T ı́ nh c ấ p thi ế t c ủa đề t à i
Vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệ sức khỏe con người Ở Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và độ ẩm không khí cao, điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển, gây nhiễm độc thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, dẫn đến nguy cơ độc hại cho con người và gia súc, đặc biệt là tổn thương gan và ung thư gan Tình trạng phơi nhiễm nấm mốc ảnh hưởng đến 25% mùa màng toàn cầu, gây thiệt hại trung bình 418 triệu đô la và tác động đến gia súc 472 triệu đô la mỗi năm (theo Bộ Nông Nghiệp Mỹ, 2009) Tại Việt Nam, hàng năm, khoảng 13-16% lượng nông sản bị ảnh hưởng tùy loại.
Trước thực trạng gia tăng các bệnh nhiễm nấm, con người đang tìm kiếm các hoạt chất sinh học an toàn và hiệu quả Một trong những chủng vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩn này không chỉ có hoạt tính sinh học cao mà còn an toàn cho sức khỏe, có khả năng tiêu diệt các vi sinh vật có hại và duy trì sự cân bằng vi khuẩn trong đường ruột.
Vi khuẩn lactic mang lại nhiều lợi ích, đặc biệt trong việc ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm và hư hại nông sản do nấm mốc gây ra hàng năm Vì vậy, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài "Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê" nhằm tìm ra giải pháp hiệu quả cho vấn đề này.
Tình hình nghiên c ứ u
Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như:
- Năm 2005, Johan Schnürer và Jesper Magnusson đã thực hiê ̣n nghiên cứu “Sự kháng nấm ở vi khuẩn lactic là chất bảo quản sinh ho ̣c”
- “Tiềm năng kháng nấm ở thực phẩm của vi khuẩn lactic” vào năm 2007 của S Rouse cùng cô ̣ng sự
Vào năm 2008, Rosalia Trias cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu mang tên “Vi khuẩn lactic từ trái cây và rau củ là tác nhân kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh là nấm và vi khuẩn trên cây trồng” Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò của vi khuẩn lactic trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các mầm bệnh, mở ra hướng đi mới trong quản lý sinh học nông nghiệp.
Nghiên cứu của Nevena Blagojev và cộng sự (2011) đã chỉ ra khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc và sản sinh độc tố mycotoxin bằng hợp chất của vi khuẩn lactic Tại Việt Nam, có nhiều công trình nghiên cứu liên quan, như chế phẩm EM được ứng dụng trong bảo vệ cây trồng và thuỷ sản, cùng với chế phẩm Sadi Bio 1, một loại chế phẩm vi sinh Biomix.
Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1, được phát triển bởi Viện Công nghệ Môi trường Việt Nam, chứa các vi sinh vật hữu ích từ nhóm xạ khuẩn Streptomyces, có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào và kháng sinh để ức chế nấm mốc cùng vi khuẩn Gram âm Bên cạnh đó, sản phẩm còn bao gồm vi khuẩn Lactobacillus, giúp ngăn chặn hiệu quả các vi khuẩn gây bệnh Sagi Bio-1 đặc biệt hiệu quả trong việc xử lý mùi hôi từ chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải.
M ục đích nghiên cứ u
Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic.
M ụ c tiêu nghiên c ứ u
Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống đã được thực hiện, nhằm đánh giá hiệu quả của chúng trong việc bảo quản hạt cà phê Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tính kháng nấm của Lactobacillus spp mà còn mở ra hướng ứng dụng mới trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong việc kéo dài thời gian bảo quản hạt cà phê.
N ộ i dung nghiên c ứ u
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp HCP2
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm
3 Ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp trong bảo quản ha ̣t cà phê.
Phương pháp nghiên cứ u
Phương pháp luận
Nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối với nấm gây hư hỏng thực phẩm và sinh độc tố đã dẫn đến việc tìm hiểu các tác nhân ức chế nấm Sau khi xác định được rằng tác nhân gây ức chế là hợp chất thứ cấp, quá trình trích ly và thu hoạt chất sẽ được tiến hành để ứng dụng trong bảo quản đậu phộng bị nhiễm nấm mốc.
Phương pháp xử lý số liệu
Phần mềm Excel để vẽ đồ thị
Phần mềm thống kê SAS 9.4.
K ế t qu ả đạt đượ c
Xác định khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp đối với chủng nấm mốc Aspergillus spp HCP2 phân lập từ hạt cà phê
Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp được nuôi cấy trên môi trường MRS Agar cải tiến và đã được ứng dụng thành công trong việc bảo quản hạt cà phê thông qua các sản phẩm khác nhau của vi khuẩn này.
TỔ NG QUAN
Tổng quan về nấm sợi
Nấm, thuộc giới Fungi trong hệ thống phân loại của R.H Whittaker (1996), là một phần quan trọng của ngành nấm (Euphycophyta) và là đối tượng nghiên cứu của nấm học (Mycology) Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, từ đất, nước đến không khí và chuồng nuôi, và đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì vòng tuần hoàn vật chất nhờ khả năng phân giải các hợp chất như cellulose, protein, lipid và chitin.
Vi nấm (Micro fungi) là những loại nấm không có mũ nấm, có thể nhìn thấy bằng mắt thường Chúng được phân loại dựa trên hình thái thành hai loại chính: nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous fungi), còn được biết đến với tên gọi nấm mốc.
1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra
1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền (2009), trong số 300 loại độc tố vi nấm đã được xác định, chỉ có 20 loại ảnh hưởng đến sức khỏe con người, trong đó 15 loại có khả năng gây ung thư Trong nhiều năm, chúng ta đã không chú ý đến nguy cơ bệnh tật từ thực phẩm bị nhiễm nấm mốc Đến những năm 1960, các nhà khoa học đã khẳng định rằng con người có thể bị bệnh chỉ từ việc tiêu thụ một lượng nhỏ thực phẩm nhiễm mốc, với các độc tố chủ yếu được tiết ra từ nấm mốc.
