Đặc điểm kiểu gen và đột biến kháng thuốc của hbv ở bệnh nhân nhiễm hbv mạn tính chưa điều trị

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân mắc viêm gan B mạn tính chưa được điều trị có thể đến khám và tái khám tại phòng khám viêm gan thuộc Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Trung tâm chẩn đoán Y khoa Cần Thơ.

Những bệnh nhân có xét nghiệm HBsAg (+) trên 6 tháng, không sử dụng thuốc kháng virus, có tải lượng HBV DNA trong máu ≥ 10 3 copies/ml.

-Bệnh nhân không xác định được đã điều trị thuốc kháng virus.

-Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược CầnThơ, Trung tâm chẩn đoán Y khoa Cần Thơ từ tháng 1 năm 2013 đến tháng 6 năm 2014.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiền cứu, mô tả cắt ngang

P: trị số mong muốn của tỷ lệ.

(Tỷ lệ đột biến kháng thuốc trên bênh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị theo tác giả Mirandola S ) [87] α: xác xuất sai lầm loại 1. α = 0,05

Z: trị số từ phân phối chuẩn

Cỡ mẫu N sau khi cộng 10% hao hụt:

Trong thời gian từ tháng 1/2013 đến tháng 6/2014 chúng tôi thu thập được 505 mẫu huyết thanh từ các bệnh nhân được chọn vào mẫu nghiên cứu.

2.2.4 Các biến số nghiên cứu

- Tuổi: được phân thành 2 nhóm, nhóm tuổi < 40 tuổi và nhóm tuổi ≥ 40 tuổi.

- Giới tính : có 2 giá trị nam và nữ

Danh sách các địa chỉ tỉnh, thành phố bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Kiên Giang, Đồng Tháp, Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, An Giang và Tiền Giang.

- Tình trạng mang HBeAg: có 2 giá trị HBeAg dương tính và HBeAg âm tính.

- Men gan (ALT): được chia thành 2 nhóm, nhóm có men gan tăng trên mức bình thường và nhóm có men gan không tăng.

Chỉ số men gan (ALT) bình thường ở nam là ≤ 30 UI/ml và nữ là ≤ 19 UI/ml.

- Kiểu gen (genotype): có 2 giá trị kiểu gen B và kiểu gen C.

Dưới kiểu gen, virus viêm gan B được phân thành 6 giá trị B1, B2, B3, B4, C1 và C2 Tải lượng virus trong máu (HBV DNA) được chia thành hai nhóm: nhóm có tải lượng virus từ 10^3 đến 10^5 copies/ml và nhóm có tải lượng virus lớn hơn hoặc bằng 10^5 copies/ml.

- Đột biến kháng thuốc: gồm những đột biến kháng các thuốc nhóm đồng phân nucleotide (Lamivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir và Telbivudine) đã được công bố.

2.2.5.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu

Tuổi, giới, nơi cư trú.

2.2.5.2 Xác định một số đặc điểm sinh học

-Tải lượng virus trong máu (HBV DNA trong máu)

2.2.5.3.Xác định kiểu gen HBV và các mối liên quan

-Xác định kiểu gen HBV

Nghiên cứu nhằm xác định mối liên quan giữa kiểu gen vi rút viêm gan B (HBV) với các yếu tố như tuổi tác, giới tính, nơi cư trú, mức độ men gan, tải lượng virus trong máu và tình trạng mang HBeAg Việc hiểu rõ những yếu tố này có thể giúp cải thiện việc chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan B.

2.2.5.4.Xác định dưới kiểu gen HBV và các mối liên quan

-Xác định các dưới kiểu gen HBV

Nghiên cứu này nhằm xác định mối liên quan giữa kiểu gen HBV và các yếu tố như tuổi tác, giới tính, nơi cư trú, mức độ men gan, tải lượng virus trong máu cũng như tình trạng mang HBeAg Các yếu tố này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và tiến triển của bệnh viêm gan B, từ đó giúp cải thiện chiến lược chẩn đoán và điều trị.

2.2.5.5 Tìm đột biến kháng thuốc và các mối liên quan

-Tìm đột biến kháng thuốc của HBV

-Xác định mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với các yếu tố tuổi,giới, men gan, tải lượng virus trong máu và tình trạng mang HBeAg.

Các bước tiến hành nghiên cứu

- Xét nghiệm định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật Real-time PCR để chọn ra những mẫu có nồng độ virus ≥ 10 3 copies/ml.

Tiến hành giải trình tự gen nhằm phát hiện đột biến kháng thuốc và xác định kiểu gen cho những mẫu có nồng độ virus từ 10^3 copies/ml trở lên.

- Tiến hành làm các xét nghiệm men gan (ALT), HBeAg những mẫu được giải trình tự.

Chúng tôi mời các bác sĩ tham gia khám tại các phòng khám viêm gan của Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Trung tâm chẩn đoán Y khoa Cần Thơ Trong quá trình này, chúng tôi sẽ tiến hành tập huấn bộ câu hỏi thu thập số liệu, chú trọng vào việc xác định đúng người nhiễm HBV mạn tính và chưa điều trị thuốc kháng virus Đối với bệnh nhân tái khám, chúng tôi dựa vào tiền sử nhiễm HBV với xét nghiệm HBsAg dương tính trên 6 tháng để kết luận về tình trạng nhiễm HBV mạn tính Đối với những bệnh nhân lần đầu đến khám có xét nghiệm HBV dương tính, chúng tôi sẽ ghi nhận và theo dõi trong các lần tái khám tiếp theo Nếu sau 6 tháng xét nghiệm HBsAg vẫn dương tính, bệnh nhân sẽ được xác định là nhiễm HBV mạn tính.

Mỗi bệnh nhân sẽ được lấy 4-5 ml máu tĩnh mạch và cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông EDTA Sau 4-6 giờ, máu sẽ được quay ly tâm ở 1.200 vòng/phút trong 5 phút để tách huyết tương Huyết tương thu được sẽ được chia vào 3 ống eppendorf, mỗi ống khoảng 200 µl: một ống để xét nghiệm HBsAg, một ống để xét nghiệm HBeAg và men gan, và một ống dùng cho xét nghiệm định lượng HBV DNA, giải trình tự xác định genotype và phát hiện đột biến kháng thuốc Các ống huyết tương này cần được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 độ C cho đến khi thực hiện xét nghiệm.

