TỔNG QUAN
BỆNH LAO VÀ HÓA TRỊ LIỆU HIỆN NAY
Bệnh lao là một bệnh nhiễm khuẩn do trực khuẩn lao (MTB) gây ra, thuộc nhóm MTB complex bao gồm nhiều loài như Mycobacterium bovis và Mycobacterium africanum Trực khuẩn lao thường xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, khi bệnh nhân lao phổi ho hoặc hắt hơi, các hạt chứa vi khuẩn sẽ lơ lửng trong không khí và có thể được người khác hít phải Sau khi vào phổi, MTB có thể bị đại thực bào tiêu diệt, nhưng một số vẫn sống sót và phát triển, dẫn đến tình trạng lao tiềm ẩn Nếu hệ miễn dịch suy yếu, vi khuẩn có thể phát tán đến các bộ phận khác như não, phổi, và thận, gây ra lao kê với tiên lượng nặng Trong khoảng 2-12 tuần, vi khuẩn tiếp tục nhân lên trong phổi, dẫn đến phản ứng dương tính với Tuberculine Vi khuẩn có thể tồn tại trong đại thực bào nhiều năm, và khi vượt qua hệ miễn dịch, bệnh nhân có thể chuyển từ nhiễm lao sang bệnh lao Bệnh nhân lao phổi thường có triệu chứng ho, X quang phổi bất thường và có khả năng lây nhiễm cho người khác Chẩn đoán bệnh lao thường dựa vào việc thu thập dịch cơ thể hoặc mô để tìm vi khuẩn và nuôi cấy.
Mục tiêu của hóa trị liệu hiện nay là chữa khỏi bệnh lao, giảm nguy cơ tử vong và tàn phế, ngăn ngừa lây nhiễm vi khuẩn lao, và phòng tránh sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc Để đạt được điều này, việc điều trị không nên chỉ sử dụng một loại thuốc đơn lẻ hoặc thêm thuốc vào phác đồ điều trị không hiệu quả, vì điều này có thể dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn lao đa kháng Theo khuyến nghị của WHO (2016), điều trị lao và các trường hợp kháng thuốc cần áp dụng phác đồ đa thuốc kéo dài Giai đoạn tấn công đầu tiên yêu cầu sự kết hợp ít nhất 3 loại thuốc chống lao trong ít nhất 2 tháng để ngăn chặn sự phân chia nhanh chóng của vi khuẩn lao Trong giai đoạn duy trì, cần sử dụng 2 hoặc 3 loại thuốc trong một khoảng thời gian nhất định.
Để tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn lao trong tổn thương và ngăn ngừa tái phát, cần ít nhất 4 tháng điều trị Thuốc kháng lao hàng đầu gồm 5 loại: isoniazid, rifampicin, PZA, ethambutol và streptomycin Trong khi đó, thuốc kháng lao hàng thứ hai như ethionamid, kanamycin, terizidone, capreomycin và para amino salicylic acid được sử dụng khi thuốc hàng đầu không hiệu quả hoặc trong trường hợp lao đa kháng thuốc Tuy nhiên, thuốc dòng thứ hai có hiệu quả thấp, độc tính cao và thường không sẵn có do giá thành Gần đây, Bedaquilin và Delanamid đã được phê duyệt cho điều trị lao đa kháng thuốc Việc điều trị hiện nay thường gặp tác dụng phụ nghiêm trọng, dẫn đến bệnh nhân không tuân thủ, góp phần vào sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa đề kháng.
Thuốc kháng lao Rifampicin và PZA đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh lao Trong khi liều của Rifampicin có thể được tăng lên hoặc phát triển thành dạng thuốc kéo dài, việc tăng liều PZA lại bị giới hạn do độc tính Vì vậy, việc sử dụng PZA qua đường hít đang thu hút sự chú ý Phương pháp hít cho phép thuốc nhanh chóng đến vị trí tổn thương mà không gây độc tính ban đầu Những tiểu phân trojan được chế tạo bằng phương pháp sấy phun với kích thước nhỏ hơn có thể cải thiện khả năng định vị trong phế nang và tăng cường độ bền trong quá trình bảo quản.
Chương trình chống lao quốc gia của Việt Nam hiện đang triển khai chiến lược điều trị lao theo khuyến cáo của WHO, cụ thể là phương pháp điều trị hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp, gọi tắt là DOTS (Directly Observed Treatment Short-Course).
