với tốc độ 0,09 kg N/năm, trong khi trầm tích ghi nhận 0,00025 kg NH4+/năm và 0,002 kg N/năm.
Quá trình chuyển hóa nitơ hữu cơ thành muối ammon được gọi là ammon hóa (ammonification) Trong quá trình này, vi sinh vật protein sẽ thủy phân các base nitơ thành amino acid, sau đó tiếp tục phân hủy thành NH3.
NH3 có thể được vi sinh vật sử dụng, và quá trình tái đồng hóa ammon (cố định sinh học) và ammon hóa (khoáng hóa) phụ thuộc vào tỷ lệ C/N trong môi trường Khi NH3 bị hạn chế, cố định sinh học trở thành quá trình chính, trong khi trong điều kiện ngược lại, khoáng hóa chiếm ưu thế Tỷ lệ C/N khoảng 20 là điểm cân bằng lý thuyết giữa hai quá trình này Trong nông nghiệp, nếu bón phân làm giảm tỷ lệ C/N xuống dưới 20, khoáng hóa sẽ vượt quá cố định sinh học Ngược lại, nếu tỷ lệ C/N cao hơn 20, cố định sinh học sẽ chiếm ưu thế hơn khoáng hóa.
Quá trình khử nitrate bao gồm khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa Khử nitrate đồng hóa:
Khử nitrate đồng hóa là quá trình sinh học trong đó nitrate được tế bào hấp thụ và khử để hình thành amon, kết hợp vào vật chất tế bào Nhiều vi khuẩn, nấm và tảo có khả năng thực hiện quá trình này Mục đích chính là sử dụng ammon trong nitrate mà không cần chất nhận electron, vì vậy hệ enzyme khử nitrate đồng hóa, bao gồm enzyme khử nitrate và enzyme khử nitrite đồng hóa, không bị ức chế bởi oxy trong khí quyển.
Khử nitrate dị hóa là quá trình sinh học trong đó nitrate được tế bào hấp thụ và sử dụng làm chất nhận electron, dẫn đến sự chuyển đổi thành ammon Quá trình này thường xảy ra trong môi trường bùn bẩn, nước thải công nghiệp, hoặc trong dạ cỏ, nơi mà nitrate dễ dàng bị khử Tuy nhiên, quá trình khử nitrate dị hóa này có thể bị ức chế bởi sự hiện diện của oxy, vì nitrate đóng vai trò là chất nhận electron.
Quá trình nitrate hóa
Quá trình nitrate hóa là quá trình loại bỏ nitơ trong chất thải, trong đó vi khuẩn chuyển hóa NH3 thành NO3- NO3- có thể được thực vật thủy sinh sử dụng làm nguồn dinh dưỡng hoặc chuyển hóa thành khí nitơ (N2) nhờ vào vi khuẩn yếm khí như Pseudomonas Quá trình này bao gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn được thực hiện bởi hai nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau.
Giai đoạn nitrite hóa: chuyển hóa NH4 + thành nitrite (NO2 –) bởi nhóm vi khuẩn nitrite hóa
Giai đoạn nitrate hóa: chuyển hóa NO2 – thành nitrate (NO3 –) bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa
Các quá trình chuyển hóa NH3 đều cần có sự tham gia của oxy và độ kiềm của nước
Hai nhóm vi khuẩn này có mối quan hệ chặt chẽ và thường xuất hiện trong tự nhiên, bao gồm môi trường đất và nước Điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của cả hai loài là môi trường có pH lớn hơn 6.
Vi khuẩn tự dưỡng hóa năng vô cơ, một loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nitrite hóa bằng cách chuyển hóa ammonium thành nitrite để phục vụ cho hoạt động sống của chúng.
Bảng 1 1 Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm nitrite hóa
Loài vi khuẩn Đặc điểm tế bào
Hình thức chuyển động tº và pH cho sinh trưởng
Phân đôi Bằng đơn mao
5- 40ºC pH = 5,8-9,5 Đất, nước ngọt, biển
Phân đôi Bằng đơn mao
Phân đôi Không di động
Phân đôi Bằng đơn mao hoặc chùm mao
Phân đôi Chuyển động chùm mao
Trong tự nhiên, vi khuẩn nitrite hóa rất đa dạng, bao gồm các loài như Nitrosococcus eanus và Nitrosococcus halophila thuộc phân lớp 𝛾 – proteobacteria, cùng với Nitrosomonas sp và Nitrosopira sp thuộc lớp 𝛽 - proteobacteria, bên cạnh đó còn có Nitrosocystis và Nitrosolobus Tất cả các vi sinh vật này đều có sự tương đồng về mặt sinh lý và sinh hóa, nhưng lại khác nhau về đặc điểm.