Sơ đồ 2.1: Qui trình lấy, xử lý và bảo quản mẫu

2.3.3 Làm xét nghiệm HBsAg, HBeAg, ALT

Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang

(Chemiluminescence Magnetic Micropartical Immunoassay-Chemiflex - CMIA) để phát hiện kháng nguyên HBsAg trong huyết tương bệnh nhân.

Quay ly tâm lấy huyết thanh

Xét nghiệm HBeAg, ALT Ly trích DNA

Giải trình tự Real-time PCR

Hóa chất: Architect HBsAg qualitative Reagent Kit của công ty Abbott cung cấp, gồm:

Máy thực hiện: hệ tống Architect của hãng Abbott (Mỹ).

Nguyên tắc của xét nghiệm miễn dịch 2 bước là sử dụng kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (Chemiluminescence Magnetic Micropartical Immunoassay-Chemiflex - CMIA) nhằm phát hiện kháng nguyên HBeAg trong huyết tương của bệnh nhân.

Hóa chất: Architect HBeAg qualitative Reagent Kit của công ty Abbott cung cấp, gồm:

Máy thực hiện: hệ tống Architect của hãng Abbott (Mỹ).

Nguyên tắc của quá trình này là ALT trong mẫu thử chuyển đổi L-alanine thành α-ketoglutarate, tạo ra pyruvate và L-glutamate Dưới sự tác động của NADH và lactate dehydrogenase (LD), pyruvate sẽ chuyển đổi thành L-lactate, trong khi NADH được oxi hóa thành NAD Phản ứng này được đo bằng sự hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 349 nm, phản ánh quá trình oxi hóa NADH thành NAD.

Máy thực hiện: hệ tống Architect của hãng Abbott (Mỹ).

2.3.4 Xét nghiệm định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật Real-time PCR

DNA của virus trong huyết thanh bệnh nhân được tách chiết theo nguyên tắc ly trích DNA bằng phenol và tủa DNA bằng ethanol.

Dụng cụ, trang thiết bị, máy móc:

- Máy ly tâm 13.000 vòng MIKRO 200

Hóa chất: bộ kít của công ty Kỹ thuật sinh học Khoa Thương

- Phenol pH 8, guanidinium isothiocyanate, Glycerol, Sodium acetate 3M pH 5,4

- Đánh số các ống eppendorf 1,5ml.

- Thêm 100l huyết thanh hoặc bệnh phẩm vào mỗi ống.

- Thêm 900l dung dịch 1 Lắc mạnh ống trên máy vortex ít nhất 5 giây Để yên 10 phút.

- Thêm 200l dung dịch 2, trộn thật kỹ (lật qua lật lại).

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

- Cẩn thận hút bỏ dịch nổi.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

- Cẩn thận hút bỏ dịch nổi.

- Làm khô cặn trong 10 phút ở 60 0 C (bồn ủ nhiệt khô).

- Hòa cặn trong 50l dung dịch 5.

- Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản DNA tách chiết ở 2-8 0 C trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở -20 0 C trong vòng 6 tháng.

Chứng dương (mẫu huyết thanh có DNA dương tính)

Chứng âm (nước cất 2 lần vô trùng)

2.3.4.2 Nhân bản DNA bằng Real-time PCR

Cặp mồi (primer) trong vùng gen S của virus viêm gan B (HBV) được thiết kế để nhân bản trình tự mục tiêu dài 88 cặp base Phản ứng real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho HBV, được đánh dấu huỳnh quang, cho phép ghi nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với mỗi bản sao của trình tự mục tiêu Số lượng bản sao HBV được tạo ra trong quá trình PCR sẽ được ghi nhận chính xác theo từng thời điểm, và thông qua đường cong chuẩn với nồng độ DNA HBV xác định, có thể tính toán số lượng bản sao HBV có trong mẫu ban đầu.

- Tube PCR có chứa mix PCR 40L.

- Tube PCR có chứa standard (chứng dương) có các nồng độ 10 8 , 10 6 ,

Dụng cụ, trang thiết bị:

- Máy Real – time PCR Mx3005P (Stratagene)

- Máy MagNA Pure LC 2.0 và vật dụng tiêu hao

- Máy ly tâm 13.000 vòng/phút

Nhỏ 10L dung dịch HBV DNA vào tube PCR.

Nhỏ 10L dung dịch chứng âm vào tube chứng âm.

Ly tâm nhanh các tube.

Ly tâm nhanh các ống PCR chứa hỗn hợp và tiêu chuẩn Cần đánh số các ống ở thân, không đánh số trên nắp Một ống phải ghi âm tính để làm chứng âm.

- Cài đặt máy (Theo Qui trình cài đặt chương trình Real-time PCR trên máy Stratagene Mx3005P ).

To begin the PCR process, place the standard tubes, negative control tubes, and sample tubes into the designated wells according to the pre-set layout Then, click on "Run" and select "Start." Ensure to check the option to "Turn lamp off at end of run."

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Real-time PCR

Nhiệt độ Thời gian ủ Số chu kỳ

Standards có các nồng độ 10 8 , 10 6 , 10 4 , 10 2 copies/mL.

Nước cất đã qua tách chiết theo qui trình tách chiết DNA.

+ Kiểm tra chứng nội tại

Dấu FAM chỉ hiển thị dưới dạng HEX, cho phép quan sát đầy đủ đường biểu diễn chứng nội của từng mẫu Các đường biểu diễn này xuất hiện trong chu kỳ từ 33 đến 36 Nếu đường biểu diễn không cho kết quả dương tính, điều này cho thấy phản ứng bị ức chế và cần kiểm tra lại mẫu.

Dấu HEX, hiển thị FAM.

Click on the standard and the negative control The standard curve shows that 10^8 copies/mL corresponds to a Ct (Threshold cycle) of 13, while 10^6 copies/mL corresponds to a Ct of 20 Additionally, the standard curve indicates that 10^4 copies/mL relates to a Ct of 27, and 10^2 copies/mL corresponds to a Ct of 33 The horizontal line represents the negative control.

Click Standard curve kiểm tra các hệ số: Rq = 0.90 – 1; a = -3,20 đến - 3,40; Efficiency = 100% + 10%.

Click Amplification plot xem đường biểu diễn của từng mẫu Select all. Lưu kết quả.

+ Chuyển kết quả sang file Excel

+ Lưu các dữ liệu vào máy tính

+ Đọc và phân tích kết quả

2.3.5 Giải trình tự gen phát hiện đột biến kháng thuốc và xác định kiểu gen, dưới kiểu gen

Mẫu DNA được ly trích ban đầu đã được sử dụng để thực hiện phản ứng giải trình tự Chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen P có chiều dài 416 bp cho các mẫu có kết quả định lượng DNA HBV đạt ≥ 10^3 copies/ml.