Bảng 1.3 Phác đồ điều trị lao cho người trường thành mới mắc [4]
Giai đoạn tấn công - 2 tháng Dưới 50 kg Trên 50 kg
Dạng viên nén kết hợp 120/60/300/200mg
Giai đoạn duy trì - 4 tháng
Dạng viên nén kết hợp 150/100 mg
Dạng viên nén kết hợp 150/300 mg
Việt Nam hiện đang áp dụng công thức điều trị lao 2 SHRZ/6 HE cho các trường hợp lao mới phát hiện và công thức 2 SHRZE/1 HRZE/5 H3R3E3 cho bệnh nhân lao thất bại hoặc tái phát Đối với lao ở trẻ em, công thức 2 HRZ/4 HR được sử dụng, tuy nhiên, trong các trường hợp nặng, có thể bổ sung thêm S trong giai đoạn tấn công ban đầu.
Có một mã chuẩn cho các công thức điều trị lao, với các thuốc chống lao được ký hiệu bằng chữ cái: H (isoniazid), R (rifampicin), S (Streptomycin), Z (PZA), E (ethambutol) Một phác đồ điều trị bao gồm 2 giai đoạn, trong đó con số trước mỗi giai đoạn biểu thị thời gian điều trị bằng tháng Con số dưới và sau mỗi chữ cái cho biết tần suất sử dụng thuốc trong tuần; nếu không có con số, thuốc sẽ được dùng hàng ngày Các thuốc thay thế có thể được biểu thị bằng chữ cái trong ngoặc đơn.
Dấu “/” phân cách các giai đoạn điều trị (giai đoạn điều trị tấn công ban đầu và giai đoạn điều trị duy trì củng cố).
Sử dụng thuốc đường uống mang lại sự tiện lợi và chi phí thấp, nhưng cần liều cao và thời gian dài để đạt hiệu quả diệt khuẩn do thuốc bị chuyển hóa qua gan So với đường uống, tiêm và hít có sinh khả dụng cao hơn, nhưng tiêm có thể gây đau và đòi hỏi sự hỗ trợ của nhân viên y tế Hiện nay, việc phát triển phương pháp phân phối thuốc trực tiếp qua đường phổi đang được chú trọng.
PZA
Hình 1 2 Công thức cấu tạo của PZA
- Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, không mùi.
PZA tồn tại dưới bốn dạng thù hình khác nhau: dạng α được hình thành trong ethanol ở nhiệt độ phòng, dạng β thu được trong ethanol ở 0 độ, dạng ɣ có được từ phản ứng tổng hợp, và dạng δ xuất hiện trong nitromethan ở nhiệt độ từ 80 đến 140 độ, cũng như trong tetracloroethan ở nhiệt độ phòng hoặc trong hỗn hợp hexan-ethyl alcohol.
- Độ ổn định: PZA bền ở trạng thái rắn, PZA không bị phân hủy bởi ẩm, không khí khô và ánh sáng tự nhiên.
- Độ tan trong nước ở 38 o C: 2,65, methanol: 1,63, ethanol: 0,74 (g/100g).
- Quang phổ hấp thu IR: so sánh với phổ của chất chuẩn.
- Đun sôi với NaOH cho mùi amoniac.
PZA là thuốc chuyên biệt dùng để điều trị lao, thường được kết hợp với isoniazid, ethambutol, rifampicin và streptomycin trong phác đồ điều trị lao nhạy cảm và đề kháng Thuốc này ít độc hại và hiệu quả hơn nhiều loại thuốc chống lao khác như aminosalicylic acid, capreomycin, cycloserin, ethionamid và kanamycin Được FDA phê duyệt sử dụng từ năm 1955, PZA là một phần quan trọng trong liệu pháp đa hóa trị liệu chống lao, chủ yếu được sử dụng trong 8 tuần đầu của hóa trị liệu ngắn ngày Đặc biệt, PZA là thuốc kháng lao duy nhất có khả năng rút ngắn thời gian điều trị từ 9-12 tháng xuống còn 6 tháng.