Trang 9 điểm hình thái và cấu trúc tế bào Tất cả đều thuộc loại tự dưỡng bắt buộc Nhưng chỉ có Nitrosomonas được ứng dụng nhiều nhất trong giai đoạn nitrite hóa
Sau quá trình nitrite hoá, amonium được chuyển hóa thành nitrite, và các vi khuẩn nitrate hóa sẽ tiếp tục chuyển đổi nitrite thành nitrate Những vi khuẩn này là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng vô cơ, trong đó có ba chi phổ biến: Nitrobacter vinogradskii, Nitrobacter agilis thuộc phân lớp 𝛼 - Proteobacteria, là những trực khuẩn thẳng, không di động và tạo thành tập đoàn khuẩn keo Ngoài ra, Nitrospina gracili và Nitrococcus mobilis thuộc phân lớp 𝛽 - Proteobacteria, có hình dạng tế bào cầu và có tiên mao Chi Nitrobacter được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và thực tiễn.
Bảng 1 2 Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Bergey, 1994)
Loài vi khuẩn Đặc điểm tế bào Hình thức sinh sản tº và pH cho sinh trưởng
Mọc chồi 20 - 30ºC pH = 7 - 8 Đất, nước ngọt, biển
Ngoài Nitrosomonas và Nitrobacter được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất thì còn có một số loài cũng có khả năng nitrate hóa: Alcaligenes, Anthrobacter,
Vi khuẩn Nitrosomonas
Vi khuẩn Nitrosomonas, hay còn gọi là vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB), đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa ammonium thành nitrite trong môi trường hiếu khí.
Vi khuẩn này thuộc lớp 𝛽 - Proteobacteria, được phát hiện và phân loại bởi các nhà khoa học trong các nghiên cứu từ năm 1984 đến 2000.
Về mặt phân loại học, các nhà khoa học đã xếp Nitrosomonas như sau:
Lớp: 𝛽 – Proteobacteria Bộ: Nitrosomonadales Họ: Nitrosomonadaceae Giống: Nitrosomonas
Trong quá trình nghiên cứu, đến nay các nhà khoa học đã xác định 10 loài của Nitrosomonas bao gồm: N.europaea, N.eutropha, N.halophila, N.communis, N.marina, N.aestuarii, N.nitrosa, N.oligotropha, N.cryotolerans, N.ureae
Hình 1 1 Vi khuẩn Nitrosomonas europea khi quan sát dưới kính hiển vi quan học (a) và (b) kính hiển vi điện tử 1.3.3 Đặc điểm hình thái
Nitrosomonas là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, có hình dạng tế bào nhỏ bé, thường là hình cầu hoặc ovan Chúng có thể di động hoặc không, với một số loài di chuyển bằng tiên mao ở đầu cực và thường tồn tại riêng lẻ, thành đội hoặc thành chuỗi Nitrosomonas phân bố rộng rãi trong nước và đất, là vi khuẩn kị ánh sáng và thường kết thành khối gọi là tập đoàn khuẩn keo.
Biên độ nhiệt từ 5 - 30ºC, thích hợp trong khoảng 5 - 30ºC Có thể chịu đựng pH từ 5,8 – 8,5
Các loài sinh vật biển được bảo vệ bởi một lớp protein bên ngoài và màng tế bào bên trong, với hàm lượng G+C trong DNA dao động từ 47,5% đến 51% Chỉ một số ít loài có khả năng sử dụng ure làm nguồn ammonium Những loài dinh dưỡng hóa năng vô cơ bắt buộc này oxy hóa NH4+ thành NO2- và sử dụng quá trình cố định CO2 để đáp ứng nhu cầu năng lượng và nguồn cacbon vô cơ Hợp chất cacbon có thể được đồng hóa trong một giới hạn nhất định và có thể kích thích sự phát triển của tế bào tự dưỡng.