Máy giải trình tự tự động hoạt động dựa trên nguyên lý cải tiến của phương pháp Sanger, sử dụng ddNTP được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang khác nhau thay vì đồng vị phóng xạ.

- HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No 203205, 4x250UI, Qiagen).

- PCR buffer10X đóng gói chung với HotStarTaq DNA Polymerase.

- dNTP mix (Cat No U1515, 10 mM, 1000 àl/ống, Promega).

- Mồi: 1 SQ-1 : 5’-AAG GTA TGT TGC CCG TTT GTC C -3’

2 SS : 5’-CT(C/G/T) CCA AT(G/T) AC(A/G) TA(A/T) C-3’

3 POL-1 : 5’-TCA ACC ACC AGC ACG GGA C-3’

- PCR Purification kit của QIAgen.

- Bộ kít DTCS của Beckman Coulter.

- Gel Separation LPA của Backman Coulter.

- Separation buffer của Beckman Coulter.

- Dung dịch điện di TBE 1X

- Dung dịch loading buffer 10X của Invitrogen.

Dụng cụ, trang thiết bị, máy móc

- Đầu cụn lọc tiệt trựng 10, 200, 1000àl.

- Hộp đựng mẫu huyết thanh hoặc huyết tương.

- Đĩa buffer 96 giếng của Beckman Coulter

- Đĩa sample 96 giếng của Beckman Coulter.

- Khay đựng mẫu huyết thanh, huyết tương tách chiết thu nhận DNA.

- Các khay mouse đựng mẫu.

- Máy cô quay chân không.

- Máy giải trình tự CEQ 8000 của Beckman Coulter.

- Bồn và bộ nguồn điện di.

- Máy đọc kết quả điện di.

- Máy giải trình tự CEQ 8000 Beckman Coulter (Mỹ).

Khuếch đại vùng gen mang đột biến kháng thuốc

- Phản ứng PCR-1: Pha các hóa chất trong microtube 1.5ml theo thể tích sau (PCR mix):

- Cho 45 àl dung dịch PCR đó pha bờn trờn vào cỏc PCR tube 0,2àl. Đóng nắp, đánh số thứ tự.

- Cho 5 àl cỏc dung dịch HBV DNA vào cỏc PCR tube.

Hóa chất Nồng độ sử dụng

Thể tích cho 1 phản ứng 45

Hóa chất Nồng độ sử dụng

Thể tích cho 1 phản ứng 45

Phản ứng PCR-2 (heminested PCR) chỉ được thực hiện cho các mẫu có kết quả âm tính với phản ứng PCR-1 Để tiến hành, cần pha trộn các hóa chất trong microtube 1,5ml theo thể tích được chỉ định trong bảng hướng dẫn (PCR mix).

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR-1 và PCR-2

- Điện di phát hiện sản phẩm PCR

Mẫu dương tính khi sản phẩm ghi nhận có kích thước:

Nhiệt độ Thời gian ủ Số chu kỳ

416bp cho sản phẩm PCR1.

388bp cho sản phẩm heminested PCR.

- Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng Qiaquick purification kit.

Thực hiện phản ứng PCR –sequencing

- Pha dung dịch phản ứng trong microtube 1,5ml theo tỷ lệ sau (PCR mix):

Hóa chất Nồng độ sử dụng

Thể tích cho 1 phản ứng 18

- Cho 45 àl dung dịch PCR đó pha bờn trờn vào cỏc PCR tube 0,2àl. Đóng nắp, đánh số thứ tự.

- Cho 5 àl cỏc dung dịch PCR1 vào cỏc PCR tube.

-Thực hiện phản ứng PCR sequencing với chu kỳ nhiệt như sau:

Nhiệt độ Thời gian ủ Số chu kỳ

-Tủa sản phẩm PCR sequencing

Thực hiện giải trình tự

Thực hiện giải trình tự với máy giải trình tự CEQ 8000.

-Tìm đột biến kháng thuốc

The analysis of the identification sequence is based on genomic data from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ This resource provides essential tools for researchers to access and interpret genetic information effectively.

Các đột biến kháng thuốc có thể được xác định qua việc giải trình tự gen, với hầu hết các đột biến quan trọng liên quan đến kháng thuốc nằm ở các vùng B và C.

D và E của gen P, ở các vị trí codon 169, 173, 180, 181, 184, 202, 204, 236,

250 Sau đây là bảng liệt kê các vị trí đột biến có thể phát hiện được trên đoạn gen giải trình tự.

Kháng thuốc Vị trí đột biến

Xử lý số liệu

- Thống kê và xử lý số liệu bằng phần mền thống kê SPSS 18.0

- Trình bày các kết quả nghiên cứu dưới dạng tần số, tỷ lệ phần trăm trong các bảng, biểu đồ.

- So sánh 2 tỷ lệ bằng phép kiểm chi bình phương với khoảng tin cậy 95%.

- Giá trị p < 0,05 được xem như có ý nghĩa thống kê.

Hạn chế sai số

Để hạn chế các sai số trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thực hiện các biện pháp như sau:

2.5.1 Hạn chế sai số do phỏng vấn, chọn bệnh

- Việc khám và chọn bệnh được thực hiện bởi một nhóm bác sĩ nhất định tại các nơi tiến hành thu thập số liệu.

Nhóm bác sĩ đã được đào tạo kỹ lưỡng về bộ câu hỏi thu thập số liệu và các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, đặc biệt chú trọng đến tiêu chuẩn nhiễm HBV mạn tính và những trường hợp chưa được điều trị bằng thuốc kháng virus.

2.5.2 Hạn chế sai số do lấy mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm

- Tập huấn qui trình lấy máu, xử lý mẫu và lưu trữ mẫu chờ làm xét nghiệm cho các kỹ thuật viên xét nghiệm tham gia lấy mẫu.

Tất cả các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại một phòng xét nghiệm duy nhất, đảm bảo sử dụng cùng một kỹ thuật và hóa chất Điều này được thực hiện bởi một nhóm kỹ thuật viên xét nghiệm nhất định, nhằm đảm bảo tính nhất quán và độ chính xác trong kết quả xét nghiệm.

