Biểu hiện gen flic cải biến của salmonella dublin trong escherichia coli và đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp

TỔNG QUAN

Salmonella dublin

Salmonella dublin là một chủng huyết thanh của Salmonella enterica, thuộc Chi Salmonella trong họ Enterobacteriaceae Loài vi khuẩn này có hình dạng que, là trực khuẩn gram âm, với kích thước đường kính khoảng 0,7-1,5 µm và chiều dài từ 2-5 µm Hầu hết các loài trong chi Salmonella đều di chuyển bằng tiêm mao Salmonella dublin có khả năng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với tốc độ phân bào khoảng 40 phút.

Salmonella có khả năng sống trong dải nhiệt rộng từ 6-46 độ C, với nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 37 độ C Trong môi trường nuôi cấy, hầu hết các phân loài và kiểu huyết thanh của Salmonella đều phát triển tốt trong điều kiện pH trung tính, dao động từ 6,5 đến 7,5.

Salmonella dublin là một loại vi khuẩn ký sinh chủ yếu trên gia súc, hiếm khi lây sang động vật khác Khi gia súc bị nhiễm, chúng thường có triệu chứng tiêu chảy nặng và biểu hiện tương tự như bệnh thương hàn Đối với con người, S.dublin có thể gây ra tiêu chảy và thường dẫn đến nhiễm trùng huyết cùng với sự hình thành áp xe.

S.dublin có các triệu chứng rất giống với nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis [9]

Protein flagellin

Flagella là cấu trúc protein phức tạp giúp Salmonella di chuyển, bao gồm ba phần: thể gốc, móc và roi Sợi roi dài khoảng 10-15 µm, đường kính 20 nm, được tạo thành từ 20,000 protein flagellin, tạo cấu trúc xoắn kép và cung cấp lực đẩy cho tế bào trong môi trường nhớt Cấu trúc sợi roi dạng ống, rỗng, với hai mặt trong và ngoài Protein flagellin có bốn domain: D0, D1, D2 và D3, trong đó D0 có hai chuỗi xoắn α, còn D1 gồm ba cấu trúc xoắn α và một chuỗi β Các domain D0 và D1 được nối với nhau bằng một cấu trúc loop dài khoảng 20Å, trong khi D2 và D3 chủ yếu là chuỗi β, tạo phần nhô ra ở mặt ngoài ống Sự sắp xếp của D0 và D1 gần như song song với chiều dọc của sợi roi, giúp ổn định cấu trúc Các tiểu phần này liên kết theo dạng vòng, tạo nên cấu trúc sợi của flagella, với D0 chủ yếu tương tác kỵ nước và D1 liên kết ưa nước, góp phần vào sự ổn định và tính đa hình của sợi.

Các domain D0 và D1 được coi là hai vùng có trình tự bảo thủ và không thay đổi giữa các loài, trong khi đó, các domain D2 và D3 lại có trình tự amino acid không ổn định Đặc biệt, ở một số loài như Pseudomonas aeruginosa, protein FliC hoàn toàn thiếu domain D3, trong khi Bacillus subtilis chỉ chứa hai domain D0 và D1.

Hình 1.2: Lát cắt ngang cấu trúc roi (a) và cấu trúc protein flagellin (b)[36] 1.2.2 Vai trò của Flagellin trong đáp ứng miễn dịch

Flagellin là gì, chức năng, vai trò (sách miễn dịch)

Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của flagellin đã được ghi nhận lần đầu bởi các nhóm nghiên cứu của Ciacci-Woolwine và Wyaint vào năm 1998, cho thấy protein flagellin của Salmonella có thể kích thích các cytokine Năm 2000, McDermott và cộng sự đã chứng minh rằng flagellin gây ra đáp ứng viêm ở bạch cầu đơn nhân Hayashi và các đồng nghiệp vào năm 2003 đã phát hiện ra sự tương tác giữa flagellin và thụ thể bề mặt TLR5 của các tế bào miễn dịch bẩm sinh Các nghiên cứu sau này cũng chỉ ra rằng các protein tái tổ hợp mất vùng siêu biến không ảnh hưởng đến khả năng gây đáp ứng miễn dịch của flagellin; thay vào đó, các vùng trình tự bảo thủ D0 và D1 là những yếu tố quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch qua TLR5.