Vi khuẩn Nitrobacter
Vi khuẩn Nitrobacter là loại vi khuẩn oxy hóa nitrite Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa nitrite thành nitrate trong điều kiện hiếu khí
Về mặt phân loại học, các nhà khoa học đã xếp Nitrobacter như sau:
Các loài trong chi Nitrobacter bao gồm: Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris và Nitrobacter alkalicus[9]
Nitrobacter có dạng hình que, hình bầu dục hay hình cầu Là những vi khuẩn
Gram âm là vi khuẩn nhỏ bé với kích thước khoảng 0,5 – 0,8 x 1 - 2𝜇m, có khả năng di động hoặc không di động Ví dụ, Nitrobacter winogradski không di động, trong khi Nitrobacter agilis có thể di chuyển nhờ các tiên mao hoặc tiêm mao Trong những điều kiện không thuận lợi, Nitrobacter có khả năng hình thành bào tử để tồn tại.
Trang 13 tập đoàn khuẩn keo Các vi khuẩn này không sinh bào tử, trên bản silicagel hoặc trên thạch (chứa nitrite) tạo thành những khuẩn lạc màu vàng, trong suốt và nhỏ bé (đường kính khoảng 0,2 mm) chung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải[4]
Hình 1 3 Tế bào vi khuẩn Nitrobacter winogradski quan sát dưới kính hiển vi quang học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
Ứng dụng của vi khuẩn nitrate hóa
Vi khuẩn nitrate hóa hiện đang được áp dụng rộng rãi trong xử lý nước, bao gồm nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải từ nuôi trồng thủy sản Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn nitrate hóa đóng vai trò quan trọng trong sản xuất giống và nuôi thủy sản thâm canh Quy trình này được thực hiện qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, trong đó nước thải từ các bể ương nuôi tôm cá chứa NH3 do tôm cá bài tiết sẽ được đưa vào bể lọc sinh học để xử lý Tại đây, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ tiến hành chuyển hóa.
NH4 + thành NO2 – (giai đoạn nitrite hóa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa
Quá trình nitrate hóa chuyển đổi NO2 thành NO3, giúp nước sau khi xử lý qua bể lọc sinh học trở nên hoàn toàn không độc hại cho tôm cá Nước này có thể được tái sử dụng hiệu quả trong việc ương nuôi tôm cá.
Trong quá trình nuôi, nước được tuần hoàn trong hệ thống kín mà không thay nước, chỉ bổ sung một lượng nhỏ để bù đắp cho sự bốc hơi Nhiều nước phát triển đã thành công trong việc áp dụng quy trình lọc sinh học tuần hoàn cho các loại cá như cá trê phi, cá chình, cá hồi, và cá bơn Tại Việt Nam, quy trình này phổ biến trong các trại sản xuất giống tôm càng xanh và tôm sú, đặc biệt ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Quy trình hoàn toàn dựa vào vi sinh vật tự nhiên, không sử dụng hóa chất hay kháng sinh, đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm Hệ thống kín giúp hạn chế dịch bệnh, không thay nước nên không gây ô nhiễm môi trường, đồng thời giảm lượng nước sử dụng và chi phí lao động.
Nhóm vi khuẩn nitrate hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter đã bắt đầu được ứng dụng trong sản xuất giống, mang lại lợi ích thiết thực cho nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam Những vi khuẩn này hứa hẹn sẽ đóng góp tích cực vào sự phát triển của ngành nuôi thủy sản thâm canh trong tương lai.
Nhiều quốc gia trên thế giới đã áp dụng chăn nuôi trên nền đệm lót sinh thái để tăng năng suất và bảo vệ môi trường Tại Việt Nam, các công nghệ xử lý chất thải trong ngành chăn nuôi như ủ phân compost, khí sinh học và vi sinh vật chọn lọc đang được triển khai Đặc biệt, việc sử dụng đệm lót có bổ sung chế phẩm vi sinh đang nhận được sự quan tâm Đệm lót sinh học, chủ yếu là trấu và mùn cưa, được khuyến cáo sử dụng trong chuồng chăn nuôi Sau khi đưa trấu và mùn cưa vào chuồng, một lớp hệ men vi sinh vật có ích sẽ được rải lên bề mặt, giúp tăng cường quá trình phân giải chất thải.