Cơ chế tác động của PZA vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng MTB nhạy cảm sẽ giải phóng PZAase, enzyme chuyển đổi PZA thành acid pyrazinoic (POA) POA có thể đóng góp vào tác động sinh học, và trong các thí nghiệm in vitro, POA đã cho thấy khả năng làm giảm pH xuống dưới mức cần thiết cho sự phát triển của MTB.
Cơ chế tác động của tiền chất PZA vẫn chưa được hiểu rõ Tác dụng của PZA có thể là kìm khuẩn hoặc diệt khuẩn, tùy thuộc vào nồng độ thuốc tại tổn thương và độ nhạy cảm của vi khuẩn PZA đặc biệt hiệu quả với vi khuẩn lao trong thực bào MTB, là loại vi khuẩn duy nhất mà thuốc này có tác dụng.
Theo phân loại sinh dược học, PZA thuộc nhóm III với độ tan cao và tính thấm thấp MIC của PZA đối với vi khuẩn MTB là 50 àg/ml ở pH tối ưu 5,5, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn lao Thuốc được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết thanh khoảng 35 àg/ml sau 2 giờ với liều 1,5 g và 66 àg/ml với liều 3 g PZA phân bố vào các mô và dịch trong cơ thể, bao gồm gan, phổi và dịch não tủy, với nồng độ trong dịch não tủy tương đương nồng độ ổn định trong huyết tương ở bệnh nhân viêm màng não Ngoài ra, PZA gắn với protein huyết tương khoảng 10%.
Thời gian bán thải của thuốc PZA là 9 - 10 giờ, có thể kéo dài hơn ở bệnh nhân suy thận hoặc suy gan Thuốc này được chuyển hóa ở gan thành POA, một chất chuyển hóa chính có hoạt tính, sau đó tiếp tục bị hydroxyl hóa thành acid 5 - hydroxy pyrazinoic PZA chủ yếu được đào thải qua thận, với khoảng 70% liều uống được thải ra trong vòng 24 giờ.
1.2.4 Chỉ định Ðiều trị lao mới chẩn đoán hoặc tái trị bệnh lao phổi và ngoài phổi, chủ yếu ở giai đoạn tấn công ban đầu, thường phối hợp với isoniazid và rifampicin theo Hiệp hội chống lao và bệnh phổi thế giới và WHO (Chương trình chống lao Việt Nam: PZA thường phối hợp với isoniazid, streptomycin và rifampicin) [10] POA quan trọng trong phác đồ điều trị lao nhạy cảm và lao kháng thuốc [3], [4].
Tổn thương gan nặng, loạn chuyển hóa porphyrin, mẫn cảm với thuốc.
Bệnh nhân có tiền sử đái tháo đường khó kiểm soát khi sử dụng PZA, viêm khớp, và bệnh gút cần tránh dùng PZA trong cơn cấp tính Ngoài ra, người có suy thận có thể cần giảm liều thuốc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
1.2.7 Tác dụng không mong muốn (ADR)
Phản ứng có hại thông thường nhất là gây độc cho gan và phụ thuộc vào liều dùng.
Chuyển hóa: Tăng acid uric máu có thể gây cơn gút.
Xương, khớp: Ðau các khớp lớn và nhỏ.
Liều lượng: Đường uống cho cả người lớn và trẻ em:
25 mg/kg/ngày (20 - 30 mg/kg/ngày) khi điều trị hằng ngày.
35 mg/kg/ngày (30 - 40 mg/kg/ngày) khi điều trị cách quãng, tuần 3 ngày ít được sử dụng và khuyến cáo.
Liều lượng khuyến cáo là 50 mg/kg/ngày (từ 40 đến 60 mg/kg/ngày) khi điều trị cách quãng, cụ thể là 2 lần mỗi tuần (cách 2 ngày) Tuy nhiên, phương pháp này rất ít được sử dụng và không được WHO khuyến nghị trong các phác đồ điều trị.
TIỂU PHÂN NANO TẢI THUỐC KHÁNG LAO
Tiểu phân nano là các cấu trúc phân tán có kích thước từ 1 đến 1.000 nm, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển hoạt chất đến đích sinh học một cách hiệu quả Chúng thường được gọi là thuốc điều trị tại đích, giúp giảm độc tính và tăng nồng độ thuốc tại vị trí nhiễm trùng mà không phải trải qua chuyển hóa lần đầu Nghiên cứu gần đây tập trung vào các loại tiểu phân nano như tiểu phân polymer, lipid rắn, nano liposome và nano micell để phân phối thuốc chống lao qua đường hô hấp Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng tiểu phân nano trong điều trị lao có thể duy trì nồng độ thuốc trong huyết tương từ 6 đến 8 ngày và trong phổi lên đến 10 ngày, cho thấy tiềm năng lớn trong việc cải thiện hiệu quả điều trị.
