Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của klebsiella pneumoniae đề kháng carbapenem qua cơ chế kpc

Đặc điểm phân loại

Klebsiella, do tầm quan trọng y khoa, được chia thành ba phân nhóm dựa trên triệu chứng bệnh: K pneumoniae, K ozaenae và K rhinoscleromatis Sự phát triển của phân loại học đã dẫn đến việc điều chỉnh hệ thống phân loại cho các vi khuẩn này, với ba hệ thống chính là Cowan, Bascomb và Orskov, như được trình bày trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1 Phân loại các loài trong chi Klebsiella theo các hệ thống phân loại [46]

K edwardsii subsp edwardsii subsp atlantae

K pneumoniae subsp pneumoniae subsp ozaenae subsp rhinoscleromatis

Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 7 loài: K pneumoniae, K oxytoca, K ozaena, K rhinoscleromatis, K planticola, K terrigena,

K ornithinolytica Trong số này, K pneumoniae là thành viên quan trọng nhất Đặc điểm phân loại của K pneumoniae (Bergey’s Manual 2B)

Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố

K pneumoniae là một loại vi khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không có khả năng di chuyển, nổi bật với nang polysaccharide đặc trưng giúp chúng phòng tránh các tác nhân gây hại cho tế bào.

Hình 1.1 Hình kính hiển vi điện tử Klebsiella pneumoniae

(Nguồn: https://microbewiki.kenyon.edu)

Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên hay ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương [46], [109]

Mô tả nguồn phân lập phổ biến của các loài trong chi Klebsiella

Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella [109]

K pneumoniae Phân lập từ các bệnh phẩm trên người như viêm phổi, apxe phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn tiểu, nhiễm khuẩn huyết

K oxytoca Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người và gây nhiều nhiễm khuẩn khác nhau

Vi khuẩn gây viêm mũi và nhiễm khuẩn mủ ở màng nhầy của mũi, đồng thời cũng có thể được phân lập từ các mô nhiễm khuẩn như máu, nước tiểu và mô mềm.

K planticola Phân lập được từ máu, đàm, nước tiểu, vết thương

K ornithinolytica Phân lập được từ nước và thực vật Ở người, vi khuẩn này

Loài Nguồn phân lập thường được phân lập ở đường hô hấp trên, nước tiểu, dịch não tùy và máu

Phân lập được từ màng nhầy đường hô hấp, mũi hầu, xoang mũi

Nguồn phân lập chính là đất và nước có thể phân lập được từ phân người khỏe mạnh, đường hô hấp nhưng không gây bệnh cho người

K pneumoniae và K oxytoca có mối quan hệ gần gũi, nhưng có thể phân biệt chúng qua phản ứng indole; K pneumoniae cho kết quả indole âm và có khả năng phát triển trên cả melezitose và 3-hydroxybutyrate Bảng 1.3 cung cấp thống kê các thử nghiệm sinh hóa cần thiết cho việc phân tích và định danh các loài trong chi Klebsiella.

Các yếu tố độc lực của K pneumoniae

Giống như các vi khuẩn gây bệnh khác, K pneumoniae áp dụng những phương thức chung để khởi phát quá trình nhiễm trùng và gây bệnh Những cơ chế này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên độc lực của vi khuẩn, trong đó có kháng nguyên vỏ (bề mặt).

Klebsiella thường có hai nhóm kháng nguyên bề mặt: hơn 80 kháng nguyên vỏ K polysaccharide và 9 kháng nguyên O lipopolysaccharide, cả hai đều đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của K pneumoniae Sự thay đổi cấu trúc của các kháng nguyên này là cơ sở để phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau, mặc dù độc tính của chúng vẫn tương đồng.

Klebsiella, giống như các vi khuẩn đường ruột khác, có khả năng bám dính vào bề mặt tế bào chủ thông qua hệ thống nhung mao được cấu tạo từ các đơn vị protein hình cầu có khối lượng phân tử từ 15-26 kDa, có khả năng đông tụ hồng cầu ở nhiều loài động vật.

Bảng 1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài thuộc chi Klebsiella

Loài OXI NO2 KIA/TSI

PAD URE IND MOB CIT VP MR LDC MLO ONPG GLU LAC GAS H 2 S

Ghi chú: (-) thử nghiệm âm tính, (+) thử nghiệm dương tính, (+/-) trên 70% là dương tính

The article discusses various biochemical tests used to identify bacterial characteristics, including the oxidase test (OXI), glucose fermentation ability (GLU), lactose fermentation ability (LAC), gas production capability (GAS), hydrogen sulfide production (H2S), phenylalanine deaminase test (PAD), urease test (UREA), indole test (IND), motility test (MOB), citrate metabolism ability (CIT), Voges-Proskauer test (VP), methyl red test (MR), decarboxylase test (LCD), maltose metabolism (MLO), and the ONPG test (ONPG) These tests are essential for determining the metabolic properties of microorganisms.

