Tổng quan về vi khuẩn
Vi khuẩn, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp nghĩa là "cái gậy", bao gồm các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) là một nhóm vi khuẩn phong phú, phân bố rộng rãi trên con người, động vật, thực vật và trong môi trường Chúng thường xuất hiện nhất trong ruột của người và động vật, với tên gọi "Enterobacteriaceae" phản ánh vị trí này (Entero – ruột, bacteri – vi khuẩn, aceae – họ) Tuy nhiên, các thành viên của họ đường ruột cũng có thể được tìm thấy ở nhiều nơi khác ngoài ruột, nơi mà còn có sự hiện diện của nhiều họ vi khuẩn khác.
Một vi khuẩn được xếp vào họ vi khuẩn đường ruột khi có các tính chất sau:
Trực khuẩn Gram âm có thể hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không chứa men oxidase, có khả năng lên men đường glucose (có thể sinh hơi hoặc không), và khử nitrat thành nitrit Chúng có thể di động, nếu có thì sẽ có nhiều lông bao quanh thân, và không sinh nha bào.
Họ đường ruột đóng vai trò quan trọng trong y học do nhiều thành viên có khả năng gây bệnh cho con người, đặc biệt là những loại có thể gây dịch Chúng chiếm đến 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người và có thể gây ra nhiều loại bệnh khác nhau, ảnh hưởng đến hầu hết các cơ quan và mô trong cơ thể Hầu hết các mẫu bệnh phẩm lâm sàng đều có thể phân lập được họ vi khuẩn này.
1.1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu thường gặp:
Escherichia coli (E coli) và Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) là hai loại vi khuẩn phổ biến gây bệnh tại bệnh viện, thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) và có tỷ lệ kháng kháng sinh cao Cả hai loài này đều liên quan đến việc phát hiện cơ chế sinh men ESBL ở vi khuẩn Gram âm, bao gồm các loại men như TEM, SHV và CTX-M Đáng chú ý, gene mã hóa cho men ESBL ở E coli và K pneumoniae chủ yếu được truyền qua plasmid.
Escherichia coli, được phát hiện lần đầu bởi Theodore Eschrich vào năm 1885, là một loại vi khuẩn hiếu khí chiếm khoảng 80% trong số các vi khuẩn có mặt ở đại tràng Vi khuẩn này có nhiều đặc điểm sinh học đặc trưng.
Hình thể, tính chất bắt màu: Trực khuẩn bắt màu Gram âm, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động.
Nuôi cấy: Hiếu khí, kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp là 37 0 C, dễ mọc trên môi trường thông thường, khuẩn lạc dạng S,R hoặc M.
Tính chất sinh vật học: Lên men glucose (+), lactose (+/-), Oxidase (-), Citrate (-), Urease (+), indole (+), H2S (-), di động (+/-), VP (-), MR (+)
Kháng nguyên E coli bao gồm 160 loại kháng nguyên thân O, 100 kháng nguyên bề mặt K, và 50 kháng nguyên H, cùng với các kháng nguyên ngoại độc tố LT và ST Dựa vào các kháng nguyên O, H, K, có nhiều type huyết thanh khác nhau được phân loại Theo tính chất tiêu chảy, E coli được chia thành 5 loại chính: EPEC (Enteropathogenic E coli) gây bệnh đường ruột, ETEC (Enterotoxigenic E coli) gây độc tố ruột, EIEC (Enteroinvasive E coli) xâm nhập vào đường ruột, EHEC (Enterohemorrhagic E coli) gây xuất huyết ruột, và EAEC (Enteroaggregative E coli) bám dính vào đường ruột.
E coli có khả năng gây bệnh cơ hội ngoài đại tràng, bao gồm nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não và nhiễm khuẩn đường mật Tại bệnh viện, E coli không chỉ gây tiêu chảy mà còn thường gặp trong các trường hợp nhiễm trùng vết thương.
Chẩn đoán vi sinh vật: Dựa vào nuôi cấy phân lập xác định tính chất sinh vật hóa học, định type huyết thanh, PCR…
Thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn này thường cư trú trong ống tiêu hóa, trên da và môi trường xung quanh Ở người khỏe mạnh, chúng chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong hệ vi khuẩn đường ruột.
Hình thể, tính chất bắt màu: Là trực khuẩn Gram âm, có vỏ, không có lông.
Nuôi cấy: Nhiệt độ thích hợp là 37 0 C, dễ mọc trên môi trường thông thường, khuẩn lạc rất nhầy có màu đỏ trên môi trường MC.
Tính chất sinh vật học: Lên men glucose (+), lactose (+), Oxidase (-),Citrate (+), Urease (+), indole (+/-), H2S (-), di động (-), VP (+), MR(-).