Trong quá trình điều trị, 5 liều thuốc không phát hiện trực khuẩn lao ở phổi, trong khi việc sử dụng 46 liều thuốc uống hàng ngày mới đạt được hiệu quả điều trị tương đương.
Tiểu phân nano dạng xông hít không chỉ đạt nồng độ tải thuốc cao mà còn bám dính tốt vào tế bào niêm mạc, từ đó tăng cường phân phối thuốc đến phổi Chúng được hấp thu hiệu quả bởi các đại thực bào nơi trực khuẩn lao cư trú và được chế tạo từ nguyên vật liệu sinh học như alginate, PLGA, gelatin và lipid rắn, trong đó PLGA là lựa chọn phổ biến Kết quả thử độc tính in vivo cho thấy tiểu phân nano PLGA có độc tính thấp và an toàn cho phổi, không gây thay đổi trong việc giải phóng lactate dehydrogenase hay biểu hiện protein gây viêm tế bào.
Bảng 1.4 Tiểu phân nano tải thuốc kháng lao đã được nghiên cứu.
Thuốc Công thức Phương pháp điều chế
Rifampicin Tiểu phân micro mannitol chứa tiểu phân nano PLGA Phun khô
Isoniazid Alginate Gel hóa kiểm soát bởi các cation
Isoniazid PLGA Bốc hơi dung môi
PZAe Alginate Gel hóa kiểm soát bởi các cation
PZAe PLGA Bốc hơi dung môi
Capreomycin Oleate, linolenate linoleate Phun khô bột nano
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và trang thiết bị
Các nguyên liệu dùng trong điều chế các tiểu phân nano tải thuốc kháng lao PZA được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu
Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nhà sản xuất Xuất xứ
PZA Độ tinh khiết hơn
Poly (lactid-co-glycolid acid) (PLGA)
Ester terminated, lactide glycolide 75:25 Nhà sản xuất Sigma Đức
Poly vinyl alcohol (PVA) Nhà sản xuất Sigma Đức
Natri clorid Nhà sản xuất Merck Đức
Trehalose Nhà sản xuất Sigma Pháp
Cồn tuyệt đối TCCS CTCP HC và
Nước cất 2 lần TCCS Viện KN
Dichloromethane (DCM) Nhà sản xuất Merck Đức
Ethyl acetate (EA) Nhà sản xuất Merck Đức
Phosphat buffer saline (PBS) pH 7,4 Nhà sản xuất HIMEDIA Ấn Độ
Acetonitril Phân tích Merck Đức
Các trang thiết bị sử dụng trong đề tài được trình bày trong Bảng 2.4
Bảng 2.4 Các trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Nhà sản xuất Xuất xứ
Cân phân tích Sartorius Đức
Máy khuấy tốc độ cao Ultra turrax BioSpec Mỹ
Hệ thống bay hơi chân không Việt Nam Việt Nam
Máy ly tâm DLAB Trung Quốc
Máy khuấy từ Sartorius Đức
Máy lắc vortex DLAB Trung Quốc
Máy đo quang Shimadzu Nhật
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) Hitachi Nhật
Bể ổn nhiệt Memmert Đức
Máy xác định kích thước hạt và thế zeta Malvern Anh
Túi thẩm tách Membrane Filtration Mỹ
Thiết bị phân tích nhiệt (DSC) Mettler Toledo Mỹ
Thiết bị phân tích nhiễu xạ tia X Siemens Đức
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và tối ưu hóa công thức tiểu phân nano PLGA tải PZA
Các tiểu phân nano PLGA chứa PZA được chế tạo thông qua phương pháp nhũ tương kép kết hợp với bay hơi dung môi Quá trình bắt đầu bằng việc nhũ hóa 1 ml dung dịch nước chứa PZA vào 10 ml dung môi hữu cơ (DCM, EA, hoặc hỗn hợp DCM:EA 50:50) có chứa PLGA, với tỷ lệ thuốc/polymer từ 1:1 đến 1:5, trong 3 phút bằng cách khuấy ở tốc độ 18.000 vòng/phút Tiếp theo, nhũ tương này được trộn với 10-200 ml dung dịch polyvinyl acetat 0,5-2% và 0,5% NaCl trong nước, khuấy ở 32.000 vòng/phút trong 5 phút để tạo thành nhũ tương kép nước trong dầu trong nước (N/D/N) Sau đó, dung môi hữu cơ được loại bỏ qua hệ thống bay hơi chân không trong 30 phút, và các tiểu phân nano PLGA được thu hồi bằng cách ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 30 phút, với quy trình ly tâm được lặp lại.