Các xét nghiệm men gan (ALT), HBsAg, HBeAg được thực hiện tại khoa Hóa sinh, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Việc ly trích DNA và định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR được thực hiện tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Kỹ thuật giải trình tự để xác định kiểu gen và phát hiện đột biến kháng thuốc được thực hiện tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh.

- Các kỹ thuật xét nghiệm của một bệnh nhân được thực hiện trên một mẫu máu duy nhất tại thời điểm khám, chọn bệnh.

- Các mẫu bệnh phẩm được lưu giữ và vận chuyển theo đúng điều kiện yêu cầu về nhiệt độ và thời gian.

2.5.2 Hạn chế sai số do nhập dữ liệu

Tiến hành kiểm tra ngẫu nhiên thông tin từ một số phiếu thu thập dữ liệu nhằm đảm bảo tính chính xác của số liệu thô đã được nhập vào file trước khi phân tích thống kê, từ đó cung cấp kết quả nghiên cứu đáng tin cậy.

Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành với sự đồng ý của bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Trung tâm chẩn đoán Y khoa Cần thơ.

- Đối tượng tham gia nghiên cứu được giải thích rõ nội dung, mục đích ý nghĩa của nghiên cứu và tự nguyện tham gia.

- Nghiên cứu đảm bảo tính bí mật của thông tin cá nhân của đối tượng tham gia vào nghiên cứu.

Mẫu máu được sử dụng cho nghiên cứu được lấy từ bệnh nhân trong quá trình khám và làm các xét nghiệm thường quy, đảm bảo không ảnh hưởng đến sức khỏe và không gây khó chịu cho bệnh nhân.

Qui trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.2.Qui trình nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu (HBsAg (+) > 6 tháng, chưa điều trị thuốc kháng virus)

Lấy máu + Phỏng vấn đối tượng nghiên cứu

Xét nghiệm HBsAg Định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật Real-time

PCR Chọn những mẫu ≥ 1000 copies/ ml để giải trình tự

Giải trình tựXét nghiệm HBeAg, ALT

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đặc điểm mẫu nghiên cứu

Biểu đồ 3.1.Phân bố giới trong mẫu nghiên cứu

Trong số 505 bệnh nhân được chọn vào mẫu nghiên cứu có 289 bệnh nhân nam (57,2%), 216 bệnh nhân nữ (42,8%).

Biểu đồ 3.2 thể hiện sự phân bố độ tuổi trong mẫu nghiên cứu, với độ tuổi của các bệnh nhân dao động từ 5 đến 73 tuổi Tuổi trung bình của mẫu nghiên cứu là 35,33 ± 12,91, cho thấy sự đa dạng trong độ tuổi của người tham gia.

40 có 347 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 68,7%, nhóm tuổi từ 40 trở lên có 158 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 31,3%.

Sự phân bố các nhóm tuổi của mẫu nghiên cứu được ghi nhận trong bảng sau:

Bảng 3.1.Sự phân bố các nhóm tuổi

Nhóm tuổi từ 20 tuổi đến dưới 40 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (56,2%).

Nhóm tuổi từ 60 tuổi trở lên chiếm tỷ lệ thấp nhất (4,2%).

3.1.3 Sự phân bố nơi cư trú

Biểu đồ 3.3 Phân bố nơi cư trú trong mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu này bao gồm các bệnh nhân từ 11 tỉnh, thành phố thuộc vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, với tỷ lệ cao nhất đến từ thành phố Cần Thơ (43,4%) tương đương 219 bệnh nhân Tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (15,8%) với 80 bệnh nhân, Vĩnh Long (12,1%) với 61 bệnh nhân, và Sóc Trăng (10,9%) với 55 bệnh nhân Các tỉnh còn lại như Cà Mau (4,6%), Kiên Giang (4,0%), Bạc Liêu (3,2%), Trà Vinh (2,6%), Đồng Tháp (1,6%), An Giang (1,2%), và thấp nhất là Tiền Giang (0,7%) với 4 bệnh nhân.

3.2 SỰ PHÂN BỐ KIỂU GEN HBV VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINHHỌC

3.2.1 Sự phân bố kiểu gen

Biểu đồ 3.4 Sự phân bố kiểu gen HBV Nhận xét:

Chúng tôi ghi nhận sự hiện diện của 2 kiểu gen của HBV là B và C với tỷ lệ lần lượt là 72,9% (368 bệnh nhân) và 27,1% (137 bệnh nhân).

3.2.2 Sự phân bố dưới kiểu gen

Biểu đồ 3.5.Sự phân bố dưới kiểu gen HBV Nhận xét:

Chúng tôi ghi nhận được 6 dưới kiểu gen là B1, B2, B3, B4, C1 và C2.

Trong đó dưới kểu gen B4 chiếm tỷ lệ cao nhất (39,8%), kế đến là C2 (26,9%), B1 (19%), B3 (10,3%), B2 (3,6%) và C1 (0,4%).

Hình 3.1 Một vùng trình tự của các chủng virus HBV với kiểu gen B1

Hình 3.2.Một vùng trình tự của các chủng virus HBV với kiểu gen B2

Hình 3.3 Một vùng trình tự của các chủng virus HBV với kiểu gen B3

Hình 3.4 Một vùng trình tự của các chủng virus HBV với kiểu gen C2

Hình 3.5.Cây phân loài dưới kiểu gen HBV một số mẫu trong nghiên cứu(1)

Hình 3.6.Cây phân loài dưới kiểu gen HBV một số mẫu trong nghiên cứu (2)

Hình 3.7.Hình ảnh điện di sản phẩm PCR giải trình tự

Mẫu 320, 335, 336, 342, 347, 348: 388bpMẫu : 321, 343, 349, 350: không có sản phẩm khuếch đạiA: thang mẫu DNA

3.2.3 Một số đặc điểm sinh học

Biểu đồ 3.6 Tình trạng mang HBeAg Nhận xét:

Có 292 bệnh nhân có HBeAg dương tính (57,8%) và 213 bệnh nhân có HBeAg âm tính (42,2,%).

3.2.3.2 Tải lượng HBV DNA trong máu

Biểu đồ 3.7.Tải lượng HBV DNA trong máu

Trong 505 bệnh nhân, có 232 bệnh nhân (45,9%) có tải lượng HBV DNA trong máu 10 3 - 0,05) Bên cạnh đó, cũng không phát hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai kiểu gen B và C của HBV ở hai nhóm tuổi dưới 40.

