Mục tiêu đề tài
Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P lilacinum) được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh vàng lá và đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.
So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp của một số chủng nấm P liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và khỏe mạnh.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu là một trong những nghiên cứu tiên phong trong lĩnh vực này Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, góp phần vào việc phát triển các biện pháp sinh học trong quản lý dịch hại nông nghiệp.
Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm
P lilacinum sở hữu hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase, đồng thời có khả năng ký sinh tuyến trùng mạnh mẽ trong đất trồng tiêu Điều này mở ra hướng đi mới cho việc sử dụng chế phẩm vi sinh nhằm phòng trừ tuyến trùng gây hại cho cây tiêu trong tương lai.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: 04/2015 – 08/2015 Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc phòng Công nghệ vi sinh (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM)
Các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu trồng ở Vũng
Tàu Trong đó, có 16 chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và 13 chủng từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.(Bảng 2.1)
2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm
Con cái và trứng của tuyến trùng Meloidogyne spp được chiết xuất từ sần rễ tiêu và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0.5%) cho đến khi sử dụng.
Dụng cụ Ống nghiệm 5ml, 10ml Đĩa Petri 5cm, 9cm
Pipep các loại Ống đong các loại
Nồi nấu môi trường Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…
Cân phân tích điện tử
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Các môi trường và thuốc thử sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến
Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường)
Dung dịch đệm Sorensen được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5,96g Na2HPO4 trong nước để tạo thành 250ml dung dịch Na2HPO4 1/15M Tiếp theo, hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước để có 100ml dung dịch KH2PO4 1/15M Sau đó, trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M và điều chỉnh pH về 7,6 để thu được dung dịch đệm Sorensen 1/15M Đối với thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%, hòa tan 10g TCA trong nước cất để đủ 100ml, dùng để phân giải casein.
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,
Để chuẩn bị huyền phù chitin 1%, cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn và hòa tan trong 50ml dung dịch HCL đậm đặc, khuấy đều trong 3 phút Sau đó, từ từ thêm nước cất lạnh 5°C cho đến khi đạt 500ml, tạo thành huyền phù chitin màu trắng sữa Huyền phù này cần được lọc qua giấy lọc và rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính (pH=7) Cuối cùng, bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C (Dai và ctv, 2011).
Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)
Nghiền KI với 5 – 10 ml nước cất và thêm Iod tinh thể vào, tiếp tục nghiền cho đến khi hoàn toàn hòa tan Sau đó, đổ dung dịch vào cốc đong và thêm nước cất cho đến khi đạt 300 ml Bảo quản dung dịch trong lọ màu và sử dụng trong vòng 30 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Môi trường Water agar (WA)
Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar (WA) mềm
Bảng 2.1 Danh sách các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu
STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập
1 KL 1.4 Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá xanh)
14 KL 1.2 Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng lá
Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu tại tỉnh Vũng Tàu Nghiên cứu này nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng của nấm P lilacinum trong việc cải thiện chất lượng đất và hỗ trợ phát triển cây tiêu.
Khảo sát và so sánh khả năng ký sinh của các chủng nấm P lilacinum từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh và bị bệnh ở Vũng Tàu cho thấy sự khác biệt trong khả năng tác động đến khối trứng và con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của các chủng nấm đối với sự phát triển của tuyến trùng, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý dịch hại trong cây tiêu.
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum -
Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch
Khi nuôi cấy nấm P lilacinum trên môi trường chứa cơ chất như casein và chitin, nấm sẽ tiết ra các enzyme tương ứng như protease và chitinase Sự phân giải cơ chất dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi nhỏ thuốc thử vào, kích thước của vòng này phản ánh hoạt động của enzyme (Lê Thị Huệ, 2010).
Giống nấm P lilacinum được bảo quản trong ống ở nhiệt độ 4°C và sau đó được cấy chuyền sang môi trường PDA Quá trình ủ diễn ra ở nhiệt độ 28°C ± 2°C trong 5 đến 7 ngày, tiếp theo là cấy chuyền sang môi trường WA và ủ ở cùng nhiệt độ trong 5 ngày.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng, khoan lấy phần thạch có tơ nấm trên môi trường WA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường Trước khi đưa ra khỏi tủ cấy, quấn đĩa lại bằng parafilm và ghi lại tên giống cùng ngày, giờ cấy để dễ theo dõi.