Hỗn dịch nano được rửa hai lần bằng nước cất để loại bỏ dư lượng PVA Cuối cùng, để lưu trữ, hỗn dịch này được thử nghiệm các đặc tính lý hóa hoặc đông khô với trehalose ở nồng độ 25 mg/ml.
Phương pháp Taguchi, dựa trên thực nghiệm “mảng trực giao”, đã được phát triển để giảm phương sai trong việc tối ưu hóa các thông số kiểm soát Phương pháp này đã mang lại kết quả tích cực trong việc kết hợp thiết kế thí nghiệm với tối ưu hóa Nghiên cứu này xác định bốn yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân nano PLGA và chỉ số đa phân tán (PI), bao gồm loại dung môi, tỷ lệ khối lượng PZA/PLGA, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước bên ngoài và nồng độ PVA Mỗi yếu tố được thử nghiệm ở ba mức khác nhau, như trình bày trong Bảng 1, và thiết kế giai thừa phân đoạn sử dụng mảng trực giao chuẩn L9, được thể hiện trong Bảng 2.5.
Phần mềm Design-Expert (phiên bản thử nghiệm 8.0.6, Stat-Ease, Minneapolis, Mỹ) được sử dụng để phân tích kết quả thực nghiệm, giúp xác định độc lập các tác động chính của các yếu tố Tiếp theo, phân tích phương sai (ANOVA) được thực hiện để xác định các yếu tố không có ý nghĩa thống kê Giá trị tối ưu của các yếu tố được lựa chọn dựa trên mức độ đạt được trong khoảng dự đoán.
Bảng 2.5 Các mức của các yếu tố trong thiết kế mảng trực giao L9 của Taguchi.
Loại dung môi hữu cơ DCM DCM:EA EA
Tỷ lệ khối lượng PZA / PLGA 1:1 1:2.5 1:5
Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài 1:1 1:10 1:20
Bảng 2.6 Thiết kế mảng trực giao L9 của Taguchi
STT Loại dung môi hữu cơ
Tỷ lệ khối lượng PZA / PLGA
Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài
2.2.2 Khảo sát khả năng phóng thích PZA của các tiểu phân nano
Phương pháp thẩm tách được dùng để đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất của tiểu phân nano.
Thiết bị: Ống thủy tinh ổn nhiệt hình trụ thể tích 100 ml 2 lớp.
Túi thẩm tách (MWCO: 12-14 kDa)
Môi trường: 100 ml dung đệm PBS pH 7,4
Tốc độ khuấy từ: 150 vòng/phút
Túi thẩm tách 20 cm được ngâm trong nước cất trong 24 giờ Sau đó, tiểu phân nano PLGA tải PZA được phân tán trong 2 ml dung dịch PBS pH 7,4 và cho vào túi thẩm tách, sau đó nhúng vào ống thủy tinh ổn nhiệt.
Dung dịch PBS pH 7,4 được khuấy ở tốc độ 150 vòng/phút và duy trì nhiệt độ 37 ± 0,5 o C bằng bể ổn nhiệt Mỗi khoảng thời gian 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48, 72, và 96 giờ, rút 2 ml dung dịch và thay thế bằng 2 ml PBS Lượng PZA phóng thích tại mỗi thời điểm được định lượng bằng phương pháp phổ hấp thu UV.