5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm:
Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), Ochratoxin A,
Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và Acid cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon
Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin
Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether alternarion
Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà
Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, chủ yếu ảnh hưởng đến gan và thận Các triệu chứng có thể bao gồm sự xuất hiện của u gan, thoái hóa tế bào gan và xơ hóa Mycotoxin không chỉ phá hủy tế bào gan và thận mà còn tác động trực tiếp đến hệ miễn dịch, gây ăn mòn niêm mạc ruột và dạ dày Thêm vào đó, người bệnh có thể gặp phải các dấu hiệu như tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận.
Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết
Một số độc tố như aflatoxin, ochratoxin và fumonisin gây ra hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu và hiện tượng tiêu máu, rất nguy hiểm cho cả động vật và con người Những độc tố này không chỉ làm suy yếu hệ thống miễn dịch mà còn có khả năng gây biến dị, ung thư và quái thai.
Độc tố nấm mốc gây ra sự mất cân bằng trong quá trình chuyển hóa thức ăn và làm giảm tỷ lệ sinh sản Chúng còn có các dẫn xuất độc hại đối với hệ thần kinh, gây tổn thương cho hệ cơ và dẫn đến nhiều hội chứng khác nhau như bệnh ngoài da, chứng tăng sừng hóa và sảy thai.
Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố
Các chủng nấm mốc sinh ra aflatoxin chủ yếu thuộc loài Aspergillus, với ba chủng chính là A.flavus, A.parasiticus và A.nomius Aflatoxin có bốn dẫn xuất quan trọng, bao gồm AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2, trong đó aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất trong nông sản, gây ngộ độc nhanh chóng và có tác hại nghiêm trọng nhất.
Aflatoxin gây ngộ độc cấp tính ở người qua đường ăn uống với triệu chứng như xuất huyết, huỷ hoại gan, phù nề và có thể dẫn đến tử vong Khi hấp thu ở liều lượng thấp đến trung bình trong thời gian dài, triệu chứng khó nhận biết nhưng có thể bao gồm chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân và ngộ độc mãn tính trên gan, dẫn đến ung thư gan Ở động vật, triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu qua các vụ ngộ độc tự nhiên và thí nghiệm, cho thấy ngộ độc mãn tính có tính di truyền với ba kiểu: ung thư, quái thai và đột biến Hậu quả của nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc, với động vật non có khả năng mẫn cảm cao hơn.
Aflatoxin B1 là độc tố chủ yếu và là một trong những chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong nhóm aflatoxin Chất này có khả năng hình thành khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh.
Patulin, hay còn gọi là Clavaxin, ban đầu được biết đến như một loại thuốc chữa cảm lạnh Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng, người ta đã phát hiện ra độc tính của hợp chất này Patulin là một hợp chất không màu, có tính kết tinh và dễ tan trong nước cũng như các dung môi phân cực Hợp chất này có thể được tách ra từ ngũ cốc, các sản phẩm dạng hạt và hoa quả.
Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và
Bysschchlamys tạo ra Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A clavatus, A giganteus, P exppansum, P urticae, P griceofulvum
Patulin là một độc tố có khả năng gây ung thư cho cả người và động vật, đồng thời làm suy giảm hệ miễn dịch Nó có thể gây ra các triệu chứng như xung huyết và loét niêm mạc, đặc biệt là ở ruột Nghiên cứu cho thấy patulin còn gây tổn hại cho DNA và nhiễm sắc thể ở con người.
Fumonisin, một độc tố mới được phát hiện do nấm Fumonisin moniliorme tổng hợp, đang ngày càng thu hút sự chú ý do tính độc hại cao của nó đối với cả động vật và con người Sự gia tăng mối quan tâm về fumonisin phản ánh những nguy cơ tiềm tàng mà độc tố này mang lại trong lĩnh vực an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.
Fumonisin B1 là một loại độc tố mạnh, có thể gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng như tổn thương não, suy gan, mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà và suy tim cấp ở khỉ Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư đã phân loại fumonisin B1 vào nhóm 2B, tức là các hợp chất có khả năng gây ung thư cho con người Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra mối liên hệ giữa việc tiêu thụ thực phẩm nhiễm fumonisin và bệnh ung thư thực quản Độc tính của fumonisin B1 có liên quan chặt chẽ đến sự ảnh hưởng của nó lên quá trình trao đổi chất của sphingolipid, bao gồm tổng hợp mới, tích lũy sphingolipid tự do và tăng hàm lượng lipid cũng như sphingosin Đặc biệt, tế bào gan nhạy cảm hơn với hoạt động của fumonisin so với tế bào thận.
1.1.3 Các cách kh ử nhiễm độc tố
1.1.3.1 Phương pháp vật lý học
T ổ ng quan v ề vi khu ẩ n lactic
1.2.1 Gi ới thiệu vi khuẩn lactic
1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus
Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 25 đến 35°C và có khả năng chịu đựng điều kiện khô hạn cũng như bền vững với CO2 và etylic Nhiều loài vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường có nồng độ cồn từ 10-15% hoặc cao hơn, trong khi một số trực khuẩn còn có khả năng sống sót trong môi trường có 7-10% NaCl Chúng cũng có hoạt tính protease mạnh mẽ, giúp phân hủy protein thành peptide và acid amin, với mức độ hoạt tính khác nhau giữa các loài, thường cao hơn ở các trực khuẩn.
Vi khuẩn lactic được phân loại theo hình dạng tế bào thành hai loại chính: hình cầu và hình que Các tế bào hình cầu có đường kính từ 0,5 - 1,5μm, thường xếp thành cặp hoặc chuỗi với chiều dài khác nhau Trong khi đó, tế bào hình que, hay còn gọi là trực khuẩn lactic, có kích thước từ 1 - 8μm và có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, với kích thước thay đổi tùy theo từng loài.
Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:
Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,
Các loài Lactobacillus xuất hiện trong nhiều sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong sữa Chúng cũng có mặt trong ruột, hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục của con người Các thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng thường chứa các vi khuẩn này.
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm:
Nhóm I, được gọi là Thermobacterium, là nhóm vi khuẩn lên men đồng hình bắt buộc, sở hữu enzyme fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng có khả năng lên men hexose để tạo ra acid lactic, nhưng không thể lên men pentose, và phát triển tốt ở nhiệt độ 45°C.
Nhóm II của vi khuẩn Streptobacterium thực hiện quá trình lên men dị hình tùy ý, trong đó có sự hiện diện của FDPaldolase và phosphoketolase Quá trình lên men này cho phép hexose lên men đồng hình, trong khi pentose được chuyển hóa thành acid lactic, ethanol hoặc acetic.
Nhóm III bao gồm các vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, được gọi là Betabacterium Chúng có enzym phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase, cho phép quá trình trao đổi chất diễn ra với cả hexose và pentose trong quá trình lên men.
1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau
Vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng nhiều loại carbohydrate, từ monosaccharide như glucose và fructose, đến disaccharide như saccharose, lactose và maltose, cũng như polysaccharide như tinh bột và dextrin Chúng sử dụng nguồn cacbon này không chỉ để cung cấp năng lượng mà còn để xây dựng cấu trúc tế bào và làm nguyên liệu cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric và acetic.
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ của vi khuẩn lactic rất đa dạng, với mỗi loài có yêu cầu khác nhau Hầu hết các vi khuẩn này không thể tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ, do đó, để phát triển, chúng cần sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ mà vi khuẩn lactic có thể tận dụng bao gồm cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa và peptone.
Vitamin là yếu tố thiết yếu trong quá trình trao đổi chất của tế bào, đóng vai trò như các coenzyme quan trọng cho hoạt động sống Tuy nhiên, hầu hết các loài vi khuẩn lactic không thể tự tổng hợp vitamin, do đó cần bổ sung vitamin vào môi trường để đảm bảo sự phát triển và hoạt động của chúng.
Vi khuẩn lactic không chỉ cần acid amin và vitamin mà còn cần các hợp chất hữu cơ khác như base nitơ và acid hữu cơ để phát triển Một số acid hữu cơ, chẳng hạn như acid citric và acid oleic, có tác động tích cực đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic Do đó, hiện nay, các muối citrate và dẫn xuất của acid oleic thường được sử dụng làm thành phần trong môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic cần các muối vô cơ để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ Những muối này cung cấp các nguyên tố khoáng thiết yếu như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie và mangan, trong đó magie và mangan đóng vai trò đặc biệt quan trọng.
17 tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào
Vi khuẩn lactic có khả năng tồn tại trong cả môi trường có oxy và không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự phát triển của sinh khối vi khuẩn diễn ra nhanh hơn so với điều kiện kị khí.
1.2.2 Kh ả năng sinh các chất kháng khuẩn
1.2.2.1 Bacteriocins Đa số các bacteriocin của vi khuẩn LAB có trọng lượng nhỏ ( 30 kDa), có tính thấm nước, không ổn định nhiệt và không được nghiên cứu rộng rãi
Lớp 4: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì còn có thêm chất khác
Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012)
Nisin Vi khuẩn gram dương
Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus dysgalaciae Enterococcus feacalis Propionibacterium acne
L acidphilus spp Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương
L plantarum spp Plantaricin EF, Plantaricin W,
L casei spp Lactocin 705 Listeria monocytogenes
1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác
Các vi khuẩn sinh acid lactic còn có khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngoài bacteriocins
Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB
Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng
Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm
Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa
Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein
Hệ thống lactoperoxidase với H 2 O2 Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa)
Lysozyme Vi khuẩn gram dương
Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men
Diacetyl Vi khuẩn gram âm
Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau
1.2.3 Kh ả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic
1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic
Khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic chủ yếu liên quan đến việc ức chế các vi sinh vật khác thông qua cạnh tranh dinh dưỡng và sản xuất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Nhiều nghiên cứu đã xác nhận khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế của chúng Đặc biệt, hoạt động kháng nấm của L coryniformis cho thấy tính ổn định cao khi ở nhiệt độ cao và pH từ 3-4,5 (Magnusson và Schnurer).
Nghiên cứu về khả năng kháng nấm của các vi khuẩn axit lactic (LAB) chủ yếu tập trung vào việc sản xuất protein kháng nấm hoặc các hợp chất proteinaceous Đặc biệt, một số chủng LAB như L plantarum và L sanfrancisco nổi bật trong việc tạo ra acid hữu cơ có đặc tính kháng nấm.
Hợp chất bảo quản sinh học duy nhất hiện nay là Nisin, được chiết xuất từ vi khuẩn acid lactic, có thể được bổ sung vào thực phẩm để tăng cường khả năng bảo quản.
Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất
3 -hydroxydecanoicacid 3 - hydroxydodecanoicacid 3- hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – d d i id
MILAB14 Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone
Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- and n- valeric acid.
T á c h a ̣ i c ủ a n ấ m m ố c lên h a ̣ t c à phê
Giống như các loại hạt khác, trái cà phê và hạt cà phê rất dễ bị nhiễm vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển, thu hoạch, bảo quản và vận chuyển Do đó, việc kiểm soát vi sinh vật là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.
Chất lượng và mức độ an toàn của sản phẩm sẽ bị ảnh hưởng bởi 23 loại vi sinh vật gây bất lợi, tùy thuộc vào điều kiện môi trường và phương pháp bảo quản hạt cũng như thành phẩm (L R Batista và cộng sự, 2003).