Flagellin kích hoạt tế bào miễn dịch thông qua thụ thể TLR5, có cấu trúc gồm ba domain: vùng lặp lại giàu leucine (LRC), vùng xuyên màng và domain TIR Thụ thể TLR5 nhận biết flagellin nhờ vào trình tự amino acid ở các vùng bảo thủ đầu N và C của nó Sự liên kết giữa flagellin và TLR5 được hình thành thông qua các dimer giữa các amino acid ở vị trí 12 và 13 của vùng LLR Kết quả của sự liên kết này là sự tăng cường biểu hiện của nhiều gene, đặc biệt là các gene liên quan đến tổng hợp.

Cytokine, các gene điều hòa nitric oxide, H2O2, chemokine và protein bảo vệ tế bào chủ đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch Đối với Salmonella, flagellin được đưa vào tế bào chủ qua hệ thống tiết loại III Khi ở trong tế bào chất, flagellin được nhận diện và liên kết bởi các protein NAIP5 và NAIP6, tạo thành phức hợp flagellin-NAIP5/6 Phức hợp này tương tác với thụ thể NLRC4, dẫn đến hoạt hóa caspase-1 và kích thích chuyển hóa pro-interleukin-1β thành interleukin-1β Trong quá trình này, các domain bảo thủ đầu N và C của flagellin là vị trí liên kết với TLR, trong khi amino acid 35 ở đầu C của flagellin là dấu hiệu nhận biết của NLRC4.

Flagellin được nhận biết bởi thụ thể TLR11, tương tác này phức tạp hơn so với TLR5 Nghiên cứu của Hatai và cộng sự (2016) chỉ ra rằng TLR5 có thể tương tác với flagellin ở cả pH kiềm và acid, trong khi TLR11 chỉ hoạt động trong môi trường acid Hơn nữa, các domain đầu N và C của flagellin có thể độc lập tương tác với TLR11, trong khi TLR5 cần cả hai đầu domain để kích hoạt hệ miễn dịch TLR11 thường có mặt trên bề mặt tế bào biểu mô của các cơ quan như ruột, phổi và da, đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sự xâm nhập của Salmonella vào cơ thể chuột.

1.2.3 Ứng dụng của flagellin trong thực tiễn

1.2.3.1 Flagellin có vai trò như một chất chống ung thư

Các chất chủ vận của TLR đã được chứng minh có khả năng chống ung thư trong nhiều mô hình động vật và một số đã thử nghiệm trên người Vai trò của các thụ thể TLR rất phức tạp; nghiên cứu cho thấy TLR4 và TLR9 có thể kích thích và thúc đẩy sự phát triển của tế bào ung thư, trong khi TLR3 và TLR5 lại có tác dụng ức chế khối u Đặc biệt, các chất chủ vận TLR, như flagellin, không hoạt động như một chất miễn dịch chống lại ung thư hay kích thích sự phát triển của nó.

45] Sfondrini và cs (2006) đã ghi nhận flagellin có khả năng làm tăng tốc độ phát

Sự phát triển của khối u có thể bị ảnh hưởng bởi flagellin, một yếu tố gây ra phản ứng miễn dịch Khi khối u có miễn dịch cao, flagellin kích thích đáp ứng Th1 và ức chế sự phát triển của khối u Ngược lại, trong các khối u có miễn dịch yếu, flagellin có thể kích thích đáp ứng Th2 và ngăn chặn quá trình apoptosis ở tế bào ung thư Điều này cho thấy khả năng chống ung thư của flagellin phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của khối u Để ngăn chặn sự phát triển của khối u, nhiều nghiên cứu đã kết hợp flagellin với CpG-ODN, dẫn đến tăng cường biểu hiện IL-12 và IL-23, từ đó kích thích các quá trình ức chế sự tăng trưởng ung thư.