Dữ liệu phóng thích PZA được khảo sát thông qua các phương trình động học bậc 0, bậc 1, Higuchi, Korsmeyer-Peppas và Hixon Crowell Các phương trình này mô tả mối quan hệ giữa % thuốc tích lũy và thời gian theo các cách khác nhau Hệ số K và giá trị R² được xác định từ đường cong tuyến tính thông qua phân tích hồi quy, giúp đánh giá chính xác quá trình phóng thích thuốc.
2.2.3 Khảo sát các đặc tính tải thuốc của tiểu phân nano
Phân bố kích thước hạt và thế zeta
Tiểu phân nano PLGA tải thuốc đã được phân tích kích thước và chỉ số đa phân tán (PI) bằng máy Zetasizer, dựa trên tương quan photon quang phổ Quá trình đo kích thước được thực hiện ba lần sau khi pha loãng 1/100 (v/v) hỗn dịch tiểu phân nano trong nước tinh khiết ở nhiệt độ phòng với góc đo cố định 173 độ Đồng thời, đo thế zeta cũng được thực hiện với độ pha loãng 1/50 (v/v) trong dung dịch 1 nM KCl.
Hình thái học của các tiểu phân nano được khảo sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) với thiết bị MERLIN (Carl Zeiss), hoạt động ở 3 kV và dòng điện khoảng 0,1 mA Các mẫu chất lỏng được lắng trên băng hai mặt dẫn điện cacbon, sau đó được phủ một lớp bạch kim palladiume kích thước khoảng 4 nm.
Hiệu suất bắt giữ và khả năng tải thuốc của tiểu phân nano PLGA
Sau khi loại bỏ dung môi hữu cơ, 2 ml hỗn dịch nano được cho vào mỗi ống vivaspin (50 kDa MWCO) và tiến hành ly tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 30 phút Phần dịch thu được bên dưới ống được sử dụng để xác định lượng PZA tự do bằng máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 268 nm Hiệu suất bắt giữ thuốc được tính bằng phần trăm thuốc bị giữ lại so với lượng thuốc ban đầu, với công thức EF% = [(lượng thuốc ban đầu - lượng thuốc tự do) / lượng thuốc ban đầu] x 100.
Tổng lượng polymer (mg) + thuốc được bắt giữ
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
Kết quả xây dựng và tối ưu hóa công thức tiểu phân nano PLGA tải PZA
Kết quả thực nghiệm theo thiết kế Taguchi và phân tích phương sai
Thiết kế mảng trực giao Taguchi được áp dụng để xác định các điều kiện tối ưu và lựa chọn các yếu tố ảnh hưởng chính đến kích thước hạt trung bình và chỉ số đa phân tán Bảng 3.7 trình bày cấu trúc của thiết kế mảng trực giao Taguchi cùng với kết quả đo kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán (PI) Kết quả thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm Design Expert, nhằm làm nổi bật ảnh hưởng chính của các yếu tố, sau đó thực hiện phân tích phương sai (ANOVA) để xác định các yếu tố có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.7 Kết quả kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán
Loại dung môi hữu cơ
Tỷ lệ khối lượng PZA / PLGA
Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài
Kích thước tiểu phân trung bình (nm)
Chỉ số đa phân tán
Kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán của các tiểu phân nano PLGA đã được sử dụng làm giá trị đầu vào cho phần mềm Design Expert để phân tích Để đảm bảo mô hình hồi quy có độ tin cậy, các kiểm định ý nghĩa đã được thực hiện, với bảng ANOVA tóm tắt kết quả phân tích Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy giá trị “Prob> F” thấp hơn 0,05, cho phép loại bỏ biến số không quan trọng và cải thiện mô hình Giá trị R² đạt 0,99, cho thấy khoảng 99% sự thay đổi trong dữ liệu được giải thích bởi mô hình Mặc dù giá trị predicted R² (0,71) không gần với adjusted R² (0,94), sự chênh lệch không quá lớn (khoảng 0,2) cho phép tiếp tục sử dụng mô hình này Giá trị adjusted R² rất hữu ích để so sánh các mô hình khác nhau Tỷ lệ “adeq Precision” lớn hơn 4 cho thấy tín hiệu phù hợp, trong khi biến tỷ lệ khối lượng PZA/PLGA với giá trị P lớn hơn 0,05 vẫn được giữ trong mô hình do làm tăng ý nghĩa thống kê của nó.