Nghiên cứu về vi sinh vật trên trái cà phê và hạt cà phê cho thấy rằng nấm mốc chủ yếu sinh ra độc tố, như Aspergillus, Penicillium và Fusarium, là nguyên nhân gây ô nhiễm tự nhiên trên cà phê (L R Batista và cộng sự, 2003).
Sự xuất hiện của nấm mốc trên cà phê đồng nghĩa với việc phải loại bỏ một lượng lớn cà phê để cách ly hoàn toàn phần bị nhiễm nấm và phần không nhiễm nấm, nhằm tránh lây lan Đồng thời, nấm mốc sản sinh ra độc tố aflatoxin tích tụ trong hạt cà phê, gây nguy hiểm cho người sử dụng nếu không được xử lý đúng cách.
Ch ế bi ế n v à b ả o qu ả n h a ̣ t c à phê truy ề n th ố ng
Có ba phương pháp chế biến cà phê: chế biến khô, chế biến ướt và chế biến bán ướt Mỗi phương pháp sẽ tạo ra những hương vị và mùi thơm khác nhau cho cà phê thành phẩm Cà phê sau khi chế biến nhưng chưa được rang gọi là cà phê nhân, trong khi nếu còn phần vỏ trấu thì được gọi là cà phê thóc.
Sau khi chế biến, cà phê sẽ được rang ngay hoặc bảo quản tùy theo yêu cầu Môi trường bên ngoài có nhiều tác nhân ảnh hưởng đến quá trình bảo quản cà phê, bao gồm nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng.
- Đô ̣ ẩm của ha ̣t cà phê vàmôi trường xung quanh
- Nhiê ̣t đô ̣ của khối ha ̣t cà phê vàmôi trường xung quanh
- Đô ̣ thông thoáng khı́ bên trong khối cà phê
1.5.1 C ác phương pháp bảo quản cà phê thóc:
- Sấy bằng không khı́ khô
- Sấy bằng không khı́ nóng
- Sử du ̣ng các hóa chất hút nước
Bảo quản ở tra ̣ng thái thoáng gió tı́ch cực
Phương pháp bảo quản thoáng gió tích cực dựa trên việc sử dụng độ hổng của khối hạt cà phê để quạt không khí khô và mát vào nhiều lần Mục đích của phương pháp này là giảm nhiệt độ và độ ẩm trong khối hạt cà phê, từ đó bảo quản chất lượng sản phẩm tốt hơn.
Không khí thổi vào khối hạt cần đáp ứng các điều kiện sau:
- Không khí phải được quạt đều trong toàn bộ khối hạt
- Cần đảm bảo đủ lượng không khí khô và mát để thực hiện được mục đích làm giảm nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt
- Chỉ quạt khi độ ẩm của không khí ngoài trời thấp, nghĩa là sau khi quạt độ ẩm của khối hạt phải giảm xuống
- Nhiệt độ không khí ngoài trời phải thấp hơn nhiệt độ của khối hạt
Bảo quản hạt cà phê ở nhiệt độ thấp giúp hạn chế hoạt động sống của hạt, vi sinh vật và côn trùng Phương pháp này sử dụng quạt để đưa không khí lạnh và khô vào khối hạt cà phê Nhờ vào độ dẫn nhiệt kém của hạt cà phê, không khí lạnh được giữ lại lâu, từ đó giúp bảo quản hạt cà phê hiệu quả hơn.
Mặc dù điều kiện thời tiết ở Việt Nam không thuận lợi cho việc áp dụng phương pháp này, nhưng chúng ta có thể tận dụng một số ngày lạnh và khô trong mùa đông để thực hiện.
Bảo quản kín, hay còn gọi là bảo quản thiếu O2, làm ngừng hô hấp của các cấu tử sống, chuyển sang hô hấp hiếu khí Quá trình này khiến hoạt động sống của hệ vi sinh vật trong hạt cà phê bị ngừng trệ, do chủ yếu là vi sinh vật hiếu khí, và trùng bọ cũng bị tiêu diệt Để giảm lượng O2, có thể bổ sung CO2 vào khối hạt cà phê, bù đắp cho O2 mất đi trong quá trình hô hấp của các cấu tử sống.
1.5.2 C ác phương pháp bảo quản cà phê nhân:
Do đặc tính lý học và sinh lý của cà phê nhân khác biệt so với cà phê thóc, quá trình bảo quản cà phê nhân gặp nhiều bất lợi hơn, với độ bền bảo quản kém hơn do lớp vỏ trấu và lớp vỏ lụa bảo vệ đã bị loại bỏ, khiến hạt cà phê tiếp xúc trực tiếp với môi trường Vì vậy, chế độ bảo quản và kiểm tra chất lượng cà phê nhân cần khắt khe hơn so với cà phê thóc Hiện nay, phương pháp bảo quản phổ biến nhất là bảo quản trong bao, và khi thực hiện, cần chú ý đến một số điểm quan trọng để đảm bảo chất lượng.
- Độ ẩm cà phê nhân đưa vào bảo quản phải nhỏ hơn 13 %
- Tạp chất trong cà phê càng ít càng tốt, đối với cà phê cấp I , II phần trăm tạp chất <
- Chọn kho ẩm có cách nhiệt, ẩm tốt
- Phải sát trùng và vệ sinh kho sạch sẽ trước khi xếp bao
- Không xếp trực tiếp xuống nền và sát tường: cách nền 0,3 m, cách tường 0,5m
Để ngăn chặn tình trạng nén chặt các bao do lực nén từ các bao phía trên, cần đảo thứ tự xếp bao sau mỗi 3 tuần Đồng thời, nên đổ thành đống rời để bảo đảm chất lượng hàng hóa.
Bảo quản cà phê nhân trong các silo là phương pháp hiệu quả giúp tiết kiệm bao bì và kéo dài thời gian bảo quản Các silo thường được làm từ tôn, bê tông hoặc gỗ tốt và kín, giúp giảm thiểu thể tích kho lưu trữ Phương pháp này không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn tránh hiện tượng nén chặt, giữ nguyên độ rời của hạt cà phê Ngoài ra, việc sử dụng khí N2 cũng giúp duy trì hương vị cà phê.