Để kiểm chứng vai trò sinh học của flagellin, việc sản xuất protein trong phòng thí nghiệm với cấu trúc và hoạt tính tương tự như tự nhiên là rất quan trọng.

1.2.3.2 Cơ chế bảo vệ nhiễm xạ cấp của flagellin

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng hỗ trợ điều trị bệnh phóng xạ cấp của flagellin Nghiên cứu của Vijay-Kumar và cộng sự (2008) cho thấy chuột tiêm 1 μg flagellin trước khi chiếu tia γ 8 Gy có tỷ lệ sống sót 75% sau 40 ngày mà không có dấu hiệu tổn thương tế bào biểu mô ruột Ngoài ra, nghiên cứu về Entolimod/CBLB502, chứa flagellin từ Salmonella, trên khỉ cho thấy Entolimod giảm nguy cơ tử vong 2-3 lần sau 48 giờ chiếu xạ với liều 6,50 - 6,75 Gy, đồng thời tăng cường phục hồi cơ quan tạo máu và hệ miễn dịch, giảm tổn thương do phóng xạ cấp thể tiêu hóa thông qua cơ chế bảo vệ apoptotic và tăng cường tái tạo mô mới.

Protein flagellin là chất chủ vận của thụ thể Toll-like 5 (TLR-5), có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào TLR-5 là protein xuyên màng, hiện diện trên các tế bào miễn dịch như tế bào tua, bạch cầu trung tính, đại thực bào, cũng như trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phổi Phần ngoại bào của thụ thể TLR-5 chứa vùng giàu.

Leucine gắn với FliC để kích hoạt con đường phụ thuộc MyD88, dẫn đến sự liên kết của MyD88 với TLR-5 và IRAK-4, cùng với IRAK-1 và TRAF6 IRAK-4 phosphoryl hóa IRAK-1, giải phóng TRAF6 và kích hoạt TAK1, từ đó phosphoryl hóa phức hợp IκB kinase (IKK) và protein mitogen (MAP) Sự kích hoạt IKK dẫn đến việc kích hoạt NF-κB, gây ra cảm ứng các gen liên quan đến phản ứng viêm NF-κB giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do bức xạ bằng cách kích thích sản xuất cytokine viêm như IL-1, IL-3, IL-6, và tăng cường biểu hiện các gen chống apoptotic như Bcl-2, cũng như các yếu tố chống oxy hóa như r-GCS, giúp giảm thiểu tổn thương oxy hóa.

Hình 1.3: Cơ chế bảo vệ phóng xạ của flagellin [54]

Các chemokin được tiết ra từ tế bào biểu mô có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự di cư và trưởng thành của tế bào tua, đồng thời kích hoạt các tế bào lympho T để thực hiện đáp ứng miễn dịch.

Flagellin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ thống miễn dịch, góp phần vào việc sản sinh đáp ứng miễn dịch hiệu quả Nó cũng giúp giảm thiểu độc tính của bức xạ đối với cơ thể, bảo vệ sức khỏe con người.

Nghiên cứu sản xuất flagellin tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp là sản phẩm được tạo ra từ các đoạn ADN tái tổ hợp trong các tế bào hoặc cơ thể không sản xuất đủ hoặc không sản xuất tự nhiên loại protein này Chúng đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học, bao gồm phân tích biểu hiện gen, cấu trúc và chức năng protein, tương tác protein - protein, và tạo kháng thể Việc tổng hợp protein tái tổ hợp yêu cầu một hệ thống biểu hiện phù hợp với cấu trúc và hoạt tính của protein Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chủng E coli Rosetta 1 và vector pE_SUMO3 để tạo dòng tế bào biểu hiện FliC tái tổ hợp.

