ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
* Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
- Dung dịch đệm Taq DNA polymerase 10 X
- Dung dịch MgCl 2 , MgSO 4 25mM
- Nước cất vô trùng (ddH 2 O)
* Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose
- Dung dịch điện di TAE
- Dung dịch hòa loãng mẫu 6X
* Hóa chất dùng để biểu hiện cảm ứng của gen
* Hóa chất dùng để tách chiết plasmid
- Dung dịch Sol I: Tris-HCl 25 mM pH 8; EDTA10mM pH 8,0; Glucose 50 mM; RNase A 10 mg/ml
- Dung dịch Soll II: SDS 1%, NaOH 0, 2 N
- Dung dịch Soll III: Potassium acetate 3 M; acetic acid 11, 5% (pH 5.2)
Các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng quốc tế có uy tín và đều đạt được độ tinh khiết để dùng phân tích.
Các thiết bị máy móc dùng trong nghiên cứu
Các thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:
- Bể điện di đứng loại nhỏ
- Hệ thống chụp ảnh gel (Bio-rad)
Các phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu chính bao gồm hồi cứu bệnh án và thu thập dữ liệu lâm sàng, kết hợp với thực nghiệm nhằm xác định chính xác sự hiện diện của đột biến gen FLT3-ITD ở bệnh nhân.
2.4.1 Đánh giá tình trạng bệnh nhân bằng các tiêu chí lâm sàng
- Tiêu chuẩn chẩn đoán lơ xê mi:
+ Lâm sàng: Bệnh nhân (BN) có hội chứng thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và thâm nhiễm
+ Xét nghiệm: Bệnh nhân có số lượng blast ≥ 20% tế bào tủy xương hoặc máu
- Theo tiêu chuẩn của NCCN năm 2011
Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn [44]:
- Lâm sàng: Không có biểu hiện triệu chứng của bệnh
Mật độ tế bào tủy bình thường và tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy phải dưới 5% Đồng thời, trong máu ngoại vi không được có tế bào non, với số lượng tiểu cầu phải lớn hơn 100G/l và số lượng bạch cầu hạt trung tính phải vượt quá 1G/l.
+ BN không phụ thuộc vào truyền máu
+ Không có dấu hiệu xâm lấn ngoài tủy
Tiêu chuẩn lui bệnh không hoàn toàn [44]:
+ Tỷ lệ tế bào non trong tủy từ 5- 25%
+ Máu ngoại vi không có tế bào non, số lượng tiểu cầu > 100G/l, bạch cầu hạt trung tính > 1G/l
Tiêu chuẩn không lui bệnh [44]:
+ Tỷ lệ tế bào non trong tủy > 25%
Hội chứng thiếu máu: Bệnh nhân thường xanh xao, mệt mỏi
Hội chứng xuất huyết là tình trạng phổ biến, chiếm khoảng 50% đến 72% trường hợp, chủ yếu liên quan đến xuất huyết dưới da và niêm mạc Trong những trường hợp nặng hơn, có thể xảy ra xuất huyết nội tạng, đặc biệt là ở thể M3, nơi thường gặp tình trạng xuất huyết do rối loạn đông máu rải rác trong lòng mạch.
2.4.2 Tách chiết và định lượng DNA tổng số
Mẫu máu bệnh nhân được thực hiện qua qui trình tách chiết và tinh sạch DNA theo kít của QIA amp DNA Mini Kit như sau:
Mẫu máu 200 μl từ bệnh nhân chẩn đoán AML tại Viện Huyết học-Truyền máu TW được cho vào ống eppendorf 1,5 ml Sau đó, lần lượt bổ sung 20 μl dung dịch protease, 4 μl RNase 10 mg/ml và 200 μl dung dịch đệm AL Hỗn hợp này được trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để tạo thành dung dịch đồng nhất và được ủ.