3.2.4.2 Liên quan giữa kiểu gen HBV và một số đặc điểm sinh học

Bảng 3.4.Liên quan giữa kiểu gen HBV và một số đặc điểm sinh học Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong phân bố của hai kiểu gen B và C giữa các nhóm bệnh nhân HBeAg (+) và HBeAg (-), cũng như giữa những bệnh nhân có men gan tăng và không tăng, và những người có tải lượng HBV DNA trong máu từ 10^3 trở xuống.

0,05).

3.2.4.3 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tuổi theo giới

Bảng 3.5.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tuổi theo giới Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố kiểu gen HBV trên 2 nhóm tuổi < 40 và ≥ 40 ở nam và nữ (p > 0,05).

3.2.4.4 Liên quan giữa kiểu gen HBV và HBeAg theo giới

Bảng 3.6.Liên quan giữa kiểu gen HBV và HBeAg theo giới Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Sự phân bố kiểu gen HBV theo 2 nhóm bệnh nhân có HBeAg (+) và HBeAg (-) ở nam và nữ không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.4.5 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tải lượng HBV DNA trong máu theo giới

Bảng 3.7.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tải lượng HBV DNA trong máu theo giới Đặc điểm

Nghiên cứu cho thấy rằng kiểu gen C xuất hiện nhiều hơn ở cả nam và nữ trong nhóm bệnh nhân có tải lượng HBV DNA trong máu từ 10^3 đến dưới 10^5 copies/ml, trong khi kiểu gen B lại phổ biến hơn ở nhóm bệnh nhân có tải lượng HBV DNA từ 10^5 copies/ml trở lên Mặc dù có sự khác biệt giữa hai nhóm, nhưng sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.4.6 Liên quan giữa kiểu gen HBV và men gan (ALT) theo giới

Bảng 3.8.Liên quan giữa kiểu gen HBV và men gan (ALT) theo giới Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Sự phân bố kiểu gen HBV theo 2 nhóm bệnh nhân có men gan tăng và không tăng ở nam và nữ không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.4.7 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang HBeAg theo tuổi

Bảng 3.9.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang

HBeAg theo tuổi Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Sự phân bố kiểu gen HBV theo tình trạng mang HBeAg ở 2 nhóm bệnh nhân ≥ 40 tuổi và < 40 tuổi ở nam và nữ không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.4.8 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tải lượng HBV DNA trong máu theo tuổi

Bảng3.10.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tải lượng HBV DNA trong máu theo tuổi Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Phân bố kiểu gen HBV giữa hai nhóm có nồng độ HBV DNA ≥ 10^5 copies/ml và HBV DNA từ 10^3 đến dưới 10^5 copies/ml ở những người từ 40 tuổi trở lên và dưới 40 tuổi không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.2.4.9 Liên quan giữa kiểu gen HBV và men gan (ALT) theo tuổi

Bảng 3.11.Liên quan giữa kiểu gen HBV và men gan (ALT) theo tuổi Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Phân bố kiểu gen HBV ở hai nhóm bệnh nhân, bao gồm nhóm có men gan (ALT) tăng và nhóm không tăng, cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm ≥ 40 tuổi và nhóm < 40 tuổi (p > 0,05).

3.2.4.10 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang HBeAg theo tải lượng HBV DNA trong máu

Bảng 3.12.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang HBeAg theo tải lượng HBV DNA trong máu Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Trong nghiên cứu, bệnh nhân được chia thành hai nhóm dựa trên tải lượng HBV DNA trong máu: nhóm có tải lượng ≥ 10^5 copies/ml và nhóm có tải lượng từ 10^3 đến 0,05).

3.2.4.11 Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang kháng nguyên HBeAg theo men gan (ALT)

Bảng 3.13.Liên quan giữa kiểu gen HBV và tình trạng mang HBeAg theo men gan (ALT) Đặc điểm Kiểu gen C Kiểu gen B OR

Trong nhóm bệnh nhân có men gan tăng, tỷ lệ kiểu gen C ở nhóm HBeAg (-) đạt 35%, cao hơn so với nhóm HBeAg (+) là 22,3%, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,013) Ngược lại, ở nhóm bệnh nhân không tăng men gan, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phân bố kiểu gen HBV giữa hai nhóm HBeAg (+) và HBeAg (-) (p > 0,05).

3.2.5 Phân bố dưới kiểu gen HBV theo tuổi, giới, nơi cư trú và một số đặc điểm tố sinh học

3.2.5.1 Phân bố dưới kiểu gen HBV theo tuổi, giới, nơi cư trú

Bảng 3.14.Phân bố dưới kiểu gen HBV theo tuổi, giới. Đặc điểm

Dưới kiểu gen B4, C2 và B1 chiếm tỷ lệ cao nhất trong các nhóm bệnh nhân nam và nữ ,≥ 40 tuổi và < 40 tuổi.

Bảng 3.15.Phân bố dưới kiểu gen HBV theo nơi cư trú.

Dưới kiểu gen B4 chiếm tỷ lệ cao nhất ở các nơi khảo sát, riêng ở KiênGiang dưới kiểu gen C2 chiếm tỷ lệ cao nhất,

3.2.5.2 Phân bố dưới kiểu gen HBV theo một số đặc điểm sinh học

Bảng 3.16.Phân bố dưới kiểu gen HBV theo một số đặc điểm sinh học Đặc điểm

Trong nghiên cứu gen B4, C2 và B1, tỷ lệ chiếm ưu thế nhất được ghi nhận ở các nhóm bệnh nhân có HBeAg (+) và HBeAg (-) Ngoài ra, những bệnh nhân có men gan tăng và không tăng cũng cho thấy sự phân bố tương tự, cùng với đó là những trường hợp có tải lượng HBV DNA trong máu từ 10^3 đến dưới 10^5 copies/ml và lớn hơn hoặc bằng 10^5 copies/ml.

Không phát hiện được đột biến kháng thuốc nằm trong số những đột biến kháng thuốc đã được công bố trên 505 bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu.

3.3.2 Tỷ lệ đột biến rt V207M phát hiện được

Biểu đồ 3.9.Tỷ lệ đột biến rtV207M

Trong nghiên cứu của chúng tôi, không phát hiện đột biến kháng thuốc đã được công bố, nhưng chú ý đến đột biến rtV207M xuất hiện với tần suất 10,7% (54 mẫu) Mặc dù chưa được công nhận là đột biến liên quan đến kháng thuốc của HBV, đột biến này đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu khác.