B ả o qu ả n h a ̣ t c à phê b ằ ng vi sinh v â ̣ t
Ngũ cốc và các thực phẩm chế biến từ ngũ cốc đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của loài người, ảnh hưởng sâu sắc đến nền nông nghiệp toàn cầu, kinh tế và giá trị dinh dưỡng.
Hạt ngũ cốc không chỉ được ưa chuộng bởi con người mà còn là mục tiêu của nấm mốc và vi sinh vật gây hại, ảnh hưởng đến chất lượng và an toàn thực phẩm Việc bảo quản sinh học, định nghĩa là kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm bằng cách sử dụng hệ thống sinh học hoặc chất kháng khuẩn, là một công cụ hữu ích để ngăn chặn tác nhân gây hại Phương pháp này có thể được áp dụng độc lập hoặc kết hợp với các phương pháp bảo quản truyền thống, vật lý hoặc hóa học để đảm bảo an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng.
V Ậ T LI Ệ U V À PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN C Ứ U
Đi ̣a điể m nghiên c ứ u
Thı́ nghiê ̣m được tiến hành ta ̣i phòng thı́ nghiê ̣m vi sinh Khoa Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c –
Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đa ̣i Ho ̣c Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh.
Th ờ i gian th ự c hi ê ̣ n
Đề tài được thực hiê ̣n từ 02/2017 đến 07/2017.
V â ̣ t li ê ̣ u nghiên c ứ u
Các giống vi khuẩn lên men lactic thuộc chi Lactobacillus spp đã được sử dụng từ bộ sưu tập giống Lưu Đại Kim Phượng 12DSH Trong đó, các chủng Lactobacillus sp C1 – 1 và Lactobacillus sp C7 – 7 được phân lập từ cơm mẻ, cùng với các chủng Lactobacillus sp L6.
L4 và Lactobacillus sp L3 phân lâ ̣p từ nem chua Riêng chủng Lactobacillus sp L5 do
Lê Thị Hồng Thủy, sinh viên lớp 09DSH, đã phân lập chủng nấm Aspergillus spp từ mẫu cà phê (HCP2) do Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Thị Vân Hương, sinh viên lớp 11DSH, thực hiện.
Carbendazim từ Công ty Cổ phần Bảo vê ̣ Thực vâ ̣t Sài Gòn,
Ha ̣t cà phê mua ở cửa hàng Phương Vy 432A Xô Viết Nghê ̣ Tı̃nh, Phường 25, Quâ ̣n
Bı̀nh Tha ̣nh, thành phố Hồ Chı́ Minh
2.3.2 H óa chất và môi trường sử dụng
Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS – broth, MRS cải tiến và PDA
Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Phenolphthalein
Các hóa chất để pha các loa ̣i thuốc nhuô ̣m: thuốc nhuô ̣m Malachite green, thuốc nhuô ̣m Safranin, thuốc nhuô ̣m Crystal violet
Môi trường MRS broth, MRS agar, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic Môi trường PDA để nuôi cấy nấm mốc.
Thi ế t b ị và d ụ ng c ụ
Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)
Cân phân tích (Orbital Germany)
Máy nước cất (Branstead USA)
2.4.2 D ụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri nhựa và thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh
Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, micropipette 10 - 100μl, micropipette 100 - 1000μl Que cấy, que trang, kẹp gắp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1,5 ml, ống falcon 50 ml
Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống.
Phương pháp luậ n
Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy và sản phẩm trao đổi chất từ vi khuẩn Lactobacillus spp trong việc bảo quản hạt cà phê đã chỉ ra tiềm năng của các hợp chất thứ cấp trong việc kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao chất lượng hạt cà phê Nghiên cứu này góp phần vào việc phát triển các phương pháp bảo quản tự nhiên, an toàn và hiệu quả cho ngành cà phê.
Hoa ̣t hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp và chủng nấm mốc Aspergillus sp
Khảo sát đă ̣c điểm hı̀nh thái, sinh hóa của các chủng Lactobacillus spp
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm
Aspergillus sp HCP2 Ứng du ̣ng di ̣ch nuôi cấy, hợp chất thứ cấp của các chủng Lactobacillus spp trong bảo quản ha ̣t cà phê.
Phương phá p nghiên c ứ u
Quy trı̀nh được thực hiê ̣n theo sơ đồ sau:
2.6.2 Kh ảo sát đặc điểm hı̀nh thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp
Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loại vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện để xác định chủng vi khuẩn lactic và đảm bảo tính thuần khiết của chúng.
Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS Broth ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Sau đó, chúng được cấy chuyển sang MRS Agar và ủ trong 1 ngày ở 37°C để quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát các đặc điểm nuôi cấy.
Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hay Gram âm
Tiến hành nghiên cứu dựa trên phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram dương có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram âm hiển thị màu hồng.
Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase
Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18-24 giờ Quan sát kết quả
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra
2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng:
Mục đích của nghiên cứu là xác định hàm lượng acid tổng thông qua phương pháp quy về acid lactic, nhằm đo lường lượng acid lactic được sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể được định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn, dựa vào sự đổi màu của thuốc thử Phenolphthalein.
Để tiến hành thí nghiệm, cho 10ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào bình tam giác, thêm 2-3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sử dụng máy đo pH để điều chỉnh đến khi pH đạt 8,0 và ghi lại kết quả.
Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau:
V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)
K - Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009
V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml)
2.6.3 Kh ảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2
Chủng nấm Aspergillus sp HCP2 được phân lập từ hạt cà phê tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường đại học Công Nghệ Hồ Chí Minh Nghiên cứu này nhằm kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, đảm bảo rằng chúng đủ khỏe mạnh để phục vụ cho đề tài nghiên cứu.