Kháng nguyên: Chỉ có hai loại kháng nguyên đó là kháng nguyên O và kháng nguyên K Dựa vào kháng nguyên O có 6 nhóm, dựa vào kháng nguyên K có 80 type huyết thanh.
Khả năng gây bênh: Gây nhiều bệnh như viêm phổi, viêm xoang, viêm tai giữa, nhiễm trung vết thương.
Chẩn đoán vi sinh vật: Dựa vào nuôi cấy phân lập xác định tính chất sinh vật hóa học, định type huyết thanh.
Khái quát lịch sử và phân loại ESBL
1.2.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL:
Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm β-lactam đã được ghi nhận từ lâu, với men β-lactamase được phát hiện đầu tiên từ Escherichia coli trước khi penicillin, kháng sinh β-lactam đầu tiên, được sử dụng Vào đầu những năm 1960, các nhà khoa học phát hiện men TEM-1, một enzym truyền qua plasmid, được phân lập từ bệnh nhân Temoneira, người Hy Lạp, mắc nhiễm trùng huyết do E coli, và đã lấy tên bệnh nhân này để đặt tên cho enzym.
1961 thế hệ penicilline phổ rộng đầu tiên là ampicillin được ra đời có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cả cầu khuẩn Gram dương [30], [43].
Năm 1965, tại đây, người ta đã phát hiện TEM-2 từ E coli, do TEM-1 biến đổi một amino acid Sự xuất hiện của TEM-1 và TEM-2 đã khiến cho vi khuẩn Gram âm kháng lại penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 Sau đó, đã có thông báo về N gonorrhoeae và H influenza kháng lại penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1.
Đến năm 1974, chủng K pneumoniae mang gene mã hóa men β-lactamase trên plasmid đã được phát hiện, với nhiều biến đổi amino acid so với các men TEM-1 và TEM-2, được đặt tên là SHV-1 (Sulfhyryl variable) Điều này cho thấy vi khuẩn đã có sự hiện diện của các men TEM-1, TEM-2 và SHV-1, làm cho các loại thuốc kháng sinh như penicillin và cephalosporin thế hệ mới gặp khó khăn trong việc tiêu diệt vi khuẩn này.
Vào năm 1980, kháng sinh β-lactam phổ rộng như cephalosporin thế hệ 2, 3 và monobactam đã được áp dụng để điều trị các vi khuẩn kháng thuốc, đánh dấu một thành công lớn trong cuộc chiến chống lại vi khuẩn gây bệnh sinh men TEM-1, TEM-2, SHV-1 Tuy nhiên, sự xuất hiện của men β-lactamase ESBLs, có khả năng phân hủy các cephalosporin thế hệ 2, 3 và monobactam do sự đột biến của TEM-1, TEM-2, SHV-1, đã tạo ra thách thức mới trong điều trị.
Vào năm 1983, Đức đã phát hiện ra chủng K ozaenae sinh men β-lactamase SHV-2, có khả năng phân hủy cefotaxime, đánh dấu trường hợp sinh men ESBL đầu tiên được ghi nhận Từ năm 1984 đến 1987, Pháp cũng phát hiện ra chủng K pneumoniae mang gene mã hóa men ESBL trên plasmid kháng cefotaxime, được đặt tên là CTX-1 Năm 1986, tại Nhật Bản, Masumato tiếp tục nghiên cứu về vấn đề này.
Năm 1989, tại Đức, Bauerfein đã phát hiện ra chủng vi khuẩn E coli sản sinh men ESBL kháng cefotaxime, không thuộc nhóm TEM và SHV, và đặt tên là CTX-M-1 Điều đáng lo ngại là CTX-M có khả năng phân hủy hầu hết các loại cephalosporine thế hệ 3 cũng như các cephalosporine thế hệ tiếp theo.
β-lactamase là enzym do vi khuẩn tiết ra, có khả năng thủy phân các liên kết amin của β-lactam, dẫn đến việc mở vòng β-lactam và làm mất tác dụng diệt khuẩn của kháng sinh nhóm này Enzym này có thể được sinh tổng hợp từ gene trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid, và một số chủng vi khuẩn có thể có cả hai cơ chế Ở vi khuẩn Gram dương, như tụ cầu, β-lactamase chủ yếu là do cảm ứng và được hình thành tại màng tế bào cũng như tiết ra ngoại bào Ngược lại, β-lactamase của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn, với hầu hết các vi khuẩn đường ruột chứa enzym do plasmid quy định, được sản xuất với mức độ thấp và có khả năng lan truyền tính kháng thuốc giữa các loài trong cộng đồng.
Việc sử dụng kháng sinh nhóm β-lactam đang gia tăng tỉ lệ kháng thuốc, với nhiều chủng ESBL mới được báo cáo, cho thấy nguy cơ gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh và khả năng thiếu thuốc điều trị trong tương lai Hiện tại, việc phát hiện sớm vi khuẩn sinh men ESBL và quy trình thông báo vẫn chưa được thống nhất.