Hỗn hợp được gia nhiệt ở 56 độ C trong 10 phút, sau đó được ly tâm nhẹ ở tốc độ 3000 vòng/phút để lắng đọng Tiếp theo, bổ sung 200 μl dung dịch ethanol tuyệt đối và trộn đều bằng máy vortex Cuối cùng, hỗn hợp được đưa vào cột và ly tâm ở 8000 vòng/phút, loại bỏ dịch đi qua cột.
Cột được xử lý bằng cách bổ sung 500 μl dung dịch đệm AW1, sau đó ly tâm ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ dịch đi qua cột Tiếp theo, bổ sung 500 μl dung dịch đệm AW2, ly tâm lại với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ dịch đi qua cột.
Cột được chuyển sang ống eppendorf thể tích 1,5ml mới, 200 μl nước vô trùng được bổ sung, hỗn hợp được giữ 1 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 8000 vòng trong
1 phút Dịch cuối cùng đi qua cột là DNA tổng số Mẫu được bảo quản - 20 o C để làm các thí nghiệm tiếp theo
2.4.2.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo hấp thụ ở bước sóng 260nm
Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân chẩn đoán AML được xác định qua việc đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) bằng máy nanodrop Sau khoảng 5 giây, kết quả sẽ xuất hiện Phương pháp này dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các baso nito tại bước sóng 260 nm.
Để định lượng DNA trong mẫu tách chiết, sử dụng hệ số A260 = 1 tương đương với hàm lượng DNA sợi đôi là 50 μg/ml và áp dụng công thức C = A260 x 50 x n (n là số lần pha loãng) Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, cần đo A280, nơi mà protein hấp thụ cao nhất Do protein cũng hấp thụ ánh sáng ở A260, điều này có thể làm sai lệch nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid được coi là sạch khi tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.8 – 2 Nếu tỷ số dưới 1.8, dung dịch có thể còn lẫn RNA, trong khi tỷ số trên 2 cho thấy có nhiều protein, yêu cầu phải tách chiết lại để đảm bảo chất lượng mẫu cho phản ứng PCR.
2.4.3 Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp Bibdo
Sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch, một khuẩn lạc trắng được chuyển vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 2ml dung dịch LB lỏng và 2 μl ampicilin nồng độ 100 ng/ml Ống nghiệm được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút tại nhiệt độ 37 độ C trong khoảng 14-16 giờ Sau đó, dịch nuôi cấy được chuyển sang ống Eppendorf và ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu tủa tế bào.
Tế bào được hòa trong 200 μl dung dịch Sol I kết hợp với 0,5% RNase 1mg/ml (khoảng 20 μl) và trộn đều bằng máy vortex trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, bổ sung 400 μl dung dịch Sol II, đảo ngược ống 5 lần mà không sử dụng máy vortex, và ủ ở 4°C trong 1 phút, lặp lại 5 lần để phá vỡ tế bào và giải phóng plasmid.
Hỗn hợp được trung hòa bằng 300 μl dung dịch Sol III và đảo nhẹ ống mà không sử dụng máy vortex Sau đó, ủ ở -20 o C trong 1 phút, lặp lại trong 20 phút Dịch nổi thu được sau khi ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút tại 4 o C, khoảng 800 – 900 μl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới, chú ý tránh hút vào tủa trong quá trình này.
Cuối cùng, bổ sung 600 μl dung dịch Isopropanol và ủ ở -20°C trong thời gian từ 2 giờ đến qua đêm Tiến hành tách plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C, sau đó loại bỏ dung dịch và thêm 400 μl ethanol, tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C Thực hiện ly tâm thêm một lần nữa ở cùng tốc độ và nhiệt độ, sau đó loại bỏ hoàn toàn cồn, mở nắp ống Eppendorf và đặt vào tủ ấm ở 37°C trong khoảng 30 phút.