Chủng nấm mốc tiến hành tăng sinh trong môi trường PDB, được cấy vào đĩa môi trường PDA đã hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong 72 giờ Sau đó, sử dụng que đục để đục lỗ thạch nấm và chuyển mẫu từ môi trường PDA sang môi trường MRS Agar cải tiến, tiếp tục ủ ở 37°C trong 72 giờ.
Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm
2.6.4 Xây d ựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp HCP2
Chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 được tăng sinh trong môi trường Potato D- Glucose Broth, ủở 37oC trong 72 giờ
Dùng que cấy vòng lấy bào tử cấy điểm lên đı̃a môi trường Potato D-Glucose Agar, ủở 37oC trong 72 giờ
Tiến hành thu bào tử:
• Sau khi ủở 37 o C trong 72 giờ, người thực hiê ̣n quan sát các đı̃a PDA đã cấy và cho ̣n đı̃a PDA có bào tử xuất hiê ̣n kı́n đı̃a
Sử dụng nước muối sinh lý 0,9% kết hợp với 0,2% Tween 80 để từ từ đưa vào đĩa PDA đã chọn, sau đó cạo nhẹ trên bề mặt nhằm thu thập bào tử Quá trình này cần được lặp lại nhiều lần cho đến khi bề mặt đĩa không còn bào tử.
• Dùng nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 đi ̣nh mức lên 100ml Nồng đô ̣ pha loãng là 10 -2
Xây dựng đường chuẩn tế bào:
Sử dụng lượng bào tử vừa thu được bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 620nm, pha loãng với nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80, thực hiện hai lần để đạt giá trị mong muốn Lặp lại quy trình này ba lần và thu nhận giá trị trung bình.
• Dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lượng bào tử trong mô ̣t ô, giá tri ̣ cho phép là
25 – 250 bào tử trong mô ̣t ô Lă ̣p la ̣i 3 lần và thu nhâ ̣n giá tri ̣ trung bı̀nh
Sử dụng đồ thị đường thẳng trong Excel giúp người dùng dễ dàng vẽ và ghi nhận phương trình đường thẳng thông qua các giao điểm từ các giá trị đã cho.
2.6.5 Kh ảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với ch ủng nấm Aspergillus sp HCP2
Các chủng Lactobacillus spp được tăng sinh trong môi trường MRS broth, ủ ở 37oC trong 24 giờ
Tiến hành khảo sát khảnăng kháng nấm
• Môi trường sử dụng là môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút Phối môi trường vào các đı̃a petri
Sử dụng cây đục thạch, chuyển khối thạch nấm mốc từ đĩa nấm vào đĩa môi trường MRS Agar đã được cải tiến và đặt vào tâm đĩa Ủ ở 37 độ C trong 24 giờ.
Sau 24 giờ, tiến hành sử dụng que cấy để vạch 2 đường vi khuẩn cách mép đĩa 1,5cm Hai vạch chủng vi khuẩn cần phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa.
37 đường kính) cần thử đối kháng vào Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng
• Quan sát, đọc kết quả dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày
• Tiến hành đo tı̉ lê ̣ức chế theo hı̀nh và công thức phần trăm:
Dđc: đường kı́nh (mm) đı̃a nấm đối chứng
Dtn: đường kı́nh (mm) đı̃a thı́ nghiê ̣m
Số liê ̣u được xử lý bằng phần mềm SAS 9.4
2.6.6 Ứng dụng di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp trong đối kháng nấm m ốc Aspergillus sp HCP2 bảo quản hạt cà phê
Hạt cà phê sau khi được sàng lọc và loại bỏ các hạt nứt, vỡ, bị côn trùng hay đen, sẽ được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt Sau đó, hạt cà phê được rửa sạch bằng nước cất vô trùng ba lần và để ráo.
Cứ mỗi 12g ha ̣t cà phê, sẽ được ngâm trong 100ml dịch nuôi cấy được chuẩn bị như sau:
• Thı́ nghiê ̣m 1: Di ̣ch nuôi cấy nhiê ̣t đô ̣ phòng Đối chứng dương 100ml Cardabenzim 0,4% Đối chứng âm 100ml nước cất
Nghiê ̣m thức 100ml di ̣ch nuôi cấy
Thí nghiệm 2 bao gồm việc nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 80°C trong 15 phút, sử dụng 100ml dung dịch Cardabenzim 0,4% cho đối chứng dương và 100ml nước cất cho đối chứng âm Cuối cùng, 100ml dung dịch nuôi cấy được gia nhiệt để thực hiện thí nghiệm.
Hạt cà phê sau khi ngâm sẽ được để khô ở nhiệt độ phòng và sau đó được phối vào các chai 100ml vô trùng Tiếp theo, 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 10^2 bt/g sẽ được thêm vào Quá trình này sẽ được theo dõi hàng ngày ở nhiệt độ thường, và mỗi thí nghiệm sẽ được lặp lại 3 lần.
K Ế T QU Ả V À BI Ệ N LU Ậ N
Kh ả o s á t sinh l ý – sinh h ó a c ủ a c á c ch ủ ng vi khuẩn lactic
Sáu chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L3, L4, L5, L6, C1 và C7-7 đã được nghiên cứu về hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram và thử nghiệm catalase Những kiểm tra này nhằm đánh giá tính thuần khiết và khả năng lên men lactic của các chủng vi khuẩn.