Hiện nay, thế giới đã phát hiện hơn 200 loại enzyme beta-lactamase mở rộng (ESBL) Các nhà khoa học phân loại các enzyme này theo nhiều cách khác nhau, nhưng chủ yếu dựa trên hai hệ thống phân loại chính là hệ thống của Ambler và hệ thống của nhóm tác giả Bush, Jacoby và Medeiros.
1.2.1.1 Hệ thống phân loại theo Ambler: [34]
Ambler phân loại các β-lactamase thành 4 lớp: A, B, C, và D, dựa trên cấu trúc enzyme và sự tương đồng về amino acid Các lớp A, C, và D chứa serin ở vị trí khởi động, do đó được gọi là Serin-β-lactamase.
B do có Metallo ở vị trí khởi động trong cấu trúc men nên gọi là các Metallo- β- lactamase, một số β-lactamase lớp A và D được gọi là ESBL.
1.2.1.2 Hệ thống phân loại theo Bush- Jacoby- medeiros:
Dựa vào các yếu tố sau:
(1) Khả năng hoạt động của men hay gọi là phổ tác dụng của men đối với các kháng sinh
Men có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của các chất ức chế β-lactamase, như clavulanic acid, với các mức độ khác nhau, bao gồm bị ức chế hoàn toàn, giảm ức chế hoặc kháng ức chế.
Vị trí của gene mã hóa men ESBL có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid Các loài vi khuẩn sản sinh ra men ESBL có thể thuộc nhóm thường gặp hoặc hiếm gặp Hệ thống phân loại β-lactamase được chia thành 4 nhóm chính: 1, 2, 3 và 4, trong đó nhóm 2 được phân chia thành 8 nhóm phụ: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e và 2f.
Bảng 1.1: Phân loại theo chức năng: [49]
Khả năng ly giải kháng sinh
Cephalosporinase, đề kháng tất cả các β- lactam trừ carbapenem
2a A Penicillins + - Các penicillinase từ vi khuẩn Gram dương
2b A Penicillins, early cephalosporins + - TEM-1, TEM-2, SHV-1
Hầu hết các men ESBL đều có nguồn gốc từ các loại men TEM hoặc SHV, chủ yếu do các đột biến điểm xảy ra tại những vị trí chọn lọc trên gene.
Nhóm 2a : Gồm các penicillinase, không bị ức chế bởi clavulanic acid thường xuất hiện ở những vi khuẩn Gram dương như: S.aureus,
Nhóm 2b : Gồm các men cổ điển như: TEM-1-2, SHV-1, bị ức chế bởi
Clavulanic acid, các type này thường gặp ở E coli, chúng không phân hủy được các cephalosporins phổ rộng thế hệ 3.
Group 2be is a broad-spectrum β-lactamase that does not hydrolyze carbapenems or cephamycins, such as cefoxitin, cefotetan, and cefmetazole These enzymes, known as ESBLs, are inhibited by clavulanic acid, sulbactam, and tazobactam They are commonly found in E coli, K pneumoniae, and other intestinal bacteria.
Nhóm 2br : Gồm các men CARB có khả năng phân hủy carbapenem, thường xuất hiện ở P aeruginosa, Acinetobacter spp.
1.2.2 Các phương pháp phát hiện về kiểu hình ESBL:
Tần suất vi khuẩn đường ruột sản sinh enzyme ESBL đang gia tăng, yêu cầu cần có các phương pháp phát hiện chính xác hơn Gần đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để cải thiện các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL.
Phương pháp nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang.
Cỡ mẫu nse được tính bằng tổng số trường hợp dương tính thật (TP) và âm tính giả (FN), cụ thể là nse = TP + FN Trong trường hợp này, nse có giá trị bằng 2, cho thấy sự quan trọng của việc áp dụng các nghiên cứu về chẩn đoán và ước tính trong lĩnh vực này.
Trong đó, hằng số phân phối chuẩn Zα =1,96; với sai lầm loại I (α=0,05) ; nse
= Số mẫu theo độ nhạy ; pse = Độnhạy
Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng đến thiết kế với độ nhạy pse% và độ đặc hiệu 95%, với hai chỉ số này dao động trong khoảng 5% Tỷ lệ hiện hành của vi khuẩn tiết ESBL tại Việt Nam được báo cáo dao động từ 30,4% đến 42,5%, trong khi nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ 26% Câu hỏi đặt ra là cần bao nhiêu mẫu để đạt được độ tin cậy 95%, tức là sai số loại I là 5%.