Chỉ tiêu theo dõi đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được thực hiện sau khi nhuộm thuốc thử ở các thời điểm 24h, 48h và 72h nuôi cấy Mức độ phân giải cơ chất của nấm được đánh giá dựa vào hiệu D – d (mm), trong đó hiệu D – d càng lớn cho thấy khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm càng mạnh.
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:
Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:
Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum
Giống nấm P lilacinum được bảo quản trong ống ở nhiệt độ 4°C, sau đó được cấy chuyền sang môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 28°C ± 2°C Sau khoảng 5 đến 7 ngày, giống nấm này sẽ được cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm.
Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất, nhằm hạn chế nhiễm khuẩn trong quá trình theo dõi khả năng ký sinh Sau khi rửa sạch, chúng được đặt vào các đĩa Petri có lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch có đường kính 5 mm đã được khử trùng, lấy phần thạch có tơ nấm từ môi trường PDA, sau đó dùng dao khử trùng để cắt khoanh thạch và đặt vào tâm đĩa môi trường WA mềm Tiếp theo, đặt 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng xung quanh khoanh nấm với khoảng cách 0.5 cm Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm và ủ ở nhiệt độ phòng từ 28°C đến 30°C để theo dõi sự ký sinh của nấm.
Theo dõi sự ký sinh sau mỗi 24 giờ cho đến khi có chủng nấm khảo sát ký sinh hoàn toàn trên số khối trứng hoặc con cái trong một lần lặp lại Tính số lượng con cái hoặc khối trứng bị nấm ký sinh, trong đó sợi nấm xâm nhập và sử dụng chất dinh dưỡng của ký chủ để tạo thành một cụm sợi nấm bao gồm cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hoặc con cái Mức độ ký sinh của tuyến trùng được xác định theo phần trăm (%) và chia thành 4 cấp độ.
- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%
- Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75%
- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%
- Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25%
2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P lilacinum
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với hai yếu tố chính: 29 chủng nấm Purpureocillium spp và ba mức thời gian khảo sát là 24, 48, và 72 giờ Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần trên ba đĩa Petri chứa môi trường cảm ứng enzyme tương ứng.
Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm
Con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne.spp được tách ra từ sần rễ tiêu và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0.5%) cho đến khi sử dụng.
Dụng cụ Ống nghiệm 5ml, 10ml Đĩa Petri 5cm, 9cm
Pipep các loại Ống đong các loại
Nồi nấu môi trường Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…
Cân phân tích điện tử
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Các môi trường và thuốc thử sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến
Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường)
Dung dịch đệm Sorensen được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5,96g Na2HPO4 trong nước để tạo thành 250ml dung dịch Na2HPO4 1/15M Tiếp theo, hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước để tạo ra 100ml dung dịch KH2PO4 1/15M Sau đó, trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M và điều chỉnh pH về 7,6 để có dung dịch đệm Sorensen 1/15M Đối với thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%, hòa tan 10g TCA trong nước cất đủ 100ml, sử dụng cho khả năng phân giải casein.
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,
Để chuẩn bị huyền phù chitin 1%, cần cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn và hòa tan trong 50ml dung dịch HCL đậm đặc, khuấy đều trong 3 phút Sau đó, từ từ thêm nước cất lạnh 5°C cho đến khi đạt 500ml, tạo ra huyền phù chitin màu trắng sữa Tiến hành lọc huyền phù qua giấy lọc và rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính (pH=7) Cuối cùng, bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C (Dai và ctv, 2011).
Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)
Nghiền KI với 5 – 10 ml nước cất, sau đó thêm tinh thể Iod và tiếp tục nghiền cho đến khi tan hoàn toàn Đổ dung dịch vào cốc đong và bổ sung nước cất cho đến tổng thể tích đạt 300 ml Bảo quản dung dịch trong lọ màu và sử dụng trong vòng 30 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Môi trường Water agar (WA)
Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar (WA) mềm
Bảng 2.1 Danh sách các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu
STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập
1 KL 1.4 Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá xanh)
14 KL 1.2 Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng lá
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P lilacinum được thực hiện tại các hệ sinh thái đất trồng tiêu ở tỉnh Vũng Tàu, nhằm so sánh hiệu quả hoạt động của chúng.