Bảng 3.8 Kết quả ANOVA của kích thước tiểu phân trung bình (R 2 = 0,99; predicted R 2 = 0,71; adjusted R 2 = 0,94; adeq precision = 12,13 > 4)
Nguồn Tổng bình phương Độ tự do
C- Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước bên ngoài
Tổng số liệu đạt 172511,6 với chỉ số đa phân tán được tính theo phương trình y’ (y + k) λ, trong đó hằng số k = 0 và lambda λ = 1,82 Các giá trị này sau đó được phân tích tương tự như kích thước tiểu phân trung bình Kết quả phân tích được trình bày trong bảng ANOVA (Bảng 3.8).
Mô hình có ý nghĩa với giá trị “Prob> F” thấp hơn 0,05, cho thấy các biến số quan trọng bao gồm loại dung môi, tỷ lệ khối lượng PZA/PLGA và tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước bên ngoài Giá trị R² đạt 0,99, gần với 1, cho thấy độ tin cậy cao Hơn nữa, giá trị predicted R² (0,99) gần như tương đương với adjusted R² (0,99), và “adeq Precision” lớn hơn 4 chứng tỏ tín hiệu mô hình là thích hợp.
Bảng 3.9 Kết quả ANOVA của chỉ số đa phân tán (R 2 = 0,99; predicted R 2 = 0,99; adjusted R 2
Tổng bình phương Độ tự do
B- Tỷ lệ khối lượng PZA
C- Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài
Hình 3.2 cho thấy rằng các biến độc lập có tác động khác nhau đến kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán Cụ thể, kích thước tiểu phân giảm khi sử dụng hỗn hợp DCM:EA hoặc chỉ sử dụng EA, với kích thước tiểu phân nhỏ nhất đạt được khi tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước bên ngoài là 1:10 Ngoài ra, chỉ số đa phân tán tăng đáng kể khi sử dụng hỗn hợp DCM:EA và khi tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước bên ngoài giảm, trong khi chỉ số này lại giảm mạnh khi tỷ lệ khối lượng PZA/PLGA giảm.
Quá trình tối ưu hóa kích thước tiểu phân trung bình và chỉ số đa phân tán được thực hiện thông qua phần mềm Design-Expert, sử dụng chức năng “desirability” để phân tích ảnh hưởng của các yếu tố độc lập Kết quả cho thấy sự tương quan tuyến tính giữa các mức của các yếu tố này và kích thước hạt phân tán Thông tin chi tiết về các ràng buộc của yếu tố độc lập cùng với giá trị kích thước hạt trung bình và chỉ số đa phân tán được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10 Ràng buộc của các yếu tố, giá trị của kích thước hạt trung bình và chỉ số đa phân tán
Mục tiêu Khoảng giới hạn
Loại dung môi hữu cơ in range DCM – EA
Tỷ lệ khối lượng PZA / PLGA equal to 1:2.5 1:1 – 1:5
Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài equal to 1:1 1:1 – 1:20
Nồng độ PVA (%) Term not in model
Kích thước hạt trung bình (nm) Minimize 79 – 467
Chỉ số đa phân tán Minimize 0.10 – 0.56
Dựa trên dữ liệu kích thước tiêu phân, chỉ số đa phân tán và phân tích ANOVA, phần mềm Design Expert đã đề xuất các công thức tối ưu để điều chế tiểu phân nano PLGA chứa PZA.
Bảng 3.11 Các công thức tối ưu của tiểu phân nano PLGA tải PZA
Loại dung môi hữu cơ EA DCM:EA EA DCM
Tỷ lệ khối lượng PZA / PLGA 1:2.5 1:2.5 1:5 1:2.5
Tỷ lệ thể tích pha hữu cơ / pha nước bên ngoài 1:1 1:1 1:1 1:1
Kích thước hạt trung bình (nm) 170 225 315 350
Chỉ số đa phân tán 0,11 0,20 0,13 0,07
Loại dung môi hữu cơ 0,87 0,70 0,61 0,55
Bảng 3.11 trình bày các công thức tối ưu dự đoán từ phần mềm, trong đó công thức 1 (CT1) với hệ số mong muốn 87% được lựa chọn để điều chế tiểu phân nano PLGA tải PZA, nhờ vào kết quả dự đoán cho cả kích thước tiểu phân và chỉ số đa phân tán thấp Kết quả thực nghiệm về kích thước tiểu phân cho thấy sự tương đồng với dự đoán từ phần mềm (Bảng 3.12) Mặc dù chỉ số đa phân tán thực nghiệm thấp hơn so với mô hình, nhưng vẫn cho thấy rằng các tiểu phân nano có kích thước khá đồng nhất.