Thế số vào ta có: nse =TP+FN = 2
* Trong đó: Z 2 (1- α/2) là hệ số tin cậy, với α= 0.05 thì Z 2 (1- α/2)= ( 1.96) 2
* P là trị số mong muốn của tỉ lệ 0.9
Sai số d được xác định là 0.05 với khoảng tin cậy 95%, dẫn đến ước lượng cỡ mẫu là n= 71 cho cả hai nhóm, bao gồm nhóm tiết ESBL và nhóm không tiết Cỡ mẫu cho hai nhóm được tính theo công thức: n hai nhóm P dis.
Thực tế, chúng tôi thu được cỡ mẫu n = 282 mẫu, chủng sinh men ESBL là 122.
2.2.3 Số chủng vi khuẩn đường ruột dùng để thực hiện multiplex PCR:
Do hạn chế về thời gian và ngân sách, chúng tôi quyết định sử dụng cỡ mẫu tối thiểu là 30 mẫu cho mỗi loại vi khuẩn, bao gồm Escherichia coli.
Klebsiella pneumoniae với chủng đối chứng là Escherichia coli ATCC 25922 vàKlebsiella pneumoniae ATCC 700603.
Địa điểm thực hiện và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 06 - 2017 đến tháng 03 - 2018 Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại :
Phòng vi sinh Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Bạc Liêu chuyên thực hiện cấy phân lập và định danh các vi khuẩn đường ruột phổ biến như E coli, K pneumoniae và K oxytoca, đặc biệt là các chủng sinh men ESBL.
Phòng Sinh học phân tử thuộc bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng - Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh chuyên xác định các vi khuẩn sản sinh men ESBL với các kiểu gen phổ biến như TEM, SHV, CTX-M-Group-1 và CTX-M-Group-9.
Biến số
- Vị trí nhiễm khuẩn: máu, nước tiểu, đàm, mủ dịch tổn thương phần mềm.
- Loại vi khuẩn đường ruột (E coli, K pneumoniae, K oxytoca và các loại vi khuẩn đường ruột khác)
- Gene TEM, SHV và CTX-M có hay không.
Một số kỹ thuật vi sinh lâm sàng
2.5.1 Cách lấy bệnh phẩm máu:
Lấy máu tĩnh mạch cần thực hiện theo phương pháp vô trùng, với thể tích máu cấy chiếm từ 1/10 đến tối đa 1/5 thể tích môi trường cấy Đối với người lớn, mỗi lần cấy cần lấy từ 5-10 ml máu cho vào chai 50ml môi trường, trong khi trẻ em chỉ cần từ 1-3ml cho chai 30ml môi trường (xem thêm chi tiết trong phụ lục 1).
2.5.2 Cách lấy bệnh phẩm nước tiểu:
Kỹ thuật lấy nước tiểu giữa dòng là phương pháp phổ biến hiện nay Đầu tiên, sử dụng gạc vô trùng thấm nước muối sinh lý để lau sạch vùng quanh lỗ tiểu và âm hộ, sau đó lau khô bằng gạc vô trùng Tiến hành tiểu bỏ phần nước tiểu đầu và thu thập phần nước tiểu còn lại vào bình vô trùng có nắp đậy chặt Nước tiểu cần được gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt; nếu không thể, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 4°C nhưng không quá 4 giờ.
2.5.3 Cách lấy bệnh phẩm đàm:
Trước tiên, bệnh nhân cần súc miệng sạch sẽ, tránh sử dụng chất sát trùng Tiếp theo, bệnh nhân hít thật sâu ba lần và cố gắng khạc đàm ra Để hỗ trợ, có thể vỗ nhẹ vào lưng bệnh nhân và hướng dẫn họ khạc đàm vào lọ vô trùng có miệng rộng và nắp đậy chặt (thông tin chi tiết xem phụ lục 1).
2.5.4 Cách lấy bệnh phẩm mủ (tổn thương phần mềm):
Lau sạch vùng da xung quanh vết thương bằng cồn 70% và dùng gạc vô trùng để loại bỏ mủ Sử dụng tăm bông vô trùng để lấy mẫu mô dập nát dưới lớp mủ đã được lau sạch, sau đó cho vào lọ vô trùng hoặc môi trường Stuart-Amie Gửi ngay mẫu đến phòng xét nghiệm để thực hiện nuôi cấy.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Hóa chất nuôi cấy vi khuẩn bao gồm môi trường MC (MacConkey Agar), BA (Blood Agar), và các môi trường chuyên chở bệnh phẩm như Stuart Amie và Carry Blair Ngoài ra, BHI (Brain Heart Infusion) và BHI+Glycerol 20% từ Công ty TNHH Nam Khoa Biotek cũng rất quan trọng Để định danh vi khuẩn, sử dụng thẻ định danh vi khuẩn Gram dương (GP test kit code 21342) và vi khuẩn Gram âm (GN test kit code 21341) Thẻ kháng sinh đồ Gram âm (AST67 test kit code 413399) từ hãng bioMerieur cũng là công cụ cần thiết trong quá trình xét nghiệm.