- Phân giải phân, nước tiểu do vật nuôi thải ra, hạn chế sinh khí hôi, thối
- Ức chế sự phát triển của hệ vi sinh vật có hại, khống chế sự lên men sinh khí hôi thối
- Phân giải một phần mùn cưa
- Giữ ấm cho vật nuôi do đệm lót luôn luôn ấm bởi nhiệt từ hoạt động của hệ men vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu và thực tiễn chăn nuôi trên nền đệm lót sinh học cho thấy:
- Đệm lót sinh học giúp tiết kiệm 80% nước trong chăn nuôi vì:
+ Không sử dụng nước rửa chuồng
+ Không sử dụng nước để tắm, rửa cho vật nuôi
+ Nước sử dụng duy nhất cho vật nuôi uống và phun giữ độ ẩm cho nền chuồng (đệm lót chuồng luôn có độ ẩm 30%)
- Đệm lót sinh học giúp tiết kiệm 60% nhân lực vì:
+ Không sử dụng nhân lực dọn, rửa chuồng hàng ngày
+ Không sử dụng nhân lực để tắm rửa cho vật nuôi
+ Chỉ sử dụng nhân lực để cho vật ăn, quan sát diễn biến trạng thái của vật nuôi
- Đệm lót sinh học giúp tiết kiệm 10% thức ăn vì:
+ Vật nuôi không bị stress từ môi trường và hoạt động tự do
Vật nuôi hấp thụ các chất dinh dưỡng từ nền đệm lót sinh thái, được hình thành qua quá trình lên men và phân giải từ phân, nước tiểu, vỏ trấu cùng với các phụ phẩm nông nghiệp đã được phơi khô và băm nhỏ.
+ Khả năng tiêu hóa hấp thụ của vật nuôi tốt hơn do con vật ăn, hít được một số vi sinh vật có lợi, vật hoạt động nhiều hơn
- Đệm lót sinh học giúp môi trường chăn nuôi không bị ô nhiễm vì:
Hệ vi sinh vật trong đệm lót có khả năng phân giải phân và nước thải từ chăn nuôi thành thức ăn, giúp loại bỏ chất thải ra môi trường.
Hệ men vi sinh vật trong chế phẩm giúp ngăn chặn mùi hôi từ phân và nước tiểu của vật nuôi bằng cách cạnh tranh và hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại cũng như các vi sinh vật gây mùi khó chịu.
+ Hạn chế ruồi, muỗi (vì không có nước để muỗi sinh sản, không có phân để ruồi đẻ trứng)
+ Các mầm bệnh nguyên nhân lây lan dịch bệnh bị tiêu diệt hoặc hạn chế tới mức thấp nhất
- Đệm lót sinh học giúp sản phẩm thịt đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm về màu, mùi, vị gần với chăn nuôi hữu cơ
+ Vật nuôi không bị stress từ môi trường và con vật vận động nhiều
+ Thức ăn không trộn các chất kích thích, vật nuôi không những không bị bệnh mà còn thu nhận được nhiều khoáng vitamin từ đệm lót sinh thái
Công nghệ chăn nuôi trên đệm lót sinh học với kỹ thuật chuồng trại và chăm sóc vật nuôi đơn giản, phù hợp với điều kiện của người chăn nuôi Việt Nam.
LIỆU THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Tại phòng Thí nghiệm và Phân tích chăn nuôi
Phân viện chăn nuôi Nam Bộ
Tọa lạc ở 12 Nguyễn Chí Thanh, Quận 10, TP Hồ Chí Minh
Nguồn vi sinh vật
Lấy 20 mẫu từ phân, bùn đất, nước thải chăn nuôi (của heo và gà) tại Trung tâm Nghiên cứu và huấn luyện chăn nuôi heo Bình Thắng và Trung tâm Nghiên cứu gia cầm VIGOVA
Chế phẩm Balasa No1: mua trên thị trường.
Nội dung nghiên cứu
Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (tập trung vào nhóm vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter) từ phân, đất, nước, chế phẩm Balasa No1
Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn vừa phân lập (môi trường, nhiệt độ, pH, nồng độ muối, thời gian nuôi cấy)
Lên men sản xuất chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải chăn nuôi ở quy mô phòng thí nghiệm.
Vật liệu thí nghiệm
Chủng vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter
2.4.2 Trang thiết bị thí nghệm
Tủ lạnh 4ºC, 5ºC, -40ºC
Kính hiển vi quang học
Máy so màu OD Ống nghiệm Đĩa petri
Bình định mức Ống đong Đũa khuấy
2.4.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm
Dung dịch H2SO4 đậm đặc
Cân 0,5 g axít sunfanilic, hoà tan trong 150 ml axít acetic 10%, khuấy đều, để yên, bảo quản trong chai màu có nút gài
Hoà tan 0,1 g a-Naphtylamin trong 20 ml nước cất, khuấy đều và đun sôi Sau đó, để dung dịch lắng, gạn lấy phần trong và thêm 150 ml axít acetic 10%, lắc đều và bảo quản trong chai màu có nút mài.