45 phút Kiểm tra không còn cồn, bổ sung 50 μl nước free nucleasa Lắc trộn đều và tiến hành đo nanodrop và điện di Bảo quản mẫu ở - 20 o C
2.4.4 Điện di phân tách DNA trên gel agarose
Sau khi kiểm tra nồng độ DNA bằng phương pháp đo hấp thụ ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng A 260/A 280, chúng tôi tiến hành điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% trong đệm TBE 1X với hiệu điện thế 90V trong 1 giờ Để chuẩn bị đệm TBE 10X, hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, sau đó thêm 40 ml EDTA 0,5 M và nước cất khử ion cho đủ 1 lít Cuối cùng, hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 phút và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 1% trong 10 phút và soi bản gel trên hệ thống máy đọc geldot
2.4.5 Nhân bản gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen FLT3
Các mồi nhân đoạn gen FLT3 được phát triển dựa trên nghiên cứu của Kyo và cộng sự (1999) và đã được áp dụng thành công tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen được thiết lập như sau:
+ Đối chứng dương 1: DNA genome của người không có đột biến ITD trên gen FLT3
+ Đối chứng dương 2: DNA genome của người có đột biến ITD trên gen FLT3 + Đối chứng âm (nước cất khử trùng ion)
Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR
TT Thành phần Thể tích của 1 phản ứng (μl)
DNA tổng số được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu FLT3 Cặp mồi này cho phép nhận diện đoạn gen có kích thước từ 300 đến 400 bp.
Thành phần của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2
Chu trình nhiệt của phản ứng như sau:
Sản phẩm của PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel agarose 2%
2.4.6 Nhân dòng gen FLT3 vào E coli
Tinh sạch đoạn gen mang đột biến FLT3 bằng kít thôi gel của hãng Promega
Phân tích, xử lý số liệu theo phương pháp nghiên cứu
- Số liệu trung bình, độ lệch chuẩn, so sánh sự chênh lệch giữa 2 biến (giá trị p) được phân tích bằng Excel 2010.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân AML chọn nghiên cứu sự có mặt của đột biến gen FLT3
sự có mặt của đột biến gen FLT3
3.1.1 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo tuổi
Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả
STT Tác giả Số lượng
Tỷ lệ mắc của BN AML
Kết quả phân tích cho thấy bệnh nhân AML tham gia nghiên cứu có độ tuổi từ 17 đến 82, với độ tuổi lớn nhất là 82 và nhỏ nhất là 17 Đặc biệt, tỷ lệ bệnh nhân dưới 60 tuổi chiếm 84,7%.
60 tuổi chiếm tỷ lệ là 15,3%
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam, như nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh năm 2013, cho thấy 89% bệnh nhân AML dưới 60 tuổi và 11% trên 60 tuổi Tương tự, Phan Nguyễn Thanh Vân năm 2013 ghi nhận 92,6% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy dưới 60 tuổi và 7,4% trên 60 tuổi tại Bệnh viện Huyết học - Truyền máu Thành phố Hồ Chí Minh Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Triệu Vân năm 2008 cũng cho thấy 81,2% bệnh nhân dưới 60 tuổi tại Viện Huyết học - Truyền máu.
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh AML ở bệnh nhân dưới 60 tuổi đạt 82,1%, tương tự như kết quả của các tác giả Phạm Quang Vinh (2003) và Nguyễn Thị Minh An (1969-1974) Điều này cho thấy rằng các nghiên cứu trong nước đều chỉ ra tỷ lệ cao mắc bệnh AML ở nhóm tuổi dưới 60.
Nghiên cứu của chúng tôi về bệnh nhân mắc bệnh AML cho thấy kết quả tương đồng với các nghiên cứu quốc tế Cụ thể, tác giả Rosemary (2008) đã khảo sát 1425 bệnh nhân và ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân dưới 60 tuổi đạt 97,5%, trong khi tỷ lệ bệnh nhân trên 60 tuổi chỉ chiếm 2,5% Tương tự, tác giả Shell cũng đã có những kết quả tương tự trong nghiên cứu của mình.
Năm 2011, tỷ lệ bệnh nhân dưới 60 tuổi là 83,9%, trong khi tỷ lệ trên 60 tuổi là 16,1% Kết quả nghiên cứu của tác giả Thiede năm 2002 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm dưới 60 tuổi chỉ là 60,6% và trên 60 tuổi là 33,4% khi ông nghiên cứu trên 979 bệnh nhân.