Hóa chất cần thiết cho quy trình PCR bao gồm bột agar tinh khiết, Ecodye để nhuộm gene, TEA (Tris Acetate EDTA) và bộ thuốc thử chuyên dụng để tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương pháp cột.
Bộ mồi chẩn đoán gien: TEM, SHV, CTX-M-Group-1, CTX-M-Group-9 và 16S rRNA.
Bảng 2.4: Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu
Kích thước Sản phẩm (bp)
Ghi chú : F- Mồi xuôi; R- Mồi ngược;
CTX-M-Group-1: Gồm CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-12, CTX-M-15 và CTX-M-65.
CTX-M-Group-9: Gồm CTX-M-9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-16, CTX-M-17
Tủ an toàn sinh học cấp II của Esco Singapore, tủ ủ 37 độ C từ Memmert Đức, bình nến ủ CO2 bằng thủy tinh, và máy định danh tự động Vitek2 compact từ hãng bioMerieux là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Ngoài ra, máy đo độ đục chuẩn của vi khuẩn, khay đựng ống nghiệm và thẻ định danh cũng đến từ hãng bioMerieux, cùng với máy điều nhiệt tự động, tạo nên một hệ thống hoàn chỉnh cho các nghiên cứu và phân tích vi sinh vật.
Bio-Rad cung cấp các thiết bị như máy ly tâm lạnh Velocity 15 và Dynamica, máy Vortex Genius 3 từ IKA Đức, cùng với máy điện di, máy chụp gel và máy đo nồng độ DNA Các vật tư tiêu hao cũng là một phần quan trọng trong quy trình nghiên cứu và thí nghiệm.
Bài viết này đề cập đến các dụng cụ cần thiết cho quá trình thí nghiệm vi sinh, bao gồm que cấy định lượng, que cấy phân lập, đèn cồn, tăm bông, lọ vô khuẩn, nước muối 0.45%, ống nhựa polytyren 12x75mm của hãng bioMeriux, dụng cụ phân phối nước muối, và các loại pipette với dung tích khác nhau từ 10-100µl đến 100-1000µl Ngoài ra, còn có bộ chuẩn độ đục, eppendorf và các đầu tip pipette từ 0.5-10µl đến 50-200µl, 5-50µl (Axygen).
2.6.2.1 Phương pháp cấy phân lập:
Bệnh phẩm máu được nuôi cấy trong tủ ấm 37°C và theo dõi hàng ngày trong 7 ngày để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên pha đặc Nếu không có vi khuẩn, sẽ tiến hành tráng pha lỏng lên pha đặc Cấy mù được thực hiện vào ngày thứ 2 và thứ 6 trên thạch BA, ủ trong môi trường CO2 hoặc bình nến trong 24 giờ, do một số vi khuẩn như S pneumoniae dễ bị ly giải sau khi mọc trên môi trường lỏng Khi phát hiện dấu hiệu vi khuẩn trên pha đặc hoặc cấy mù trên BA, cần thực hiện phiến phết nhuộm Gram và định danh vi khuẩn ngay lập tức.
Bệnh phẩm nước tiểu cần được cấy định lượng 1 àl, với việc lấy đầy một vòng cấy và trải đều lên bề mặt hộp thạch nuôi cấy, sử dụng môi trường BA và MC, sau đó ủ để đạt kết quả chính xác.
BA trong bình nến và MC ủ trong tủ ủ 37°C trong 24 giờ giúp xác định số lượng vi khuẩn trong mầm cấy Kết quả được đọc bằng cách đếm khúm khuẩn, từ đó suy ra tổng số vi khuẩn sống (Colony Forming Unit - CFU) trong 1ml nước tiểu Nếu số lượng CFU ≤ 10.000/ml, không có nhiễm trùng Khi CFU từ 10.000 đến ≤ 100.000/ml, nghi ngờ nhiễm trùng tiểu Còn nếu CFU ≥ 100.000/ml, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu và cần định danh vi khuẩn.
Trước khi tiến hành cấy phân lập và định danh vi khuẩn từ mẫu đàm, cần đánh giá độ tin cậy của mẫu Nếu mẫu đàm được xác định là tin cậy, tiến hành cấy ngay; ngược lại, nếu không tin cậy, cần yêu cầu lâm sàng lấy lại mẫu đàm, dựa trên thang điểm Barlett để đánh giá.
Mẫu đàm được tiến hành cấy 3 chiều trên môi trường BA ủ trong bình nến
Nghiên cứu được thực hiện trong môi trường MC ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ, sau đó tiến hành quan sát sự phát triển của khuẩn và thực hiện phiến phết nhuộm Gram để xác định và định danh vi khuẩn.