Dung dịch tiêu chuẩn nitrit
Dung dịch gốc A có độ chuẩn 1 mg NO2/ml:
Để chuẩn bị dung dịch Natri nitrite (NaNO2) chính xác, cân 0,1478 g Natri nitrite, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm nước đến vạch và lắc kỹ Cuối cùng, bảo quản dung dịch trong chai màu có nút mài.
Dung dịch làm việc B có độ chuẩn 0,01 mg NO2/ml:
Pha loãng dung dịch gốc A ra 100 lần bằng nước Dung dịch làm việc B chỉ dùng trong 1 ngày[18]
Chỉ thị Diphenylamin (C12H11N) 1%: cân 1g chỉ thị + 100 ml H2SO4 đậm đặc[22]
Pha loãng dung dịch gốc ra 100 lần bằng nước Dung dịch chỉ thị pha loãng chỉ dùng trong 1 ngày
Môi trường thạch cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn được sử dụng trong quá trình phân lập bao gồm môi trường Winogradski I và Winogradski II, với các thành phần cụ thể là (g/l):
Winogradski I : Môi trường phân lập Nitrosomonas
Winogradski II : Môi trường phân lập Nitrobacter
Môi trường được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút Điều chỉnh pH của môi trường bằng giấy quỳ b) Môi trường lấy mẫu
Pha 100 ml môi trường lấy mẫu có thành phần như sau:
Cho vào 10 ống nghiệm có nắp mỗi ống 10 ml c) Môi trường tăng sinh
Phương pháp
Dùng tăm bông vô trùng quẹt lấy mẫu rồi cho vào ống nghiệm, đậy nắp và ghi số, đánh dấu mang về phòng thí nghiệm
Trang 22 Đối với chế phẩm Balasa No1 thì tăng sinh bằng cách cân 5 g mẫu pha với
95 ml nước pepton trong bình tam giác Sau đó đem bình đi lắc 150 vòng/phút
Các mẫu được cấy vào môi trường Winogradski I và II, nuôi ở 30ºC trong 3 ngày đến 1 tuần Sau khi quan sát, nếu có khuẩn lạc rời rạc, trắng ngà, tròn, lồi và trơn bóng, sẽ tiếp tục cấy chuyền sang đĩa môi trường khác Quá trình này lặp lại 2-3 lần cho đến khi có giống thuần Cuối cùng, chọn khuẩn lạc đặc trưng nhất và cấy vào môi trường thạch nghiêng để bảo quản trong tủ đông -40ºC.
2.5.3 Phương pháp định danh Định danh bằng cách kiểm tra các đặc điểm sinh hóa
Sau khi đã có khuẩn lạc thuần, kiểm tra khả năng chuyển hóa amon thành nitrite được xác định bằng thuốc thử Griess – llosvay
Dùng que cấy vòng lấy sinh khối trong mỗi bình mẫu môi trường nuôi cấy
Winogradski I và 2 mẫu đối chứng âm và dương cho lên lame
Dùng thuốc thử Griess A và B nhỏ vào các mẫu trên lame
Quan sát được Đổi màu hồng => (+) có vi khuẩn Nitrosomonas phát triển
Kiểm tra khả năng chuyển hóa nitrite thành nitrate được xác định bằng thuốc thử Diphenylamin
Dùng que cấy vòng lấy sinh khối trong mỗi bình mẫu môi trường nuôi cấy
Winogradski II và 2 mẫu đối chứng âm và dương cho lên lame
Xanh lơ sậm => rất nhiều nitrate, có vi khuẩn Nitrobacter phát triển
Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn gram (+) và gram (-) được quy định bởi vách tế bào để tiến hành nhuộm gram
Để chuẩn bị vết bôi, sử dụng que cấy vô trùng để lấy một ít vi khuẩn từ thạch sau 24 giờ cấy, sau đó hòa vào 1 giọt nước cất đặt ở giữa phiến kính và để khô trong không khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần
Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí
Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ hồng[19]
Dùng kính hiển vi xác định hình dạng tế bào, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, mép khuẩn lạc, nhẵn, có nhân không
Có thể kết luận khuẩn lạc là Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp Có thể định danh đến loài
2.5.4 Phương pháp đo độ đục (OD)
Sinh trưởng vi sinh vật được theo dõi bằng cách đo mật độ tế bào ở bước sóng 600nm trên máy đo so màu Kết quả OD cung cấp thông tin về độ đục của môi trường nuôi cấy, từ đó cho phép so sánh lượng sinh khối một cách hiệu quả.
Trang 24 giữa các dịch canh trường Đây là phương pháp đơn giản, cho kết quả nhanh nhưng kết quả chỉ mang tính so sánh giữa các mẫu có môi trường tương tự nhau
2.5.5 Phương pháp xác định hàm lượng nitrite (phương pháp Griess llosvay hay Diazonium) [3]
Nitrite (NO2 –) trong môi trường axít mạnh sẽ hình thành HNO2, HNO2 mới hình thành sẽ kết hợp với axít sulfanilic cho ra muối Diazonium sulfanilic
NO2 + 2HCl + HSO3-C6H4-NH2 HSO3-C6H4N=N-Cl + NaCl + H2O
Sau đó muối diazonium sulfanilic sẽ kết hợp với thuốc thử 𝛼- napthylamine cho ra 𝛼- napthylamine diazonium sulfanilic
HSO3-C6H4-N=N-Cl + C10H9NH2 HSO3-C6H4-N=N-C10H8NH2 + HCl
Hợp chất 𝛼-napthylamine diazonium sulfanilic có màu hồng, với độ đậm nhạt phụ thuộc vào hàm lượng NO2 trong mẫu ban đầu Nồng độ của hợp chất này được xác định bằng máy so màu quang phổ tại bước sóng 530 nm, thông qua phương pháp Griess llosvay, Diazonium.
PRE 2: Cân 5 g sulfanilic axít và 250 g natri acetate hòa tan với nước cất thành 500 ml
PRE 2: hòa tan 0,5 g 1-napthylamine và 25 ml acetic axít với nước cất thành
Dung dịch A: Hòa tan 100 ml PRE 1 với 100 ml PRE 2
Dung dịch B: Dung dịch acetic axít nguyên chất
Dung dịch NaNO2 500 mg/l: hòa tan 0,2463 g NaNO2 trong 100 ml nước cất Dung dịch NaNO2 5 mg/l: hòa tan 1 ml dd NaNO2 500 mg/l với nước cất thành 100 ml
Chọn 6 bình tam giác có dung tích 100 ml, cùng kích thước, không màu lần lượt cho vào các hóa chất sau:
Bảng 2.1 Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrite bằng phương pháp Griess llovay, Diazonium
STT Nồng độ mẫu chuẩn
Thể tích dung dịch NaNO2 5 mg/l (ml)
Thể tích nước cất (ml)
Để làm đường chuẩn, bạn cần đong lần lượt 20 ml từng nồng độ chuẩn vào 6 bình tam giác đã được ký hiệu Sau đó, hãy đong 20 ml mẫu cần đo vào một bình tam giác riêng biệt.
Lần lượt cho thuốc thử vào: 1 ml thuốc thử A và 5 ml thuốc thử B
Chờ 40 phút dung dịch sẽ có màu hồng nếu có nitrite (màu sẽ ổn định sau 40 phút đến 4 giờ), ta đem so màu ở bước sóng 530 nm
Nếu màu hồng quá đậm, cần pha loãng để đạt được kết quả chính xác Sau khi ghi kết quả từ máy, việc áp dụng hệ số pha loãng sẽ giúp xác định nồng độ mẫu cần đo.
Quá trình tính toán kết quả tương tự như ở phương pháp Indophenol blue để đo TAN
Các mẫu chuẩn được sử dụng để đo độ hấp thụ quang, từ đó xác định nồng độ C tương ứng với độ hấp thụ quang A Dựa vào mối tương quan này, chúng ta có thể thiết lập phương trình A = aC + b.
C: Nồng độ của mẫu (mg/l)
Sau khi thiết lập phương trình, chúng ta tiến hành đo độ hấp tụ quang của mẫu phân tích Dựa vào kết quả này, chúng ta có thể tính toán nồng độ của TAN có trong mẫu.