3.3.3 Liên quan giữa đột biến rtV207M với tuổi, giới, kiểu gen và một số đặc điểm sinh học sinh học

3.3.3.1 Liên quan giữa đột biến rtV207M và tuổi, giới, kiểu gen HBV

Bảng3.17.Liên quan giữa đột biến rtV207M và tuổi, giới, kiểu gen HBV Đặc điểm

Không đột biến rtV207M OR

Tỷ lệ đột biến rtV207M ở kiểu gen B là 13,9%, cao hơn một cách có ý

200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 nghĩa thống kê so với ở kiểu gen C (2,2%) (p < 0,001) Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố đột biến rtV207M theo giới và tuổi (p> 0,05).

3.3.3.2 Liên quan giữa đột biến rtV207M và một số đặc điểm sinh học

Bảng 3.18 Liên quan giữa đột biến rtV207M và một số đặc điểm sinh học Đặc điểm

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự xuất hiện của đột biến rtV207M giữa các nhóm bệnh nhân HBeAg (+) và HBeAg (-) Bên cạnh đó, tình trạng men gan tăng hay không tăng cũng không ảnh hưởng đến sự xuất hiện của đột biến này, cũng như không có sự khác biệt ở bệnh nhân có tải lượng HBV DNA trong máu.

10 3 - 0,05).

BÀN LUẬN

Đặc điểm mẫu nghiên cứu

4.1.1 Giới tính và độ tuổi

Trong nghiên cứu với 505 bệnh nhân được lấy huyết thanh, tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 57,2%, trong khi bệnh nhân nữ là 42,8% Đối tượng chủ yếu thuộc nhóm tuổi dưới 40, chiếm 68,7%, với tuổi trung bình là 35,33 ± 12,91 Nhóm tuổi dưới 20 chỉ chiếm 12,5%, thấp hơn so với nhóm từ 20 đến dưới 40 (56,2%) và từ 40 đến dưới 60 (27,1%) Kết quả này có thể do mẫu nghiên cứu được lấy tại các phòng khám viêm gan người lớn, dẫn đến số lượng trẻ em đến khám không nhiều Theo dịch tễ học, lây nhiễm HBV tại Việt Nam chủ yếu xảy ra qua đường mẹ sang con, vì vậy tỷ lệ bệnh nhân dưới 20 tuổi đáng ra phải cao hơn Tuy nhiên, mẫu nghiên cứu có thể chưa đại diện cho toàn bộ dân số nhiễm HBV, bao gồm cả bệnh nhân đã và chưa điều trị Ngoài ra, hiệu quả của chương trình tiêm chủng mở rộng phòng ngừa HBV đã góp phần giảm tỷ lệ nhiễm trong nhóm tuổi dưới 20.

Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào các bệnh nhân đến từ khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, với tỷ lệ cao nhất là từ thành phố Cần Thơ (44,8%), tiếp theo là Hậu Giang (16,4%), Vĩnh Long (11,5%) và Sóc Trăng (10,3%) Các tỉnh khác như Kiên Giang, Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, Đồng Tháp, An Giang và Tiền Giang có tỷ lệ thấp hơn, với Tiền Giang chỉ chiếm 0,6% Tuy nhiên, kết quả này không phản ánh đầy đủ dân số nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị trong khu vực, do số lượng bệnh nhân từ Cần Thơ chiếm ưu thế so với các tỉnh khác.

Sự phân bố kiểu gen, dưới kiểu gen HBV và một số đặc điểm sinh học

4.2.1.Sự phân bố kiểu gen HBV

Trong hơn một thập niên qua, nghiên cứu về viêm gan B và virus HBV đã đạt được nhiều tiến bộ quan trọng, góp phần vào cuộc chiến chống lại căn bệnh này Đặc biệt, việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của HBV chú trọng đến đặc điểm kiểu gen và sự phân bố của virus, vì chúng có liên quan đến diễn tiến bệnh, biểu hiện lâm sàng và khả năng đáp ứng điều trị Các kiểu gen khác nhau được phân biệt dựa trên sự khác biệt trên 8% trình tự nucleotide toàn bộ bộ gen virus hoặc 4% trên gen S của virus.

Các kiểu gen của virus viêm gan B (HBV) được Okamoto xác định lần đầu vào năm 1988, bao gồm các kiểu gen A, B, C và D Nhờ sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học đã phát hiện thêm nhiều kiểu gen khác, nâng tổng số lên 10 kiểu gen (A-I) Gần đây, kiểu gen I đã được phát hiện tại Việt Nam và Lào Sự phân bố của các kiểu gen HBV khác nhau tùy thuộc vào từng vùng địa lý trên toàn cầu.

Các kiểu gen chủ yếu được phân bố như sau: Kiểu gen A tập trung ở Bắc Âu, Châu Phi và Hoa Kỳ, trong khi kiểu gen B và C phổ biến ở Viễn Đông và Đông Nam Á, bao gồm cả Việt Nam Kiểu gen D phân bố rải rác trên toàn cầu, nhưng tập trung nhiều ở khu vực Địa Trung Hải, Nam Á và Trung Đông Kiểu gen E chủ yếu hiện diện ở vùng cận Sahara, trong khi kiểu gen F xuất hiện ở châu Mỹ Các kiểu gen còn lại có tần suất ghi nhận thấp hơn.

Các kiểu gen phổ biến ở châu Á được ghi nhận là B, C và D.

Nghiên cứu của tác giả Xiaodong Li tại Trung Quốc trên 4300 bệnh nhân nhiễm HBV cho thấy có hai kiểu gen B và C, trong đó kiểu gen C chiếm ưu thế với tỷ lệ 83,86%.

Tác giả Philip Vutien nghiên cứu trên bệnh nhân người Việt Nam và Trung Quốc sống tại Bắc California, Mỹ nhận thấy kiểu gen B chiếm 67,5%, kiểu gen B chiếm 24,2% [98].

Tại Ấn Độ, tác giả Ismail A.M ghi nhân sự hiện diện của kiểu gen A, C,

D và G [72] Tác giả Bhupesh Singla ghi nhận có 3 kiểu gen: kiểu gen D (90,1%), kiểu gen C (7%) và kiểu gen A (2,8%) [106].

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự phân bố kiểu gen của virus viêm gan B (HBV) tại châu Á, với kiểu gen B chiếm 72,9% và kiểu gen C chiếm 27,1% Không có sự hiện diện của các kiểu gen HBV khác ngoài hai kiểu gen B và C.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết quả tương đồng với các nghiên cứu khác trong nước về kiểu gen HBV tại Việt Nam, trong đó kiểu gen B và C là phổ biến Đặc biệt, kiểu gen B thường chiếm tỷ lệ cao hơn so với kiểu gen C.