Bệnh phẩm mủ được đưa vào môi trường chuyên chở Stuart – Amie để tăng sinh vi khuẩn trong môi trường BHI lỏng trong 1 giờ Tiếp theo, tiến hành cấy 3 chiều trên môi trường BA và ủ trong bình nến ở 37°C trong 24 giờ, cùng với môi trường MC ủ thường ở 37°C trong 24 giờ Sau khi quan sát khúm khuẩn mọc, tiến hành nhuộm Gram và xác định loại vi khuẩn có mặt.
2.6.2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy Vitek2compact:
Nguyên lý định danh vi sinh vật và làm kháng sinh đồ bằng máy tự động Vitek®2 compact 30 của hãng bioMerieux cho phép theo dõi liên tục sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng của thẻ (Card) Hệ thống quang học sử dụng ánh sáng với các bước sóng 660nm, 568nm và 528nm để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua sự suy giảm cường độ ánh sáng khi ánh sáng đi qua các giếng.
Thực hiện định danh vi khuẩn:
Vi khuẩn cần định danh được nuôi cấy trên môi trường BA trong 18-24 giờ Sau khi nhuộm Gram, nếu vi khuẩn là cầu trùng Gram dương và dương tính với catalase, sử dụng thẻ định danh tụ cầu; nếu âm tính, sử dụng thẻ định danh phế cầu Đối với trực khuẩn Gram âm, áp dụng thẻ định danh GN test kit code 21341 và thẻ kháng sinh AST 67 test kit code 21342.
Chuẩn bị hai ống nước muối vô trùng để pha độ đục chuẩn cho vi khuẩn Gram dương và Gram âm ở mức 0.5 – 0.63 McFarland Sau đó, tiến hành phân tích trên hệ thống máy tự động VITEK2 compact của hãng bioMerieux, sử dụng thẻ định danh GN 21341 và thẻ kháng sinh AST67 21342, theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kết quả cuối cùng được phân tích bằng phần mềm Advanced.
Hệ thống máy VITEK2 compact sử dụng Expert System (AES) để xác định chủng vi khuẩn trong khoảng thời gian từ 18 đến 24 giờ Quy trình chuẩn bị mẫu cho việc định danh và thực hiện kháng sinh đồ của máy VITEK2 được mô tả chi tiết trong phụ lục 2.
2.6.2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng máy tự động Vitek2 compact :
Thông qua quá trình phân tích KSĐ bằng card AST-GN67, hệ thống máy Vitek®2 compact có khả năng phát hiện các vi khuẩn Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca tiết men ESBL.
Phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được nhập vào excel Xử lý số liệu và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 20.0, Tính tỉ lệ %, mô tả, so sánh.
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức của trường đại học Y- Dược thành phố Hồ Chí Minh (số 552, ngày 06-12-2017)
Các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu không gây tổn hại đến sức khỏe của đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu này để phát hiện tỉ lệ các vi khuẩn đường ruột thường gặp tiết men ESBL về mặt kiểu hình và kiểu gene
Nghiên cứu này hỗ trợ các nhà quản lý y tế và bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn kháng sinh an toàn và hợp lý, đồng thời giúp hạn chế tốc độ kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh hiện nay, nhằm bảo vệ và duy trì hiệu quả của kháng sinh trong tương lai.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Qua nghiên cứu và thống kê, chúng tôi thu được những kết quả sau:
Kết quả về xác định kiểu hình sinh ESBL
3.1.1 Sự phân bố các loại vi khuẩn phân lập được:
Tổng số các vi khuẩn phân lập được trong giai đoạn nghiên cứu là 673 chủng, trong đó vi khuẩn đường ruột chiếm 379/673= 56,32%.
Bảng 3.5: Sự phân bố các chủng vi khuẩn phân lập được
STT Vi khuẩn Tần số (ng3) Tỷ lệ (%)
Trực khuẩn Gram âm đường ruột 379 56,3
Trực khuẩn Gram âm không lên men đường 157 23,3
Các cầu khuẩn Gram dương 137 20,4
* Là gồm Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratiae marcescens, Providencia rettgeri, Proteus hauseri, Proteus vulgaris…; ** Là Pseudomonas sp ; *** là Streptococus sp
Trong mẫu khảo sát, vi khuẩn Gram âm đường ruột chiếm 56,3%, tiếp theo là vi khuẩn Gram âm không lên men đường với 23,3%, và vi khuẩn cầu Gram dương chiếm 20,4% Cả vi khuẩn Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae đều có tỷ lệ tương đương nhau, tổng cộng đạt 41,5% Đồng thời, vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus cũng có tỷ lệ tương đương là 14,6%.