Nhóm nghiên cứu của GS TS Trương Nam Hải tại Viện Công nghệ sinh học đã thành công trong việc nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch vùng epitope kháng nguyên của flagellin FliC và FljB từ S typhimurium và S enteritidis trong tế bào E coli Kết quả nghiên cứu đã dẫn đến việc phát triển kit phát hiện nhiễm Salmonella và vắc xin phòng Salmonella cho gà Để tăng cường mức độ biểu hiện và tính sinh miễn dịch của flagellin, cấu trúc dung hợp với Trx đã được sử dụng, tuy nhiên, cấu trúc này không phù hợp cho ứng dụng trên người Để tổng hợp flagellin cho ứng dụng y tế, nhóm nghiên cứu đã sử dụng gen fliC đã loại bỏ vùng biến đổi D2-D3 nhằm giảm tính kháng nguyên.

1.3.1 Tổng hợp gene fliC mã hóa cho flagellin

Các domain D0, D1, D2, và D3 là những thành phần chính cấu thành protein flagellin Trong đó, D0 và D1 là các vùng trình tự bảo thủ với ít sự thay đổi giữa các loài, trong khi D2 và D3 thường có những biến đổi đặc trưng cho từng loài.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng ba đoạn gene fliC với các trình tự khác nhau, được tổng hợp nhân tạo bởi Genscrip Đặc biệt, cấu trúc fliC 3 được thiết kế dựa trên chế phẩm Entolimod (CBLB502), với thành phần chính là

The fliC gene from the Salmonella enterica serovar dublin strain, identified by the international gene bank code AAA27081, was utilized, with CBLB502 serving as a control The fliC 3 gene segment was designed to exclude the D2 and D3 regions, replaced by a 16-amino acid linker domain derived from the pGEX-KG plasmid, positioned between amino acids 176 and 402, in accordance with the CBLB502 design The complete nucleotide sequence of fliC 3 is 891 bp, encoding a flagellin of approximately 33 kDa Additionally, the fliC 1 and fliC 2 segments, sourced from the flagellin fliC of Salmonella enterica serovar styphimurium (gene bank code NC_003197), also had their D2 and D3 regions removed, with fliC 2 linked to the remaining segments by a 29-amino acid linker domain, resulting in lengths of 861 bp for fliC 2 and 813 bp for fliC 1.

Hình 1.4: Trình tự amino axit của flagellin sử dụng trong thí nghiệm

Vector biểu hiện là công cụ mang gen ngoại lai, giúp phiên mã và dịch mã mARN trong tế bào chủ để tổng hợp protein mục tiêu Các loại vector phổ biến bao gồm plasmid, phage và cosmid.

Vector pE-SUMO3 (5743 bp) của LifeSensors là một công cụ phổ biến trong nghiên cứu protein tái tổ hợp Với cấu trúc bao gồm điểm khởi đầu sao chép (Ori) cho DNA polymerase, gen chỉ thị kháng sinh (ampicillin hoặc kanamycin) để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid, và vùng đa nhân dòng (MCS) chứa các trình tự cắt của enzyme giới hạn, pE-SUMO3 tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa gen đích vào vector.

Vector pE-SUMO3 hỗ trợ biểu hiện protein tái tổ hợp dưới dạng dung hợp với protein SUMO3, tối ưu hóa mức độ biểu hiện và tính tan của protein trong tế bào E coli Vector này đặc biệt phù hợp cho những protein cần axit amin đầu N chính xác để duy trì hoạt tính và thời gian bán rã, cũng như nghiên cứu cấu trúc và protein trị liệu Việc sử dụng pE-SUMO3 để biểu hiện gene fliC tạo ra protein flagellin tái tổ hợp rất quan trọng, bởi vì việc giữ ổn định vùng bảo thủ D0 và D1 của flagellin giúp thụ thể TLR-5 nhận biết và liên kết với nó Điều này dẫn đến việc tăng cường biểu hiện của các gene liên quan đến tổng hợp cytokine, điều hòa nitric oxide, chemokine và các protein bảo vệ tế bào chủ, từ đó kích hoạt hệ thống miễn dịch.

pE-SUMO3 có chứa trình tự mã hóa oligo-histidine (His-tag), giúp tinh chế protein mục tiêu và phát hiện protein này qua kháng thể đặc hiệu với His-tag Sau khi tinh sạch, protein đích được cắt ra khỏi protein dung hợp với SUMO bằng enzyme SUMO protease 2, enzyme này nhận biết cấu trúc bậc ba của SUMO để thực hiện cắt, từ đó tránh hiện tượng cắt không đặc hiệu trong phân tử protein.

1.3.3 Chủng E coli sử dụng cho nhân dòng vector và biểu hiện protein tái tổ hợp

Lựa chọn hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp phù hợp là yếu tố quyết định để đạt được năng suất và chất lượng mong muốn Mỗi hệ thống biểu hiện đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, phù hợp với đặc điểm của gen và protein ngoại lai.

Để biểu hiện protein cần thiết cho quá trình cải biến sau dịch mã, như glycosyl hóa, thường sử dụng hệ thống biểu hiện nhân thực như nấm men hoặc côn trùng Tuy nhiên, những hệ thống này mặc dù hiệu quả cho các protein phức tạp nhưng lại có hiệu suất thấp, chi phí sản xuất cao và thời gian nuôi cấy dài Ngược lại, hệ thống biểu hiện vi khuẩn cho các protein từ sinh vật nhân sơ lại có nhiều ưu điểm nổi bật, phù hợp với đặc điểm cấu trúc protein mà hầu như không cần cải biến.

11 coli khi đƣợc nghiên cứu và phát triển đã trở thành hệ biểu hiện hiệu quả và rất phổ biến đối với các protein tương đối đơn giản

Vi khuẩn E coli là một trong những vi khuẩn được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu và sản xuất protein Các protein được sản xuất từ E coli có ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu cấu trúc, công nghiệp dược phẩm, enzyme và thực phẩm E coli có nhiều ưu điểm như thao tác đơn giản, thời gian sinh trưởng ngắn (20 phút cho một thế hệ), môi trường nuôi cấy dễ dàng, chi phí thấp và độ ổn định cao của protein, cùng với hiệu suất sinh tổng hợp protein lớn Ngoài ra, nhiều chủng E coli như BL21 và Rosettagami sở hữu promoter mạnh, giúp kiểm soát chặt chẽ quá trình sản xuất protein ngoại lai, với khả năng biểu hiện lên đến 50% tổng số protein trong tế bào.

Trong sản xuất protein trị liệu cho y khoa, việc loại bỏ lipopolysaccharide (nội độc tố) là rất quan trọng để đảm bảo hàm lượng của chúng nằm trong giới hạn an toàn E coli trong quá trình sinh trưởng có thể tích lũy nội độc tố, gây ra phản ứng phụ nguy hiểm cho con người và động vật khi tiếp xúc qua đường máu.

Các gen đích được nhân bản trong tế bào E coli dưới sự kiểm soát của tín hiệu phiên mã T7 RNA polymerase, giúp tăng cường mức độ biểu hiện và chỉ biểu hiện gen duy nhất ở T7 promoter Khi có mặt lactose hoặc các chất tương tự, T7 RNA polymerase sẽ được kích hoạt thông qua operon lac UV5 Để kích hoạt lac promoter, chất cảm ứng IPTG thường được sử dụng, vì cấu trúc của IPTG tương tự như lactose, cho phép nó gắn vào protein ức chế lacI, làm thay đổi cấu hình của chất ức chế và ngăn không cho nó bám vào lac operator Kết quả là, T7 RNA polymerase nhanh chóng phiên mã gen ngoại lai, dẫn đến sự tổng hợp protein đích.

Chủng E coli Rossetta 1 được phát triển từ chủng BL21 lacZY với đột biến mất gene lacY, gene này mã hóa cho lac permease Đột biến này giúp tối ưu hóa khả năng tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong toàn bộ quần thể tế bào Khi biểu hiện ở mức thấp, E coli Rossetta 1 có khả năng tăng cường hiệu suất trong các ứng dụng sinh học.