Bảng 3.12 Kết quả dự đoán và thực nghiệm về kích thước tiểu phân và chỉ số đa phân tán của tiểu phân nano PLGA tải PZA
Kích thước tiểu phân trung bình (nm) Chỉ số đa phân tán
Kết quả khảo sát khả năng phóng thích PZA của các tiểu phân nano
Kết quả khảo sát sự phóng thích PZA theo thời gian của CT1 được thể hiện trong Hình 3.3 Nồng độ tích lũy phần trăm của PZA hay thời gian phóng thích đã được chuyển đổi thành dạng log, căn bậc hai, hoặc căn bậc ba, như mô tả trong Bảng 3.11, tương ứng với các phương trình bậc 0 và bậc 1.
Higuchi, Korsmeyer Peppas và Hixon Crowell, Hình 3.4.
Hình 3.3 Biểu đồ phần trăm PZA phóng thích theo thời gian của CT1 Bảng 3.13 Kết quả phóng thích PZA của CT1 (n = 3)
Căn bậc 3 (% PZA còn lại)
Sau 96 giờ, PZA không còn được phóng thích vào môi trường, cho thấy sự phóng thích nhanh ban đầu do các phân tử PZA tự do trên bề mặt tiểu phân nano PLGA Những phân tử này không bị loại bỏ hoàn toàn trong quá trình chế tạo tiểu phân nano, mặc dù đã trải qua siêu lọc ly tâm hai lần bằng nước cất Sự phóng thích chậm của PZA từ CT1 vào môi trường là do tính sơ nước của PLGA, khiến nước khó thấm vào tiểu phân nano và hòa tan PZA.
Dữ liệu phóng thích của CT1 được mô hình hóa cho thấy sự phóng thích có kiểm soát của PZA tuân theo phương trình Korsmeyer Peppas với R² = 0,97 và n = 0,273 Giá trị n của CT1 nằm ngoài giới hạn quy luật phóng thích thuốc có kiểm soát của phương trình này và thuộc về quy luật lũy thừa, một quy luật chưa được giải thích rõ ràng về cơ chế khuếch tán thuốc có kiểm soát.
Kết quả khảo sát các đặc tính tải thuốc của tiểu phân nano
Các đặc tính hóa lý của CT1 được trình bày trong Bảng 3.12 Kích thước tiểu phân của CT1 là
Kích thước 173 nm với chỉ số đa phân tán thấp hơn 0,1 là lý tưởng cho sự hấp thu của đại thực bào sau khi phân phối thuốc qua phổi Thế zeta của các tiểu phân nano khoảng -1 mV cho thấy các hạt này rất trung tính, giúp tăng khả năng tương tác với các tế bào phổi Hiệu suất bắt giữ PZA CT1 đạt khoảng 8%, dẫn đến hiệu suất tải thuốc là 3,1%.
Tiểu phân PLGA được chế tạo bằng phương pháp nhũ tương kép kết hợp với bay hơi dung môi, thường có kích thước từ 100 đến 250 nm Việc thay thế dung môi dichloromethane bằng ethyl acetat đã giúp cải thiện kích thước tiểu phân nano xuống dưới 200 nm Thế zeta của tiểu phân nano PLGA sử dụng PVA làm chất ổn định thường dao động từ giá trị âm đến trung tính Mặc dù phương pháp nhũ tương kép bay hơi dung môi thường có hiệu suất bắt giữ thấp đối với các phân tử nhỏ thân nước do sự khuếch tán nhanh chóng, nhưng hiệu suất này có thể được nâng cao thông qua việc lựa chọn polymer hoặc chất hoạt động bề mặt phù hợp.
Bảng 3.14 Đặc điểm của tiểu phân nano PLGA tải PZA
Lần Kích thước tiểu phân trung bình (nm)
Chỉ số đa phân tán
Hình 3.5 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân (trên) và thế zeta (dưới) của CT1
Hình 3.6 Hình chụp SEM tiểu phân nano PLGA tải PZA của CT1.