Các nghiên cứu cho thấy độ tuổi mắc bệnh AML của các tác giả trong nước và quốc tế có sự tương đồng.
3.1.2 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo giới
Hình 3.1 Phân bố của bệnh AML theo giới
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 69 bệnh nhân nam (50,4%) và 68 bệnh nhân nữ (49,6%), kết quả tương tự như các nghiên cứu trước đây Kiều Thị Vân Oanh báo cáo 100 bệnh nhân AML với tỷ lệ nam 49% và nữ 51% Phạm Quang Vinh (2003) nghiên cứu 203 bệnh nhân, trong đó 133 bệnh nhân nam (51,95%) và 123 bệnh nhân nữ (48,05%) Nguyễn Triệu Vân (2008) khảo sát 1118 bệnh nhân lơ xê mi cấp, với 623 bệnh nhân nam (52,8%) và 495 bệnh nhân nữ (44,2%) Phan Nguyễn Thanh Vân nghiên cứu 162 bệnh nhân AML, cho thấy tỷ lệ nam 51,9% và nữ 48,1% Sheng (2011) khảo sát 1185 bệnh nhân, với tỷ lệ nam 55% và nữ 46% Tương tự, nghiên cứu của Schnitinger (2005) cũng cho kết quả tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi.
3.1.3 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB
Bảng 3.2 Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB
FAB Số lƣợng (n7) Tỷ lệ%
Trong nghiên cứu của chúng tôi về phân bố thể bệnh theo phân loại AML của FAB, có sự hiện diện của 8 thể (M0-M7), trong đó thể M2 chiếm tỷ lệ cao nhất với 32,85%, tiếp theo là thể M4 với 24,09% và thể M3 với 18,25% Các thể M6, M7 và M0 ít gặp hơn Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh, khi thể M2 cũng chiếm tỷ lệ cao nhất là 28%, và thể M4 là 24% Tương tự, nghiên cứu của Phạm Quang Vinh (2003) với 256 bệnh nhân cho thấy thể M2 chiếm 26,11% và thể M4 là 15,77% Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Bá Khanh trên 65 bệnh nhân cũng ghi nhận thể M2 chiếm 43,3% và thể M4 26,5%.
Tác giả Phan Nguyễn Thanh Vân đã phân loại bệnh nhân theo phương pháp FAB và ghi nhận tỷ lệ cao ở thể M2 với 61,1%, tiếp theo là thể M3 với 14,3% và thể M4 với 12,3% Ngoài ra, tỷ lệ bệnh nhân ở các thể M0, M6, M7 được ghi nhận là thấp.
Huỳnh Thị Bích Huyền và cộng sự khi nghiên cứu trên 169 bệnh nhân được chẩn đoán AML cũng cho thấy thể M2 chiếm tỷ lệ cao là 50,9% [6]
Theo tác giả Moore (2005) nghiên cứu trên 474 bệnh nhân ông gặp cao nhất thể M2 trong nghiên cứu là 36% và thể M4 là 21% [39]
Kết quả của chúng tôi cũng tương tự như các tác giả trong nước và ngoài nước thể M0, M6, M7 ít gặp [12,24,27,37,47]
3.1.4 So sánh hiệu quả điều trị lâm sàng giữa nhóm có đột biến và không có đột biến FLT3-ITD
Hình 3.2 So sánh kết quả điều trị giữa nhóm có đột biến và không đột biến
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn ở nhóm bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD là 21,43%, thấp hơn so với 28,45% ở nhóm bệnh nhân không có đột biến này Bên cạnh đó, tỷ lệ lui bệnh một phần ở những bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD cũng được ghi nhận.
Tỷ lệ lui bệnh của nhóm bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD là 28,57%, thấp hơn so với 31,71% của nhóm không có đột biến Trong khi đó, tỷ lệ không lui bệnh và tái phát ở bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD là 50%, cao hơn so với 39,84% ở nhóm không có đột biến.
Nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh trên 100 bệnh nhân cho thấy tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn ở nhóm có đột biến gen FLT3-ITD là 66,7%, trong khi nhóm không có đột biến đạt 72%, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Tương tự, nghiên cứu của Rosemary và cộng sự trên 1135 bệnh nhân cho thấy tỷ lệ lui bệnh ở nhóm có đột biến FLT3-ITD là 86% và nhóm không có là 85%, cũng không có sự khác biệt đáng kể Mặc dù vậy, nhóm có đột biến gen FLT3-ITD có tỷ lệ lui bệnh thấp hơn và tỷ lệ tái phát cao hơn Nghiên cứu của Soll và cộng sự trên 99 bệnh nhân từ 65-85 tuổi cho thấy tỷ lệ lui bệnh ở nhóm có đột biến gen FLT3 là 42,18%, trong khi nhóm mang gen WT-FLT3 là 48,9%, với sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, nhưng nhóm có đột biến FLT3 lại có tiên lượng xấu hơn.
Phân tích sự có mặt của đột biến gen FLT3
3.2.1 Tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi đã thu thập mẫu máu từ bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh AML tại Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, sau đó tiến hành tách chiết DNA tổng số bằng kit Qiagen theo quy trình tại mục 2.4.2.
Chúng tôi tiến hành định lượng DNA tổng số 142 mẫu (137 mẫu của bệnh nhân và 5 mẫu của người bình thường) bằng cách đo hấp thụ ở bước sóng 260 nm
(A 260 ) và bước sóng 280 nm (A 280 ) kết quả (Phụ lục I) cho thấy các mẫu DNA có nồng độ từ 16,74 - 155 ng/μl
Khi kiểm tra chất lượng băng DNA trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy sản phẩm DNA từ mẫu máu của bệnh nhân vẫn nguyên vẹn và không bị lẫn RNA Hầu hết các mẫu tách được đều tạo ra một băng kích thước lớn và rõ nét, chứng tỏ DNA thu được đủ tinh sạch cho các phân tích tiếp theo.
Hình 3.3 Hình ảnh một số mẫu bệnh nhân AML đƣợc tách DNA tổng số
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1 kb; Giếng 2-25 DNA tổng số tương ứng với mẫu 157-180 của bệnh nhân
3.2.2 Nhân bản đoạn gen mã hóa FLT3 bằng PCR Để khuyếch đại đoạn gen mang đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân AML trên exon 14 và 15 của gen FLT3, chúng tôi sử dụng khuân DNA tổng số được tinh sạch ở trên Chúng tôi thấy kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu FLT3 11FW và FLT3 12R với chu kỳ biến nhiệt là 35 chu kỳ gồm có 3 giai đoạn được giới thiệu trong mục 2.4.5
Hình 3.4 Sàng lọc mẫu bệnh nhân AML bằng PCR
Giếng 1: Đối chứng âm không có DNA khuôn
Giếng 2: Thang chuẩn DNA 100 bp
Giếng 3-6: Sản phẩm PCR tương ứng với mẫu bệnh nhân 124-127
Giếng 7-8: Sản phẩm PCR tương ứng với mẫu bệnh nhân 146, 160
Kết quả từ hình 3.4 cho thấy mẫu đối chứng âm không có băng nhân bản, trong khi hầu hết các mẫu khác đều xuất hiện băng nguyên bản 330 bp Đặc biệt, mẫu ở giếng số 3, 6, 7, 8 tương ứng với các mẫu bệnh phẩm số 124, 127, 146, 160, ngoài băng kích thước 330 bp còn có sự xuất hiện của các băng khác.
Bốn bệnh nhân được nghiên cứu có sự xuất hiện của hai băng phụ với kích thước khoảng trên 330 bp, cho thấy khả năng mang đột biến FLT3-ITD Theo lý thuyết, các mẫu bệnh nhân bình thường không có đột biến FLT3-ITD chỉ cho một băng duy nhất kích thước khoảng 330 bp, trong khi các trường hợp có đột biến này sẽ có thêm đoạn lặp lại trong gen với kích thước lớn hơn 330 bp.