Bảng 4.1:Kiểu gen HBV tại Việt Nam qua các nghiên cứu trong nước

Kiểu gen phát hiện được

Bùi Hữu Hoàng [13] 45,5 34,1 A (3,4%) Đông Thị Hoài An [2] 58,6 27,6 A (1,1%)

Hồ Tấn Đạt [10] 62,3 37,7 Đặng Mai Anh Tuấn [27] 75,0 25,0

Ngoài kiểu gen B và C, một số kiểu gen khác cũng được phát hiện ở nước ta với tỷ lệ thấp như kiểu gen A, D, E, F và I [7], [18], [65].

Nghiên cứu của tác giả Bùi Xuân Trường về bệnh nhân nhiễm HBV ở miền Bắc Việt Nam cho thấy kiểu gen B chiếm 67,8% và kiểu gen C chiếm 27,9% Tương tự, nghiên cứu của Phùng Thị Bích Thủy trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Hà Nội cũng ghi nhận kiểu gen B chiếm 77%.

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn H Long cho thấy trong số bệnh nhân viêm gan B mạn tính người Việt Nam, kiểu gen B chiếm 22%, trong khi kiểu gen I chỉ chiếm 1% Đối với bệnh nhân người Trung Quốc, kiểu gen C là chủ yếu.

Nhiều nghiên cứu trong nước cho thấy kiểu gen B chiếm ưu thế hơn kiểu gen C, tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại ghi nhận sự hiện diện của kiểu gen C cao hơn kiểu gen B Cụ thể, tác giả Nguyễn Hồng Thắng đã thực hiện nghiên cứu trên 57 bệnh nhân viêm gan B mạn tính và phát hiện rằng kiểu gen C chiếm 38,6%.

Trong nghiên cứu về bệnh nhân nhiễm virus, kiểu gen B chiếm 15,8% (9 bệnh nhân), trong khi kiểu gen C chiếm 64,8% ở những người mang virus không triệu chứng và bệnh nhân có biến chứng ung thư tế bào gan, theo tác giả Lê Hữu Song Sự khác biệt này có thể do kỹ thuật xác định kiểu gen khác nhau Cả hai tác giả Nguyễn Hồng Thắng và Lê Hữu Song đều áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR để phân tích đa hình của một đoạn gen giới hạn.

Nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện kiểu gen đồng bội nhiễm giữa các kiểu gen HBV, điều này cho thấy sự hạn chế của kỹ thuật giải trình tự trong xác định kiểu gen Trong khi đó, kỹ thuật RFLP-PCR, thường được sử dụng để xác định kiểu gen HBV, có khả năng phát hiện các kiểu gen đồng bội nhiễm Các kết quả từ hai kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau, bao gồm giải trình tự và RFLP-PCR, được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 4.2.Kiểu gen HBV tại Việt Nam xác định bằng kỹ thuật giải trình tự và RFLP-PCR

Kỹ thuật giải trình tự

Hồ Tấn Đạt [10] 62,3 37,7 Đặng Mai Anh Tuấn [27] 75,0 25,0

Lê Hữu Song [19] 9,3 64,8 D, E, F BC,BD,BE, CE, CF

BC, CD, CF Đông Thị Hoài An [1] 68,2 17,1 A (0,9%) BC (3,1%)

Kiểu gen đồng bội nhiễm BC là dạng thường gặp nhất, với tần suất phát hiện khác nhau tùy theo từng tác giả Cụ thể, Bùi Xuân Trường ghi nhận tỷ lệ 2,7% [40], trong khi Lê Hữu Song cho con số 12,9% [19], và Cao Minh Nga, qua nghiên cứu trên bệnh nhân trẻ em, đã xác định tỷ lệ này lên tới 22,8% [16].

Nhiều nghiên cứu cho thấy kiểu gen HBV ảnh hưởng đến diễn tiến bệnh từ cấp tính sang mạn tính, với tần suất biến chứng xơ gan và ung thư gan khác nhau giữa các kiểu gen Tại Việt Nam, hai kiểu gen phổ biến là B và C, trong đó kiểu gen C thường có diễn tiến bệnh xấu hơn và đáp ứng điều trị kém.

Nghiên cứu của Bùi Hữu Hoàng (2003) cho thấy kiểu gen C chiếm ưu thế ở bệnh nhân ung thư gan, trong khi kiểu gen B phổ biến hơn ở những người mang HBsAg mạn tính Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi về đối tượng nhiễm HBV mạn tính.

Trên đối tượng viêm gan B cấp, nghiên cứu của tác giả Đông Thị Hoài

Nghiên cứu cho thấy kiểu gen B và C có tần suất lần lượt là 58,6% và 27,6%, trong khi kiểu gen A chỉ chiếm 1,1% Tỷ lệ kiểu gen B/C trong nghiên cứu của chúng tôi là 72,9%/27,1%, cao hơn so với tỷ lệ 58,6%/27,6% được báo cáo bởi tác giả Đông Thị Hoài An.

Đột biến kháng thuốc

Bằng kỹ thuật giải trình tự một đoạn gen trên gen P có chiều dài 388-

416 bps, chúng tôi không phát hiện được đột biến kháng thuốc, đặc biệt là đột biến kháng Lamivudine, Adefovir và Entecavir.

Trong quá trình tự nhân lên của virus, nhiều đột biến gen có thể phát sinh, đặc biệt là trên gen P của HBV, ảnh hưởng đến mức độ nhạy cảm với thuốc kháng virus đường uống HBV có khả năng tăng sinh mạnh với tốc độ 10^12 - 10^13 hạt virus mỗi ngày Các đột biến này xảy ra liên tục do virus thiếu khả năng sửa sai trong quá trình nhân lên, dẫn đến tần suất cao khoảng 1,4 – 3,2 x 10^-5 đột biến mỗi chu kỳ tại một vị trí nucleotide.

Các đột biến trên bộ gen của virus viêm gan B (HBV) được chọn lọc bởi ưu thế đối với đáp ứng miễn dịch của vật chủ và các yếu tố như thuốc kháng virus Những đột biến này xảy ra trong vùng tác động của thuốc (gen P), làm thay đổi cấu trúc vùng hoạt tính phiên mã ngược (vùng rt) của enzyme polymerase, dẫn đến giảm hoặc mất khả năng gắn kết của thuốc Gen P được chia thành bốn vùng: Terminal Protein, Spacer, Reverse transcriptase (RT) và RNaseH Trong đó, vùng RT lại được chia thành các vùng nhỏ A, B, C, D, E, F và G, với các vùng A, B, C và D là nơi có thể xuất hiện các đột biến liên quan đến kháng thuốc.