3.1.2 Tỉ lệ các loại vi khuẩn Gram âm đường ruột phân lập được theo từng loại bệnh phẩm:
Bảng 3.6: Tỷ lệ các loại vi khuẩn theo từng loại bệnh phẩm
Vi khuẩn Máu Nước tiểu Đàm Mủ n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%)
* Là gồm Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratiae marcescens,Providencia rettgeri, Proteus hauseri, Proteus vulgaris
Trong nghiên cứu về 379 loại vi khuẩn Gram âm đường ruột, bệnh phẩm đàm chiếm tỷ lệ cao nhất với 56,1%, tiếp theo là bệnh phẩm mủ với 36,1%, trong khi bệnh phẩm máu và nước tiểu lần lượt chiếm 4,5% và 3,2% Vi khuẩn E coli chiếm ưu thế tại bệnh phẩm máu và nước tiểu với tỷ lệ 76,5% và 75,0%, trong khi ở bệnh phẩm mủ là 40,6% và ở bệnh phẩm đàm là 29,1% Đối với vi khuẩn K pneumoniae, tỷ lệ cao nhất ghi nhận ở bệnh phẩm đàm với 53,1%, trong khi ở bệnh phẩm nước tiểu là 8,3%, và ở bệnh phẩm máu và nước tiểu gần tương đương với 17,7% và 15,9%.
3.1.3 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL:
Chúng tôi đã xác định tỷ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột phổ biến, bao gồm E coli, K pneumoniae và K oxytoca, có khả năng sinh men ESBL Trong số 282 loài vi khuẩn Gram âm được phân lập, tỷ lệ vi khuẩn sinh men ESBL đạt 43,3% (122/282), trong khi tỷ lệ không sinh men ESBL là 56,7% (160/282).
Tỷ lệ vi khuẩn sinh men ESBL trong nghiên cứu cho thấy E coli chiếm ưu thế với 62,9% (88/140), tiếp theo là K pneumoniae với 24,5% (34/139), trong khi K oxytoca không có trường hợp nào (0/3) Điều này cho thấy E coli là vi khuẩn có khả năng tiết men ESBL cao nhất, trong khi K oxytoca không biểu hiện kiểu hình sinh ESBL.
3.1.4 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL trong các mẫu bệnh phẩm:
Chúng tôi xác định tỷ lệ các trực khuẩn Gram âm đường ruột phổ biến, bao gồm Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca, có khả năng tiết men ESBL, thông qua việc phân lập từ các mẫu bệnh phẩm.
Bảng 3.7: Sự hiện diện của trực khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp tiết men ESBL trong các mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm ESBL (+); n2 Tỷ lệ %
Mủ (tổn thương phần mềm) 43 35,2%
Vi khuẩn Gram âm đường ruột, đặc biệt là E coli, có khả năng tiết enzyme ESBL cao nhất trong các bệnh phẩm đàm với tỷ lệ 49,1%, tiếp theo là bệnh phẩm mủ chiếm 35,2%, trong khi tỷ lệ ở bệnh phẩm máu và nước tiểu lần lượt là 10,6% và 4,9%.
K pneumoniae sinh men ESBL trong từng mẫu bệnh phẩm được thể hiện ở
Bảng 3.8: Trực khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp tiết men
ESBL theo từng bệnh phẩm:
Nước tiểu n=6 , ESBL+; n (%) Đàm n`, ESBL+; n (%)
Trực khuẩn Gram âm đường ruột có khả năng tiết ESBL cao nhất trong bệnh phẩm máu là E coli, chiếm 92,3% Trong khi đó, tỷ lệ ở bệnh phẩm đàm là 66,1%, và ở bệnh phẩm nước tiểu và mủ lần lượt là 55,6% và 54,8% Đặc biệt, K pneumoniae đạt 100% ở bệnh phẩm nước tiểu, trong khi tỷ lệ ở bệnh phẩm máu, đàm và mủ lần lượt là 33,3%, 27,3% và 23,0%.
Kết quả khảo sát về kiểu gene qui định ESBL
3.2.1 Kết quả thí nghiệm monoplex PCR:
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm monoplex PCR
Kết quả nghiên cứu cho thấy các mồi PCR hoạt động hiệu quả, không phát hiện sản phẩm ký sinh khi nhân bản các gene TEM, SHV, CTX-M-G-1, CTX-M-G-9 và 16S rRNA trong phản ứng monoplex PCR Chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gene các sản phẩm nhân bản để xác định tính đặc hiệu của chúng Kết quả giải trình tự cho thấy các sản phẩm này phù hợp với các trình tự gene tương ứng đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu NCBI.
Kết quả phát hiện gene ESBL từ 4 mẫu cho thấy: mẫu 18 mang gene CTX-M-G-1 và SHV; mẫu 27 có gene CTX-M-G-1 và TEM; mẫu 31 chứa gene SHV và TEM; trong khi mẫu 29 sở hữu đầy đủ 4 gene CTX-M-G-1, CTX-M-G-9, TEM và SHV Các mẫu này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của các mồi:
3.2.2.1 Kết quả của mồi CTX-M-G-1 và CTX-M-G9:
Hình 3.2: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi CTX-M-Group-1 và
Kết quả khảo sát cho thấy mồi nhân bản gene CTX-M-Group-1 có nhiệt độ lai tối ưu từ 55.0°C đến 61.4°C, trong khi mồi nhân bản gene CTX-M-Group-9 có nhiệt độ lai tối ưu khoảng 55.7°C.