Khảo sát và so sánh khả năng ký sinh của các chủng nấm P lilacinum đối với trứng và con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp được thực hiện từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh và bị bệnh tại Vũng Tàu Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của các chủng nấm trong việc kiểm soát tuyến trùng gây hại cho cây tiêu.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum -
Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch
Khi nuôi cấy nấm P lilacinum trên môi trường chứa casein hoặc chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme tương ứng như protease và chitinase Sự phân giải cơ chất dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc, và kích thước của vòng này phản ánh hoạt động của enzyme (Lê Thị Huệ, 2010).
Giống nấm P lilacinum được bảo quản ở nhiệt độ 4°C và được cấy chuyền sang môi trường PDA Sau đó, giống nấm này được ủ ở nhiệt độ 28°C ± 2°C trong 5 – 7 ngày trước khi tiếp tục cấy chuyền sang môi trường WA và ủ ở cùng nhiệt độ trong 5 ngày.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy phần thạch có tơ nấm trên môi trường WA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường Trước khi đưa ra khỏi tủ cấy, quấn đĩa bằng parafilm và ghi lại tên giống cùng ngày, giờ cấy để theo dõi.
Chỉ tiêu theo dõi đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được thực hiện sau khi nhuộm thuốc thử ở các thời điểm 24h, 48h và 72h nuôi cấy Mức độ phân giải cơ chất của nấm được đánh giá dựa trên hiệu D – d (mm), trong đó hiệu D – d càng lớn cho thấy khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm càng mạnh.
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:
Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:
Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum
Giống nấm P lilacinum được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C và cấy chuyền vào môi trường PDA, sau đó ủ ở nhiệt độ 28 °C ± 2 °C Sau 5 đến 7 ngày, giống nấm này được cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm.
Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất và giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn trong quá trình theo dõi khả năng ký sinh Sau khi rửa sạch, chúng được đặt vào các đĩa Petri có lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy mẫu thạch có tơ nấm từ môi trường PDA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào trung tâm đĩa môi trường WA mềm Tiếp theo, đặt 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng tại 4 điểm xung quanh, cách khoanh nấm 0.5cm Mỗi chủng nấm được khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm và ủ ở nhiệt độ phòng (28-30 độ C) để theo dõi sự ký sinh của nấm.
Theo dõi sự ký sinh hàng ngày trong 24 giờ cho đến khi xác định được chủng nấm khảo sát ký sinh hoàn toàn trên số khối trứng hoặc con cái trong một lần lặp lại Tính toán số lượng con cái hoặc khối trứng bị nấm ký sinh, trong đó sợi nấm xâm nhập và sử dụng chất dinh dưỡng của ký chủ để hình thành cụm sợi nấm bao gồm thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hoặc con cái Mức độ ký sinh của tuyến trùng được đánh giá theo phần trăm (%) và phân chia thành 4 cấp độ khác nhau.
- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%
- Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75%
- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%
- Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25%
2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P lilacinum
Nghiên cứu được thực hiện theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với hai yếu tố chính: 29 chủng nấm Purpureocillium spp và thời gian khảo sát được chia thành ba mức: 24, 48 và 72 giờ Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần trên ba đĩa Petri với môi trường cảm ứng enzyme tương ứng.
Sau khi thu thập chỉ tiêu, hiệu D-d được tính toán bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA cho hiệu D-d được thực hiện bằng phần mềm SAS 9.0 Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được so sánh theo phương pháp LSD với mức ý nghĩa 0.05.
Thí nghiệm khảo sát khả năng ký sinh của P lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp
Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên theo kiểu CRD với 2 yếu tố chính: 10 chủng nấm Purpureocillium spp có khả năng tiết enzyme ngoại bào tối ưu và thời gian khảo sát, bao gồm 4 khoảng thời gian cho con cái (1, 2, 3, 4 ngày) và 14 ngày cho khối trứng (từ ngày 1 đến ngày 14) Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri với môi trường WA mềm.
Sau khi thu thập chỉ tiêu, tỷ lệ ký sinh được tính toán bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA tỷ lệ ký sinh được thực hiện bằng phần mềm SAS 9.0 Để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức, phương pháp LSD được áp dụng với mức ý nghĩa 0.05.