Các vị trí đột biến có liên quan đến các thuốc đồng phân nucleotide đã được công bố thể hiện trong hình 4.1.

Hình 4.1 Các vị trí đột biến kháng thuốc trên gen RT của HBV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị thuốc kháng virus còn hạn chế trên toàn cầu Những nghiên cứu này nhằm xác định khả năng mang gen kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân chưa từng điều trị, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về khả năng kháng thuốc của virus Điều này giúp xây dựng các biện pháp chẩn đoán, theo dõi và phác đồ điều trị phù hợp Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc ở bệnh nhân chưa điều trị là rất thấp, dưới 10%.

[107] Một số nghiên cứu không phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc [75], [115] Tuy nhiên các nghiên cứu đầy đủ với cỡ mẫu đủ lớn vẫn còn ít.

Nghiên cứu của Severine Margeridon tại Mỹ cho thấy trong số 17 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị, không phát hiện đột biến kháng thuốc Tương tự, nghiên cứu của Nguyen Long H trên nhóm bệnh nhân người châu Á (chủ yếu là người Việt Nam và Trung Quốc) cũng chỉ ra tỷ lệ đột biến kháng thuốc dưới 1% Theo Elizabeth C Reuman, tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở 45 bệnh nhân nhiễm HBV chưa điều trị là 2,9% Cuối cùng, nghiên cứu của Philip Vutien trên đối tượng người Việt Nam và Trung Quốc sống tại Mỹ cũng ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc là 1%.

Tại Trung Quốc, Tác giả Jie Ma nghiên cứu trên 75 bệnh nhân viêm gan

Trong một nghiên cứu, tỷ lệ đột biến kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân mắc bệnh mạn tính chưa điều trị (29 bệnh nhân) và nhóm thất bại điều trị (46 bệnh nhân) được ghi nhận là dưới 2%.

Tại Ấn Độ, tác giả Ismail A M.nghiên cứu trên 97 bệnh nhân viêm gan

Nghiên cứu của tác giả Bhupesh Singla trên 71 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị cho thấy có 4 bệnh nhân mang virus có đột biến kháng Adefovir và 3 bệnh nhân có đột biến kháng Lamivudine, với tỷ lệ đột biến kháng thuốc là 8,8%.

Nghiên cứu của tác giả Mirandola S trên 286 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị tại Ý đã phát hiện 13 bệnh nhân (5%) có đột biến kháng thuốc, bao gồm các đột biến kháng Lamivudine, Adefovir và Entecavir.

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự phát triển của đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị, cung cấp bằng chứng về kháng thuốc sau các khoảng thời gian điều trị khác nhau Tuy nhiên, nghiên cứu về đột biến kháng thuốc của virus viêm gan B (HBV) trên bệnh nhân nhiễm HBV và viêm gan B mạn tính chưa điều trị còn hạn chế, với thiếu sót trong việc thực hiện các nghiên cứu có cỡ mẫu lớn Một số nghiên cứu trong nước đã phát hiện đột biến kháng thuốc ở bệnh nhân chưa điều trị và bệnh nhân đang điều trị, nhưng tỷ lệ phát hiện vẫn còn thấp.

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hùng Cường trên 67 bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị cho thấy tỷ lệ phát hiện đột biến kháng thuốc Lamivudine là 3,84%, trong khi đó không có trường hợp nào kháng Adefovir và Entecavir.

Tác giả Đặng Mai Anh Tuấn đã nghiên cứu đột biến kháng thuốc của virus viêm gan B (HBV) từ 894 mẫu máu bệnh nhân tại các bệnh viện TP Hồ Chí Minh, trong đó bao gồm cả bệnh nhân đang điều trị và chưa điều trị Kết quả cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc chung là 9,28%, với 4,7% trường hợp kháng Lamivudine Tuy nhiên, tác giả không ghi nhận tần suất đột biến kháng thuốc ở nhóm bệnh nhân chưa điều trị.

Nghiên cứu của chúng tôi với 505 bệnh nhân chưa điều trị cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV là rất thấp hoặc không có, phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước Kết quả này cung cấp cơ sở quan trọng cho bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân mới bắt đầu dùng thuốc kháng virus đường uống.

Khi so sánh tỷ lệ đột biến kháng thuốc của virus viêm gan B (HBV) ở các thời điểm khác nhau, bao gồm trước điều trị và sau 1, 2, 3 năm điều trị, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc tăng dần theo thời gian Mức độ gia tăng này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó đặc điểm rào cản kháng thuốc của thuốc điều trị đóng vai trò quan trọng nhất.

Bảng 4.5:So sánh tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine của HBV ở các thời điểm khác nhau

Thời gian điều trị Lamivudine

Bảng 4.5 cho thấy tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine tăng nhanh theo thời gian trong quá trình điều trị, so với tỷ lệ kháng thuốc trước khi điều trị Điều này cho thấy Lamivudine, mặc dù có hiệu quả ức chế virus tốt, dung nạp tốt và ít tác dụng phụ, nhưng lại có hàng rào kháng thuốc thấp.

4.3.2 Kỹ thuật giải trình tự xác định kiểu gen, dưới kiểu gen và phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV

Có nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV, mỗi kỹ thuật có ưu nhược điểm và ứng dụng khác nhau Các phương pháp phổ biến bao gồm Real-time PCR, PCR kết hợp lai phân tử (INNO-LiPA), PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn (RFLP), và giải trình tự Trong số đó, giải trình tự được coi là kỹ thuật tối ưu cho nghiên cứu đột biến trên bộ gen virus, bao gồm cả các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc.

Kỹ thuật giải trình tự nucleotide giúp phát hiện các thay đổi trong trình tự gen, cho phép nhà nghiên cứu xác định đặc điểm kiểu gen, nhóm kiểu gen và các đột biến, cả đã biết lẫn chưa biết Máy giải trình tự tự động hoạt động dựa trên nguyên lý của phương pháp Sanger cải tiến, sử dụng các ddNTP được đánh dấu bằng chất huỳnh quang khác nhau thay vì đồng vị phóng xạ.