2.5.6 Phương pháp xác định hàm lượng nitrate (phương pháp Salycilate)[3]
Dung dịch A – Hòa tan 5 g natri salicylate thành 1000 ml với nước cất
Dung dịch B – Dung dịch H2SO4 98%
Dung dịch C – Hòa tan 100 g C4H4KNaO6.4H2O thành 1000 ml với nước cất
Dung dịch D – Dung dịch NaOH 10N: hòa tan 400 g NaOH thành 1000 ml với nước cất
Dung dịch KNO3 500 mg/l: hòa tan 0,3609 g KNO3 trong 100 ml nước cất Dung dịch KNO3 50 mg/l: hòa tan 10 ml dd KNO3 500 mg/l thành 100 ml với nước cất
Chọn 6 bình tam giác có dung tích 100 ml, cùng kích thước, không màu lần lượt cho vào các hóa chất sau:
Bảng 2.2 Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrate bằng phương pháp Salycilate
STT Nồng độ mẫu chuẩn
Thể tích dung dịch KNO3 50mg/l (ml)
Thể tích nước cất (ml)
Làm đường chuẩn: đong lần lượt 10 ml từng nồng độ chuẩn cho vào 6 bình tam giác có ký hiệu nồng độ đã chuẩn bị
Lấy 10 ml mẫu cho vào bình tam giác khác
Cho vào 1 ml thuốc thử A, đem sấy ở 105ºC cho đến cạn, để nguội
Cho vào 1 ml thuốc thử B
Cho tiếp 20 ml thuốc thử C
Và 5 ml thuốc thử D, dung dịch sẽ có màu vàng anh nếu có nitrate
Chờ 15 phút xuất hiện màu vàng anh (ổn định sau 15 phút đến 6 giờ), sau đó đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 410 nm
Khi màu vàng anh quá đậm, cần pha loãng mẫu để đạt kết quả chính xác Sau khi ghi lại kết quả từ máy, sử dụng hệ số pha loãng để tính nồng độ mẫu cần đo Ghi lại giá trị độ hấp thụ quang A và áp dụng phương trình hồi quy để xác định nồng độ chính xác của mẫu.
2.5.7 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường đặc
Theo phương pháp trong Giáo trình bài giảng TH Các phương pháp phân tích vi sinh của ThS Phạm Minh Nhựt (2014), chúng tôi đã tiến hành thực hiện các thao tác phân tích vi sinh, đồng thời điều chỉnh một số bước để phù hợp với yêu cầu cụ thể của nghiên cứu.
Mổi công thức đổ 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 đĩa, lặp lại 3 lần
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường Winogradski I (chủng vi khuẩn Nitrosomonas) và Winogradski II (chủng vi khuẩn Nitrobacter)
- Dịch pha loãng: nước muối sinh lý 0,85%
Để tiến hành pha loãng mẫu, sử dụng micropipette vô trùng hút 1ml mẫu và cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng Lắc đều hỗn hợp để tạo ra dịch pha loãng với tỷ lệ 10^-1 Tiếp tục quy trình này để đạt được các độ pha loãng cần thiết.
Sau khi pha loãng dịch mẫu, chọn 3 mẫu pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ
Để tiến hành cấy vi sinh vật, đầu tiên chuẩn bị từ 25 đến 250 tế bào vi sinh vật Sử dụng micropipette để hút 1 ml dịch pha loãng và cho vào đĩa petri vô trùng, với mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa Sau khi cấy, đổ 10-15 ml môi trường đã nấu chảy và làm nguội đến 55 ± 5 độ C vào mỗi đĩa Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay đĩa petri theo cả hai chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ Cuối cùng, đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để thạch đông và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Trang 29 Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 để tính Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1 ml dịch mẫu ban đầu được tính theo công thức
1Vf 1 + … + n i Vf i Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
F: độ pha loãng tương ứng
2.5.8 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa nitơ
2.5.8.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH pH là yếu tố môi trường có tính chất quan trọng pH quá thấp hay quá cao cũng đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nitrate hoá, tiến hành nuôi cấy trong các bình tam giác 100 ml chứa 50 ml môi trường Winogradski I (chủng S18) và Winogradski II (chủng B6) được điều chỉnh pH lần lượt: 6; 7; 8; 9 Giá trị của pH được điều chỉnh bằng axít acetic hoặc NaOH 1N, nuôi lắc 200 vòng/phút Sau 48 giờ, xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp cấy trang đếm số khuẩn lạc trên môi trường đặc