Kết quả điện di cho thấy ở các mẫu ở giếng 3, 6, 7, 8 gợi ý đây là các mẫu có thể mang băng đột biến do đó có thêm băng phụ
3.2.3 Nhân dòng FLT3 vào vector
Hình 3.5 Hình ảnh tinh sạch băng đột biến FLT3
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp
Giếng 2-5: Sản phẩm tinh sạch thôi gel có băng đột biến FLT3 tương ứng với mẫu bệnh nhân số 124, 127, 146, 160 Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của đột biến FLT3 ở trên bệnh nhân được sàng lọc đột biến FLT3, chúng tôi chọn lọc bệnh nhân số 124, 127, 146, 165 điện di sản phẩm PCR trên gen agarose 2% và thôi gel để thu băng DNA Chế phẩm DNA sau khi được tinh sạch và kiểm tra bằng điện di, kết quả thu được ở hình 3.5 cho thấy có 1 băng duy nhất kích thước khoảng 400 bp, chứng tỏ rằng băng đột biến tinh sạch đạt yêu cầu
Chế phẩm DNA tinh sạch được gắn vào vector pGEM-T và biến nạp vào tế bào E coli DH5α trong môi trường TSA bổ sung ampicilin 100 µg/ml, 15 µl Xgal, và 15 µl IPTG để thu được khuẩn lạc dương tính Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ xuất hiện màu trắng trên môi trường có Xgal và IPTG Chúng tôi đã sàng lọc các khuẩn lạc này để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen FLT3, nhằm xác định liệu chúng có mang đoạn gen đột biến hay không Từ mỗi đĩa, chúng tôi ngẫu nhiên chọn 4 khuẩn lạc để thực hiện PCR với cặp mồi pUC 19FW và pUC 19RV, đặc hiệu với vector pGEM-T Nếu nhân dòng không thành công, sản phẩm PCR sẽ có kích thước 318 bp; ngược lại, nếu thành công, sản phẩm sẽ có kích thước khoảng 700 bp, bao gồm đoạn gen được chèn và đoạn 318 bp của vector.
Hình 3.6 Điện di khuẩn lạc sau khi nhân dòng FLT3
Giếng 1: Thanh chuẩn DNA 100 bp; Giếng 2: đối chứng âm
Giếng 3: Mẫu 60d.10: plasmid không mang băng đột biến
Giếng 4: Mẫu 60d.8: plasmid có mang băng đột biến
Giếng 6 và giếng 9 tương ứng mẫu 146.5 và 160.2 có băng đột biến plasmid Giếng 5, giếng 7, 8 tương ứng mẫu 146.4, 146.6, 146.7
Giếng 10-12 tương ứng mẫu 160.3-160.5: Khuẩn lạc không mang băng đột biến Kết quả điện di ở hình 3.6 cho thấy, sản phẩm PCR với cặp mồi pUC 19 FW và pUC19 RV cho băng kích thước khoảng 700 bp (giếng 6, 9 hình 3.6), còn lại các băng không cho kích thước mong muốn chứng tỏ các khuẩn lạc trắng này không mang đoạn gen đột biến FLT3 như lý thuyết Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định hai mẫu khuẩn lạc chúng tôi chọn mang plasmid tái tổ hợp và đã nhân dòng thành công đoạn gen FLT3 mang đột biến gây bệnh AML vào vector pGEM-T
3.2.4 Xác định trình tự gen FLT3 mang gen đột biến
Sau khi nuôi cấy và tách chiết plasmid, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó được gửi đi phân tích trình tự tại công ty.