Các yếu tố kháng huyết thanh của vi khuẩn Klebsiella đóng vai trò quan trọng trong việc vượt qua hàng rào bảo vệ của tế bào chủ Để tránh bị thực bào bởi bạch cầu đa nhân, vi khuẩn cần phải thoát khỏi tác động của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh Hoạt động diệt khuẩn chủ yếu diễn ra qua các protein bổ thể, tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự thay đổi áp suất thẩm thấu bên trong tế bào Tuy nhiên, cơ chế kháng huyết thanh của vi khuẩn vẫn chưa được hiểu rõ.

Klebsiella được bảo vệ bởi lớp vỏ polysaccharide, che chắn cho lớp lipopolysaccharide bên dưới, hoặc cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể do chuỗi bên của kháng nguyên O tạo thành Để phát triển trong mô tế bào chủ, vi khuẩn cần đủ sắt, một yếu tố thiết yếu cho các phản ứng oxi hóa khử trong chuỗi dẫn truyền điện tử Do nguồn sắt tự do trong tế bào chủ rất thấp, vi khuẩn tiết ra các chất kìm nối phân tử nhỏ, gọi là siderophore, để thu nhận sắt Klebsiella có hai loại siderophore chính là enterochelin và aerobactin.

Cấu trúc di truyền của K pneumoniae

K pneumoniae có một lớp polysaccharide dày bên ngoài, giúp vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào vật chủ Đặc điểm này tạo nên sự phân biệt rõ rệt giữa K pneumoniae và các vi khuẩn khác trong cùng họ Hơn nữa, sự tương đồng di truyền với các vi khuẩn như Citrobacter, Escherichia, Enterobacter và Salmonella càng làm nổi bật tính chất đặc trưng của K pneumoniae.

9 pneumoniae dễ dàng chuyển các plasmid hay các nhân tố di truyền di động cho các vi khuẩn này, thông thường là các vector lan truyền gen kháng thuốc

Hiện nay chỉ có một vài cấu trúc di truyền của K pneumoniae được công bố

Bộ gen K pneumoniae đầu tiên được giải trình tự là K pneumoniae subsp pneumoniae MGH vào năm 2006 tại Mỹ, với nhiễm sắc thể dạng vòng 5,1 Mbp và tỷ lệ GC 57% Trình tự gen của chủng này có sự tương đồng cao với chủng E coli K-12, một chủng phổ biến trong nghiên cứu di truyền vi khuẩn Chủng thứ hai được giải trình tự bộ gen là K pneumoniae NTUH.

Chủng K2044 được phân lập tại Đài Loan cho thấy nhạy cảm với kháng sinh Bên cạnh đó, chủng K pneumoniae subsp rhinoscleromatis (ATCC13884) không gây bệnh cho con người và có trình tự DNA liên quan đến dự án giải mã bộ gen người Một chủng khác, K pneumoniae 342, có khả năng cố định nitơ và được sử dụng trong nghiên cứu mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn.

Ngoài ra, 5 plasmid của K pneumoniae sub sp pneumoniae MGH là pKPN3

(0,18 Mbp), pKPN4 (0,11 Mbp), pKPN5 (89 Kbp), pKPN6 (4,3 Kbp) và pKPN7 (3,5 Kbp); 2 plasmid của K pneumoniae 342 và 2 plasmid của K pneumoniae NTUH-

K2044 cũng đã được giải trình tự và được trình bày tóm tắt trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Tóm tắt các bộ gen K pneumoniae đã được công bố trình tự [124]

Chủng Trình tự gen Số lượng gen

K pneumoniae subsp rhinoscleromatis Nhiễm sắc thể 5671

Nghiên cứu mới nhất của Kathryn E Holt và các cộng sự vào năm 2015 đã tiến hành giải trình tự toàn bộ hoặc một phần của 288 mẫu K pneumoniae được thu thập từ nhiều địa điểm trên thế giới.

Nghiên cứu đã xác định 10 giới và so sánh với các trình tự đã được công bố để xác nhận mối liên hệ giữa các gen và nguy cơ dịch bệnh, đồng thời xác định các gen liên quan đến khả năng gây bệnh ở người.

1.1.5 Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem ở K pneumoniae

Carbapenem được khuyến cáo để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng đa kháng sinh, đặc biệt là các vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae có tiết ESBL Tuy nhiên, chỉ sau một thời gian ngắn sử dụng, vi khuẩn đã nhanh chóng phát triển hoặc tiếp nhận gen carbapenemase, dẫn đến sự kháng thuốc, đặc biệt là ở K pneumoniae, và tình trạng này đã lan rộng ra nhiều khu vực, bao gồm cả Châu Á và toàn cầu.

Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem ở K pneumoniae cũng được phát hiện thông qua các cơ chế biến nạp, chuyển nạp và tiếp hợp như trình bày trên Hình 1.3

Hình 1.3 Các con đường chuyển gen ở vi khuẩn (nguồn Nature) a) Biến nạp (Transformation):

Biến nạp DNA trần từ tế bào vi khuẩn thể cho sang tế bào vi khuẩn thể nhận diễn ra nhờ sự hiện diện của yếu tố thẩm quyền trên bề mặt vi khuẩn, cho phép tiếp nhận DNA từ môi trường Hiệu quả của quá trình biến nạp này phụ thuộc vào tính dung nạp của vi khuẩn.

Biến nạp của tế bào yêu cầu DNA phải ở dạng mạch kép, vì nếu DNA bị biến tính thành mạch đơn, quá trình này sẽ không hiệu quả Tải nạp (Transduction) là một phương pháp quan trọng trong quá trình này.

Chuyển nạp là quá trình truyền vật chất di truyền từ tế bào này sang tế bào khác qua trung gian bacteriophage Bacteriophage có khả năng ly giải tế bào vi khuẩn khi sinh sản quá mức bên trong Có hai dạng tải nạp: tải nạp hạn chế, trong đó phần tử chứa cả DNA của phage và DNA của vi khuẩn, và tải nạp toàn phần, khi phần tử chỉ mang chất liệu di truyền của vi khuẩn.

Trong cả hai trường hợp, phần tử tải nạp không chứa đầy đủ thành phần của phage, do đó không thể ly giải tế bào vi khuẩn Sau khi tải nạp, nếu phần tử này liên kết với DNA của vi khuẩn, nó sẽ được nhân lên cùng với DNA đó Ngược lại, nếu không liên kết được, phần tử tải nạp sẽ không được nhân lên khi tế bào vi khuẩn phân chia.

Trong quá trình tiếp hợp, vật chất di truyền của vi khuẩn được chuyển giao vào vi khuẩn nhận thông qua plasmid Nhân tố F đóng vai trò quan trọng trong quá trình này, giúp điều phối sự chuyển giao gen giữa các vi khuẩn.

Nhân tố F có vai trò quan trọng trong việc truyền DNA từ vi khuẩn F+ sang vi khuẩn F- qua pili giới tính, tạo ra episome và dòng vi khuẩn Hfr với tần suất lan truyền DNA cao Đồng thời, yếu tố R, bao gồm RTF và R determinant, là yếu tố quyết định tính kháng thuốc Vi khuẩn mang yếu tố R có khả năng truyền tính kháng thuốc cho vi khuẩn F-, làm cho chúng trở nên kháng thuốc và tiếp tục lây lan kháng thuốc cho các vi khuẩn khác Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở nhóm vi khuẩn đường ruột.

Chủng vi khuẩn Escherichia coli J53, với đặc điểm F - met pro và khả năng kháng sodium azide (Az r), là một trong những chủng phổ biến được sử dụng trong nghiên cứu tiếp hợp in vitro Chủng này được áp dụng rộng rãi trong nhiều thí nghiệm để nghiên cứu các cơ chế liên quan đến sự tiếp hợp ở vi khuẩn.

Chủng vi khuẩn K pneumoniae có bộ gen dài 4.5 Mb với tổng tỷ lệ nucleic G và C là 50,8 mol%, chứa khoảng 4,484 trình tự mã hóa protein, 6 bản sao operon rRNA và 67 gen tRNA Đặc biệt, ở các chủng K pneumoniae kháng carbapenem, hầu hết các gen mã hóa KPC nằm trên plasmid, với Tn3 của transposon Tn4401 ổn định tại vùng phía trên gen KPC Cấu trúc này điều hòa cơ chế chuyển vị, dẫn đến sự lan truyền các trình tự mã hóa enzym KPC, gây bùng phát nhiều plasmid mang gen này ở các nhóm không tương đồng như FII, L/M và N Cấu trúc tương tự cũng được phát hiện ở các chủng vi khuẩn đường ruột khác mang gen KPC.

Cấu trúc Tn4401 trên các plasmid tự nhiên được mô tả với các mũi tên ngang chỉ hướng dịch mã của gen Tn4401 được giới hạn bởi hai trình tự lặp lại đối nghịch, được biểu thị bằng hai hình tam giác ở hai đầu Bên cạnh đó, hai tam giác nhỏ đại diện cho hai trình tự đối nghịch của hai đoạn trình tự chèn ISKpn6 và ISKpn7.

1.2 Kháng sinh họ -lactam và cơ chế kháng -lactam

1.2.1 Kháng sinh a) Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh họ -lactam và cơ chế kháng -lactam

Carbapenem và các cơ chế đề kháng carbapenem ở K pneumoniae

Tình hình nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K pneumoniae

Các thách thức trong phát hiện K pneumoniae đề kháng carbapenem

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

BÀN LUẬN CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận