Tính cấp thiết của đề tài
Nông nghiệp là một phần thiết yếu của nền kinh tế Việt Nam, nhưng người nông dân đang phải đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc kiểm soát sâu bệnh gây hại cho cây trồng.
Việc sử dụng hóa chất tổng hợp trong nông nghiệp đã giúp ngăn ngừa sâu bệnh hiệu quả, nhưng việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, gây hại cho môi trường và sức khỏe con người Sự tồn đọng hóa chất trong nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng và cản trở khả năng xuất khẩu, từ đó tác động tiêu cực đến thu nhập của nông dân Để giảm thiểu những tác động xấu này, xu hướng sử dụng chế phẩm sinh học ngày càng phát triển, vì chúng an toàn cho con người, gia súc và môi trường, đồng thời không tiêu diệt các thiên địch có ích Nấm Paecilomyces đang được nghiên cứu như một giải pháp tiềm năng nhờ hiệu lực diệt sâu cao và tính an toàn với môi trường.
Mặc dù nấm Paecilomyces sp có nhiều lợi ích trong việc phòng trừ sâu hại cây trồng, nhưng nghiên cứu và ứng dụng của loài nấm này tại Việt Nam vẫn còn hạn chế Việc sản xuất chế phẩm nấm để kiểm soát sâu hại đang trở thành một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học, thúc đẩy nhu cầu nghiên cứu sâu hơn về loài nấm này Do đó, đề tài "Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces sp để phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng" được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng của nấm trong nông nghiệp.
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu tìm kiếm môi trường sản xuất nấm Paecilomyces sp và đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm này đối với một số loài sâu hại, nhằm làm cơ sở cho việc ứng dụng chủng nấm trong nông nghiệp.
Paecilomyces lilacinus trong phòng trừ sâu hại cây trồng.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập lại chủng Paecilomyces lilacinus trên rệp
- Xác định môi trường nhân sinh khối thích hợp để sản xuất bào tử nấm
- Khảo sát ảnh hưởng của một số loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus
- Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Paecilomyces trên một số loài sâu hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
- Đánh giá khả năng gây chết rệp muội nâu đen Texopter sp trên vườn hồ tiêu, xã Đakia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu sẽ được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2016 tại phòng thí nghiệm thuộc khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường của Đại Học Công Nghệ.
Vật liệu
- Panh, chổi lông bắt sâu
- Các loại cốc thủy tinh
- Môi trường tổng hợp PDA
Chủng nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Đại học Công Nghệ TpHCM – HUTECH.
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Ống giống
Lây nhiễm lại trên rệp
Phân lập lại nấm từ rệp bị chết
Nhân giống trên môi trường PDA
Lên men tạo chế phầm
Thử hiệu lực trên rệp sáp, rầy nâu, rệp muội
Cấy vào ống thạch nghiên giữ giống
2.3.1 Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên rệp sáp
Thu bọ phấn trắng từ đồng và nuôi trên lá được quấn bằng bông hút ẩm để giữ lá tươi Phun nấm Paecilomyces lilacinus, phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014), lên rệp sáp và quan sát hàng ngày Rệp sáp bị chết được cho vào đĩa petri có giấy ẩm, thu thập các cá thể chết bao bọc bởi sợi nấm trắng Cuối cùng, tiến hành phân lập nấm ký sinh trên môi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997).
Bước 1: Nấu môi trường PDA, sau đó đem hấp tiệt trùng 121 o C (áp suất 1atm), trong thời gian 15 phút, sau đó để nguội 50 o C và bổ sung kháng sinh Chloramphenicol
(1 g/l) Đổ môi trường ra đĩa đã được hấp vô trùng và để nguội
Bước 2: Cấy phân lập nấm bao gồm việc vệ sinh mẫu rệp sáp bị ký sinh, sử dụng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn Sau khi làm nguội, chấm nhẹ que cấy vào điểm có bào tử đặc trưng của nấm ký sinh trên cơ thể bọ, đảm bảo không bị nhiễm tạp trước khi tiến hành cấy.
Để tiến hành cấy phân lập nấm, cần nhẹ nhàng đặt mẫu lên bề mặt môi trường Sau 2 – 3 ngày ủ trong phòng thí nghiệm, khi khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện, tiến hành tách cấy ra các đĩa môi trường khác nhau nhằm thuần chủng.
2.3.1.2 Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) a) Quan sát hình thái khuẩn lạc
Quan sát hình thái đại thể của các chủng nấm thông qua mô tả đặc điểm tản nấm khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng là rất quan trọng Các chủng nấm được phân lập sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và ủ trong 2 tuần để theo dõi sự phát triển.
Quan sát các đặc điểm của nấm bao gồm kích thước tản nấm để đánh giá tốc độ phát triển, dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm ở cả mặt trước và mặt sau, màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra, cũng như thời gian hình thành bào tử trong quá trình nuôi ủ.
35 b) Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phòng ẩm)
Phương pháp làm phòng ẩm:
Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng, sau đó đặt mảnh giấy lọc vào bên trong Tiếp theo, đặt hai thanh đũa tre lên mảnh giấy lọc và đặt lame cùng lamelle lên trên hai thanh đũa tre.
Sử dụng dao mổ vô trùng, cắt một khối thạch 1cm x 1cm từ đĩa môi trường PDA và đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy Tiếp theo, dùng dây cấy đã khử trùng để lấy sinh khối nấm Paecilomyces sp và cấy vào 4 mặt bên của khối thạch Sau khi đậy lamelle lên trên khối thạch, nhỏ nước cất vô trùng để ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa Cuối cùng, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử, thường mất khoảng 2 tuần.
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle từ khối thạch và đặt lên một lam sạch có một giọt Methylene blue Sau đó, mẫu được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng thích hợp.
Sợi nấm có thể có hoặc không có sự phân nhánh và vách ngăn, điều này ảnh hưởng đến đặc điểm hình thái của chúng Hình dạng cuống bào tử cũng là một yếu tố quan trọng cần xem xét Ngoài ra, đặc điểm hình dạng, màu sắc và kích thước của bào tử cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại và nhận diện các loại nấm khác nhau.
2.3.2 Xác định môi trường nhân sinh khối tạo chế phẩm
Thí nghiệm xác định môi trường nhân giống được bố trí với 4 công thức tương ứng với 4 loại môi trường đang được dùng phổ biến hiện nay:
CT1: Môi trường cám gạo
CT3: Môi trường ngô mảnh
CT4: Môi trường gạo tấm
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, và mỗi lần nhắc lại tương ứng với một chai môi trường nhân sinh khối nấm, chứa các thành phần phù hợp với từng công thức thí nghiệm.
Cân 100g môi trường và phân phối vào chai 500ml, sau đó bổ sung 60ml nước chứa kháng sinh chloramphenicol với nồng độ 1 g/l Sử dụng bông gòn không thấm nước để làm nút chai, sau đó hấp tiệt trùng ở 121 oC, 1 atm trong 15 phút và để nguội.
Mật độ cấy giống ban đầu 1,66x10 7 CFU/g, lên men ở nhiệt độ phòng, thời gian lên men 14 ngày
Chỉ tiêu theo dõi là số lượng bào tử, được xác định sau 14 ngày nuôi cấy Phương pháp thực hiện bao gồm pha loãng sinh khối và cấy trang trên môi trường PDA, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa.
2.3.3 Ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm
Công thức Hoạt chất Liều sử dụng
5 Đối chứng Không bổ sung thuốc
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần một đĩa petri, thực hiện trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ phòng
– Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy
Nguồn nấm Paecilomyces lilacinus: Chủng Paecilomyces lilacinus được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày
Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở
Nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong 15 phút sẽ được làm nguội xuống 50°C trước khi bổ sung các loại thuốc bảo vệ thực vật theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất Sau đó, tiến hành nuôi cấy bằng cách đổ môi trường vào đĩa petri và để nguội cho đến khi đông lại Sử dụng que cấy, đục lỗ có đường kính 5 mm từ miếng thạch chứa nấm Paecilomyces sp đã chuẩn bị và đặt vào vị trí trung tâm của đĩa môi trường.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi
– Đo đường kính tản nấm (cm) ở các ngày sau cấy đến khi tản nấm ở công thức đối chứng chạm thành đĩa thì ngừng theo dõi
– Đường kính trung bình tính theo công thức: 1 2
Đường kính khuẩn lạc (cm) và tỷ lệ phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với mẫu đối chứng được tính theo công thức: I = [(C-T)]/C]x100, trong đó d1 và d2 là hai đường chéo của khu vực phân bố nấm.
Trong đó: I: % khuẩn lạc bị ức chế
C: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng
T: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc
Đánh giá cấp độ ảnh hưởng của thuốc theo (Hassan,1989)
- Cấp 1: không ảnh hưởng (