Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
- Chicken anemia infectious virus (CIAV) lưu hành ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận.
Nội dung nghiên cứu
Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện các nội dung sau:
- Xác định tỷ lệ lưu hành vius CIAV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận
- Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của vius CIAV.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Mẫu được thu thập ở một các đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận
- Thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian thực hiện từ tháng 12/2015 đến 10/2017.
Vật liệu nghiên cứu
- Gà bệnh ở các lứa tuổi được thu thập ở các địa phương tiến hành nghiên cứu
- Cặp mồi đặc hiệu dùng để phát hiện và giải trình tự CIAV
- Kít PCR (Maxime PCR PreMix i-Taq, iNtRON, Hàn Quốc)
- Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm:
(i)dung dịch ly giải mẫu có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 àg/ml proteinase K;
(ii) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1);
(v) dung dịch đệm TE (pH=8)
- Hóa chất dùng phân tích sản phẩm PCR gồm:
(i) agarose (Agarose EP Master, Biosesang, Hàn Quốc);
(ii) RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (20,000x);
(iii) 100bp DNA ladder (GeneDirex)
- Máy móc, dụng cụ thí nghiệm:
- Máy ly tâm lạnh 12000 vòng;
- Máy PCR (master gradient Eppendorf);
- Bộ micropipette cỏc cỡ: 10 àl,200àl, 1000 àl
- Bộ dụng cụ lấy mẫu, ống lấy mẫu.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm được lấy ngẫu nhiên từ đàn gà mắc bệnh có thể thể hiện các triệu chứng lâm sàng như ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn, kém vận động, khó thở và ỉa chảy Quá trình mổ khám bao gồm việc thu thập các cơ quan như gan, lách, ruột, tuyến ức, tuyến Harder, túi Fabricius và tủy xương Sau khi đồng nhất mẫu, chuẩn bị huyễn dịch với nồng độ 10% và bảo quản ở nhiệt độ -20°C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
3.5.2 Phương pháp tách chiết ADN
Tinh sạch ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau:
- 250 àl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 àl dung dịch sucrose/proteinase K,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl
(25:24:1) - Bổ sung 200 àl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải - Vortex hỗn hợp
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC)
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Loại bỏ hết cồn Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Tủa ADN được hũa tan trong 30àl dung dịch đệm TE (pH = 8,0)
3.5.3.Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR chẩn đoán CIAV
Cặp mồi đặc hiệu để phát hiện CIAV được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của van Santen và cộng sự (2001), với các trình tự được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Do sự thay đổi trong thành phần của phản ứng PCR trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu trước, việc tối ưu hóa phản ứng PCR là điều cần thiết.
Bảng 3.1 Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen VP1
Tên mồi xuôi/ ngược CAVVP3F/
Hình 3.1 Sơ đồ các vùng gen của CIAV được nhân lên bởi mồi
Cặp mồi CAVVP3F/CAV2 sẽ nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP3 và một phần của gen mã hóa protein VP1 và VP2 của CIAV
3.5.3.1 Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi
Nhiệt độ bắt mồi trong phản ứng PCR được điều chỉnh từ 45,0 o C đến 65,5 o C bằng máy gradient PCR Các yếu tố khác như nồng độ mồi và nồng độ sợi khuôn được duy trì đồng nhất trong tất cả các phản ứng Chi tiết về chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Ghi chú: Gradient bao gồm 12 nhiệt độ ( o C) gắn mồi khác nhau: 45,0; 45,3; 46,4; 48,2; 50,
Phân tích sản phẩm PCR được thực hiện bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2% với sự bổ sung của dung dịch nhuộm axit nucleic RedSafe™ 1x Nhiệt độ gắn mồi được xác định là tối ưu khi không có vạch sản phẩm không đặc hiệu và vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất được chọn.
3.5.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ mồi
Nồng độ cuối cùng của mồi trong phản ứng PCR thường dao động từ 0,05-1 àM Trong nghiên cứu này, nồng độ mồi cuối cùng được thiết lập từ 0,5 àM đến 0,125 àM Bảng 3.3 trình bày sự phối trộn giữa mồi xuôi và mồi ngược trong phản ứng PCR, thể hiện bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi.
Mồi ngược (nồng độ cuối cựng, àM)
Mỗi nồng độ mồi xuôi sẽ được kết hợp với ba nồng độ mồi ngược theo sơ đồ trong bảng 3.3 Phản ứng PCR sẽ được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu đã được xác định trong phần tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, đồng thời đảm bảo các điều kiện cần thiết cho phản ứng.
Staining Solution 1x Nồng độ mồi ở đó cho vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất sẽ được lựa chọn để thực hiện các phản ứng PCR xác định CIAV
3.5.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử
Mối quan hệ di truyền của CIAV được xây dựng thông qua cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen mã hóa protein VP1, từ codon 1 đến codon 203, bao gồm vùng siêu biến đổi từ amino acid thứ 139 đến 151 Phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013) được sử dụng với phương pháp Neighbor-Joining để suy diễn cây phát sinh, kết hợp mô hình Tajima-Nei để mô phỏng sự thay đổi nucleotide và điều chỉnh biến động giữa các nucleotide.
Mức tin cậy của các nhánh trong cây phát sinh chủng loại được ước tính thông qua phép thử bootstrap lặp lại 1000 lần Các trình tự tham chiếu để xác định nhóm di truyền dựa trên nghiên cứu trước đây của Olszewska-Tomczyk et al (2016), và các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Trình tự gen tham chiếu
Ghi chú: (a) các trình tự tham chiếu dựa theo công bố trước đây (Olszewska-Tomczyk et al., 2016).