Khuẩn la ̣c lactic trên môi trường MRS Agar thường cóđường kı́nh 2 – 5 mm, bờ đều, láng và lồi, tròn, mờđu ̣c
Kết quả: khuẩn la ̣c các chủng Lactobacillus spp mờ đu ̣c, tròn đều và lồi
Hı̀nh 3.1 Hı̀nh thái khuẩn la ̣c các chủng Lactobacillus spp trên môi trường MRS Agar
Hı̀nh 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tı́m, Gram dương (A)
Tế bào E coli bắt màu hồng, Gram âm (B)
Hı̀nh 3.3 Chủng Lactobacillus sp L3 bắt màu tı́m, Gram dương
3.1.3 Th ử nghiê ̣m catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa
H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi
Trong nghiên cứu này, 42 bọt khí được tạo ra bằng cách sử dụng vi khuẩn Bacillus sb từ phòng thí nghiệm làm đối chứng dương Theo phân loại của Bergey, vi khuẩn lactic được xác định có thử nghiệm catalase âm tính Kết quả cho thấy khi cho H2O2 vào sinh khối của từng chủng vi khuẩn, các chủng Lactobacillus spp không xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí, chứng tỏ chúng không sở hữu hệ enzyme catalase.
Chủng vi khuẩn Bacillus spp cho phản ứng dương tính với catalase, trong khi chủng Lactobacillus spp lại có phản ứng âm tính với catalase Đối chiếu với nước cất, nó cho thấy phản ứng âm tính với catalase.
Lactobacillus spp âm tı́nh với catalase, bên phải (B)
3.1.4 X ác đi ̣nh hàm lượng acid tổng
Khả năng lên men lactic được đánh giá qua nồng độ acid tổng trong dịch nuôi cấy MRS sau 24 giờ, trong khi khả năng tăng trưởng của vi khuẩn được thể hiện qua giá trị OD600nm Hình 3.5 cho thấy giá trị OD tăng dần theo thời gian nuôi cấy, cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của sinh khối vi khuẩn và nồng độ acid lactic (%) cũng tăng theo giá trị OD Sau 24 giờ nuôi cấy, giá trị OD đạt cao nhất đồng thời là thời điểm vi khuẩn sinh acid lactic mạnh nhất.
Hı̀nh 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L3 theo thời gian
Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá tri ̣ OD ởbước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp
Chủng Acid lactic (%) OD600nm
Hı̀nh 3.6 Acid lactic (%) và giá tri ̣ OD ởbước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp
Với các chủng phân lâ ̣p từ nem chua, chủng Lactobacillus sp L6 và
Lactobacillus sp L3 có khả năng lên men lactic cao nhất, trong khi các chủng Lactobacillus sp L5 và L4 có khả năng lên men lactic yếu hơn Hai chủng Lactobacillus sp LC1-1 và LC7-7, phân lập từ cơm mẻ, cũng cho thấy khả năng lên men lactic khá cao Trong số sáu chủng đã nghiên cứu, Lactobacillus sp L6 có khả năng lên men lactic đáng chú ý.
Lactobacillus sp L3 và Lactobacillus sp LC1-1 được đánh giá là rất tốt, trong khi các chủng Lactobacillus sp L5, L4 và LC7-7 có khả năng lên men nhưng không hiệu quả bằng hai chủng đầu Sau 24 giờ nuôi cấy, chủng Lactobacillus sp L4 đạt giá trị OD cao nhất so với các chủng còn lại.
Sau 24 giờ nuôi cấy, các chủng Lactobacillus sp L6, L5, LC7-7 và LC1-1 phát triển mạnh mẽ, trong khi chủng Lactobacillus sp L3 cho thấy sự phát triển kém hơn so với các chủng còn lại.
Kh ả o s á t s ự ph á t tri ể n c ủ a ch ủ ng n ấ m Aspergillus sp HCP2
Chủng nấm Aspergillus sp HCP2 được phân lập từ hạt cà phê trong bộ sưu tập giống của phòng Vi sinh khoa Công Nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
Chủng nấm mốc này cần được kiểm tra khả năng phát triển để xác định tính phù hợp của nó như một nấm mốc chỉ thị trong các thí nghiệm.
Môi trường thử nghiệm được sử dụng là MRS agar cải tiến, giữ lại Ammonium Citrate, nhằm đảm bảo hoạt tính kháng nấm vi khuẩn phát triển hiệu quả Thành phần của môi trường này không ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc, phù hợp để khảo sát hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
Hı̀nh 3.7 Khảnăng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 trên môi trường MRS Agar cải tiến
Kết quả trên hı̀nh 3.7 cho thấy, sau 3 ngày trên môi trường MRS Agar cải tiến
(không bỏ Ammonium citrate), chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 phát triển bı̀nh thường với đường kı́nh trung bı̀nh là (44,75 ± 5,79) mm
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng nấm Aspergillus sp HCP2 hoàn toàn khỏe mạnh và không bị nhiễm các chủng nấm khác, cho thấy tính thích hợp để tiến hành các thí nghiệm khảo sát.
Xây d ựng đườ ng chu ẩ n t ế b à o c ủ a ch ủ ng n ấ m Aspergillus sp HCP2
Mu ̣c đı́ch: xác đi ̣nh mâ ̣t đô ̣ bào tử nấm để cảm nhiễm ha ̣t cà phê để khảo sát sự đối kháng
Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu cho phép định lượng số lượng tế bào nấm mốc thu được, mang lại kết quả chính xác và đáng tin cậy trong nghiên cứu.
3 = 546,667(tb) Khi đó: Số TB ( 𝑡𝑡𝑡𝑡
1 × 0,1 × 4 = 2,2 × 10 7 (tb/ml) Tổng hợp cùng số liê ̣u OD
Bảng 3.2 Số liê ̣u dựng đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2 n x logx OD
Hı̀nh 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2
Kh ả o s á t kh ả năng đố i kh á ng tr ự c ti ế p c ủ a c á c ch ủ ng Lactobacillus spp v ớ i
chủng nấm Aspergillus sp HCP2
Sau khi đã đi ̣nh danh sơ bô ̣ và xác đi ̣nh độ thuần của các chủng vi khuẩn lactic
Nghiên cứu về khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp với nấm mốc Aspergillus sp đã được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của Lactobacillus spp trong việc ức chế sự phát triển của nấm mốc này.