Macrogene (Hàn Quốc) Kết quả chúng tôi nhận được như trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7 Kết quả giải trình tự mẫu 146.5 có đột biến 45 bp
Khi so sánh trình tự của mẫu 146.5 với đoạn gen FLT3 gốc được cung cấp trên
Chúng tôi đã xác định được đoạn gen FLT3 từ Genbank, kèm theo đoạn chèn khoảng 45 bp Kết quả giải trình tự đột biến gen FLT3 này cũng đã được nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Thanh Trung năm 2014, liên quan đến tối ưu quy trình và phát hiện đột biến phân tử trên gen FLT3, được trình bày trong phụ lục III.
Như vậy, kết quả đọc trình tự cho phép chúng tôi khẳng định mẫu thu được chứa đột biến FLT3-ITD
3.2.5 Phân tích kết quả đột biến gen FLT3 - ITD với đột biến nhiễm sắc thể
Bảng 3.3 Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen FLT3-ITD với đột biến nhiễm sắc thể n
(FLT3-ITD) P n Tỷ lệ % Đột biến nhiễm sắc thể
Nghiên cứu về bất thường di truyền đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh Theo nghiên cứu của Phạm Quang Vinh, hơn 70% bệnh nhân mắc bệnh AML có bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể.
Lơ xê mi cấp là một tình trạng lâm sàng và di truyền phức tạp, trong đó đột biến di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tiên lượng bệnh Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ bệnh nhân có đột biến nhiễm sắc thể kèm theo đột biến FLT3-ITD là 11,76%, đây là một dấu hiệu tiên lượng xấu và cần thiết phải tiến hành ghép tủy đồng loại ngay sau khi bệnh nhân đạt lui bệnh hoàn toàn lần đầu Tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân không có tổn thương nhiễm sắc thể là 9,71%, tuy nhiên sự khác biệt giữa hai nhóm này chưa có ý nghĩa thống kê So với nghiên cứu của Kiều Thị Vân Oanh, tỷ lệ bệnh nhân có đột biến nhiễm sắc thể kèm theo đột biến gen FLT3-ITD là 13,3%, trong khi tỷ lệ nhiễm sắc thể bình thường có đột biến gen là 29,4% Đặc biệt, trong nghiên cứu của chúng tôi không ghi nhận trường hợp nào có tổn thương FLT3-ITD kèm theo chẩn đoán M3, cho thấy cần có một mẫu nghiên cứu lớn hơn để đưa ra kết luận chính xác hơn về vấn đề này.
3.3 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân có đột biến gen FLT3
3.3.1 Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD
Bảng 3.4 Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD
Nhóm đột biến (FLT3-ITD)
Nhóm không đột biến (FLT3-ITD)
Hồng cầu (T/l) 2,79 ± 0,34 3,27 ±0,77 > 0,05 Huyết sắc tố (g/l) 103,73 ± 23 101 ±24,7 > 0,05
Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ số hồng cầu ở nhóm bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD là 2,79 ± 0,34 T/l, thấp hơn so với nhóm không có đột biến gen là 3,27 ± 0,77 T/l, tuy nhiên sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p>0,05) Đối với chỉ số huyết sắc tố (Hb), nhóm không có đột biến gen có giá trị 101 ± 24,7 g/l, thấp hơn so với nhóm có đột biến gen là 103,73 ± 23 g/l Nguyên nhân có thể do bệnh nhân trong giai đoạn điều trị hóa chất thường rơi vào tình trạng thiếu máu và giảm huyết sắc tố.
Nghiên cứu của tôi cho thấy nhóm có đột biến gen FLT3-ITD có lượng huyết sắc tố là 99,77 ± 22,86 g/l, trong khi nhóm không có đột biến gen FLT3-ITD là 79,35 ± 18,67 g/l Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Lưu Thị Thu Hương, trong đó lượng huyết sắc tố của bệnh nhân AML là 92,07 ± 12,56 g/l, khẳng định tính chính xác của các phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi.
Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hà Thanh và cộng sự chỉ ra rằng bệnh nhân AML trong giai đoạn điều trị đều gặp tình trạng thiếu máu, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng như nghiên cứu của Đặng Xuân Hoàng (2013) về điều trị AML tái phát bằng phác đồ Cytarabin liều cao.