3.2.2.2 Kết quả của mồi TEM và 16S rRNA:
Hình 3.3: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi TEM và 16S rRNA
Kết quả khảo sát cho thấy mồi nhân bản gene TEM có nhiệt độ lai tối ưu từ 57.0°C đến 63.3°C, trong khi mồi nhân bản gene 16S rRNA có nhiệt độ lai tối ưu từ 55.0°C đến 63.3°C.
3.2.2.3 Kết quả của mồi SHV:
Hình 3.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi SHV.
Kết quả khảo sát cho thấy mồi nhân bản gene SHV có nhiệt độ lai tối ưu nằm trong khoảng 55.0 °C đến 65.0 °C.
Nhiệt độ lai tối ưu cho bốn cặp mồi được xác định trong khoảng từ 57.0 °C đến 61.4 °C Do đó, chúng tôi đã chọn 59 °C là nhiệt độ lai tối ưu để áp dụng trong quy trình multiplex PCR.
3.2.3 Hiệu quả phản ứng multiplex PCR:
Hình 3.5: Hiệu quả nhân bản của phản ứng multiplex PCR.
Kết quả điện di cho thấy phản ứng multiplex PCR với các cặp mồi đã hoạt động hiệu quả, thể hiện qua mẫu 18 và 27 cho kết quả tương tự như phản ứng monoplex PCR Tuy nhiên, mẫu 29 và 31 không hiển thị các vạch sản phẩm tương ứng của gene TEM như mong đợi Do đó, cần tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR để đạt được kết quả tương thích với phản ứng monoplex PCR khi xử lý nhiều loại mẫu khác nhau.
3.2.4 Tối ưu nồng độ mồi TEM:
Hình 3.6: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene TEM
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm đặc trưng cho gene TEM của mẫu 27,
Nồng độ mồi nhõn bản gene 0,6 àM cho thấy sự hiện diện rõ ràng của các sản phẩm 29 và 31 Vì lý do này, nồng độ 0,6 àM được chọn để thực hiện thí nghiệm multiplex PCR Kết quả điện di cho thấy sản phẩm nhân bản từ mồi 16S rRNA nổi bật hơn hẳn so với các sản phẩm khác, cho thấy khả năng ức chế các sản phẩm nhân bản từ các cặp mồi khác trong phản ứng multiplex PCR.
Vì thế, thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sẽ tối ưu theo hướng giảm nồng độ mồi này.
Hình 3.7: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene 16S rRNA
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ mồi 16S rRNA 0,1 àM mang lại hiệu quả tối ưu, không ức chế các sản phẩm nhân bản từ các cặp mồi khác Vì vậy, nồng độ này được lựa chọn để thực hiện phản ứng multiplex PCR trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.6 Tối ưu nồng độ Mg 2+ :
Hình 3.8: Kết quả tối ưu nồng độ Mg 2+
Kết quả cho thấy nồng độ Mg +2 tăng dần không tạo ra sự khác biệt giữa các nghiệm thức Vì vậy, nồng độ Mg +2 sẽ được giữ nguyên ở mức 2 mM cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.7 Tối ưu nồng độ men DNA polymerase:
Hình 3.9: Kết quả tối ưu nồng độ men DNA polymerase
Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức khảo sát nồng độ men DNA polymerase khác nhau, do đó chúng tôi quyết định giữ nguyên nồng độ.
1 U / phản ứng để chạy multiplex PCR cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.8 Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex PCR:
Hình 3.10: Kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex PCR
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ mẫu thấp nhất cho phản ứng multiplex PCR đạt độ chính xác là 10² bản sao mỗi phản ứng Mẫu 29 đã cho kết quả dương tính với đầy đủ 4 gene đã xác định, trong khi các mẫu khác như 18 và 27 cũng cho kết quả tương tự.
Chúng tôi xác nhận 10 2 bản sao / phản ứng là độ nhạy của phản ứng multiplex đã được tối ưu
3.2.9 Khảo sát độ đặc hiệu của các mồi:
Hình 3.11: Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng E coli 25922 và K pneumoniae 700603 phản ánh chính xác kiểu hình ESBL của chúng Cụ thể, chủng K pneumoniae 700603 có kiểu hình ESBL dương tính và mang gene tương ứng, trong khi chủng E coli 25922 có kiểu hình ESBL âm tính và không mang bất kỳ gene nào trong bốn gene ESBL đã được khảo sát.