Phương pháp HCP2 sử dụng kỹ thuật cấy hai đường để xác định khả năng kháng nấm của vi khuẩn Đối chứng âm được thực hiện bằng cách sử dụng đĩa môi trường MRS Agar cải tiến, trong đó chỉ đặt thạch nấm mà không cấy vi khuẩn.
Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ ức chế chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 của các chủng
Vi khuẩn Tỉ lệức chế (%)
Theo bảng 3.3, các chủng Lactobacillus spp L3, L4, L5 đều cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2, với tỷ lệ độ kháng cao hơn.
Trong nghiên cứu, chủng Lactobacillus sp L3 cho thấy khả năng kháng khuẩn cao nhất với tỷ lệ đạt 29,24%, trong khi các chủng Lactobacillus sp L6, Lactobacillus sp C1 và Lactobacillus sp C7-7 có khả năng đối kháng với Aspergillus sp HCP2 yếu hơn khi thử nghiệm trên môi trường MRS cải tiến.
Hình 3.9 thể hiện khả năng đối kháng trực tiếp giữa các chủng Lactobacillus spp và chủng nấm Aspergillus sp HCP2 thông qua phương pháp cấy hai đường.
Ứ ng d u ̣ ng d i ̣ ch nuôi c ấ y c á c ch ủ ng Lactobacillus spp trong đố i kh á ng n ấ m
Nghiên cứu khả năng chống lại nấm sinh aflatoxin trên hạt cà phê của Aspergillus sp HCP2 được thực hiện bằng cách sử dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn lactic để xử lý hạt cà phê trong 1 giờ Sau đó, hạt cà phê được nhiễm bào tử nấm mốc với mật độ 10^2 bt/g Hai trường hợp được khảo sát: một là dịch nuôi cấy không qua xử lý nhiệt và hai là dịch nuôi cấy đã được xử lý nhiệt ở 80 độ C trong 15 phút.
* Thı́ nghiê ̣m 1: Di ̣ch nuôi cấy không xử lý nhiê ̣t
Kết quả trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.10
Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 10 2 bt/g hạt cà phê)
Ngày 1 3 5 7 10 14 Ngày đầu tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3
(-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều)
Nhận xét: Đối chứng âm (Nước cất): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3 Đối chứng dương (Carbenzim): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3
Di ̣ch nuôi cấy L6: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5
Di ̣ch nuôi cấy L5: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 14
Di ̣ch nuôi cấy L4: chưa mo ̣c nấm đến ngày thứ 15
Di ̣ch nuôi cấy L3: chưa mo ̣c nấm đến ngày thứ 15
Di ̣ch nuôi cấy C7 – 7: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 14
Di ̣ch nuôi cấy C1: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 18
Khả năng đối kháng in vivo được số hóa vào ngày đầu tiên tơ nấm xuất hiện, trong khi khả năng đối kháng in vitro cũng được thể hiện rõ ràng trên hình 3.9.
Hı̀nh 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm
Aspergillus sp HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt
Khi xử lý hạt cà phê bằng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không qua xử lý nhiệt, các chủng Lactobacillus sp L5, L4 và L3 cho thấy mối tương quan giữa ngày xuất hiện nấm trên hạt cà phê và tỉ lệ đối kháng in vitro.
Lactobacillus sp C1 cho thấy khả năng bảo vệ hạt khỏi sự phát triển của nấm trong thời gian dài, mặc dù tỉ lệ đối kháng in vitro lại có sự sai khác lớn.
52 thấp Điều này có thể do điều kiện dinh dưỡng vi sinh vật in vitro không hoàn toàn trùng với điều kiện ngoài tự nhiên
Hı̀nh 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải)
Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiê ̣t (từ trên xuống dưới)
* Thı́ nghiê ̣m 2: Di ̣ch nuôi cấy gia nhiê ̣t 80 C trong 15 phút
Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp gia nhiê ̣t
80 o C trong 15 phút với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 10 2 bt/g)
Ngày 1 3 5 7 10 14 Ngày đầu tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3
(-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều)
Nhận xét: Đối chứng âm (Nước cất): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3 Đối chứng dương (Carbenzim): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3
Di ̣ch nuôi cấy L6 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5
Di ̣ch nuôi cấy L5 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 7
Di ̣ch nuôi cấy L4 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 5
Di ̣ch nuôi cấy L3 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 3
Di ̣ch nuôi cấy C7 – 7 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5
Di ̣ch nuôi cấy C1 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3
Kết quả từ bảng 3.5 và hình 3.12 cho thấy, việc nuôi cấy ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút làm giảm khả năng bảo quản Trong số các chủng, L5 có khả năng kháng nấm tốt hơn so với các chủng khác, trong khi đó, chủng L3 và C1 có khả năng bảo quản yếu nhất.
Hı̀nh 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải)
Nghiên cứu cho thấy khả năng bảo quản của các dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp bị ảnh hưởng bởi quá trình gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút Kết quả so sánh ngày mọc tơ nấm đầu tiên cho thấy, việc gia nhiệt làm giảm mạnh khả năng kháng nấm, đặc biệt ở các chủng L3, L4 và C1, khi mà dịch nuôi cấy không gia nhiệt có thể ngăn nấm mọc hơn 2 tuần, nhưng sau khi xử lý nhiệt, nấm mọc ngay sau 3 ngày như nhóm đối chứng âm Điều này chỉ ra rằng hoạt chất ức chế nấm mốc trong các chủng khác nhau có sự khác biệt, cần được nghiên cứu thêm để phát triển sản phẩm chế phẩm hiệu quả.
Hình 3.13 thể hiện khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp trong điều kiện nuôi cấy nhiệt và không gia nhiệt đối với chủng nấm Aspergillus sp HCP2, được theo dõi qua từng ngày.