Vật liệu

2.1.1.1 Plasmid và mồi nhân gene

Nghiên cứu này tập trung vào gen fliC 3 cải biến từ chủng Salmonella enterica serovar dublin (mã số ngân hàng gen AAA27018) và thiết kế thêm hai dòng tế bào fliC 1 và fliC 2 từ chủng Salmonella enterica serovar styphymurium (mã số ngân hàng gen NC_003197) để so sánh và mở rộng nghiên cứu Các đoạn gene fliC 1, fliC 2 và fliC 3 được tổng hợp trong vector pUC thông qua phương pháp tổng hợp gene (Gene Script), với trình tự các đoạn gen fliC cải biến được trình bày trong phụ lục 9.

Hình 2.1: Cấu trúc gene fliC 3 cải biến

- Vector pSUMO3 có kích thước 5743 bp được dùng cho mục đích tách dòng và biểu hiện gene fliC (Life-sensor) (phụ lục 1)

Cặp mồi nhân gene fliC được thiết kế bởi Phòng độc học và các bệnh nhiệt đới, Viện Y sinh nhiệt đới, đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện enzyme giới hạn tương ứng Trình tự gạch chân trong cặp mồi này là yếu tố then chốt để xác định chính xác gene fliC, góp phần vào nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực y tế.

F_Flic/BsaI: 5’TATATGGTCTCTAGGTATGGCACAAGTCATTAAT 3’ R_Flic/SalI: 5’CCGGCGCGGTCGACTTAACGCAGTAAAGAGAG 3’

- Chủng Escherichia coli DH5α (cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học) đƣợc dùng cho mục đích tách dòng gene fliC

- Chủng Escherichia coli Rosetta 1 (Viện Công nghệ sinh học) đƣợc dùng cho mục đích biểu hiện protein tái tổ hợp

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Các loại hóa chất, môi trường và thiết bị dùng cho nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.1, 2.2 và 2.3

Bảng 2.1: Các loại enzyme, kháng thể và hóa chất dùng trong nghiên cứu

Tên sản phẩm Hãng sản xuất

Enzyme cắt giới hạn BsaI, SalI, XbaI, T4 DNA ligase, thang chuẩn protein, loading dye 6X, TAE 50X, kháng thể 2 kháng chuột cộng hợp peroxidase, màng PVDF

Kháng thể 1 kháng histag Invitrogen

DNA marker 1kb, agarose Norgen

NaCl, CaCl 2 , NaOH, IPTG, Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , K 2 HPO 4,

KH 2 PO 4 , Tris-HCl, ammonium persulfate (APS), acrylamide, bis-acrylamide, glycine, glycerol, Temed, ethidium bromide, Skimmed milk, tween 20, Ethanol,

Methanol, acid axetic, urea, Phenylmethanesulfonyl

Fluoride (PMSF), Comassie Brilliant Blue, 2-

Yeast extract, trypton, LB-broth Bio-basic

SDS, Tris-base Bio-rad

GeneJET PCR Purification Kit Thermo

Mega quick spin plus Fragment DNA purification Kit Intron

Rapid DNA Ligation Kit Thermo plasmid GenJET Plasmid Miniprep Kit Thermo

Bảng 2.2: Các môi trường và dung dịch dùng cho nghiên cứu

Tên dung dịch Thành phần

Dung dịch 1M K 2 HPO 4 87,04g K 2 HPO 4 Bổ sung nước cất đến 500ml

Dung dịch 1M KH 2 PO 4 68,04 g KH 2 PO 4 Bổ sung nước cất đến 500ml

Ampicillin (100mg/ml) 1g ampicillin bổ sung nước cất vô trùng đến 10ml IPTG 1M 0,1 g IPTG Bổ sung nước cất vụ trựng đến 419,64 àl

Các môi trường lên men

- 5g Bacto TM Yeast Extract; 10g Bacto TM Trypton; 5g NaCl Dẫn nước cất lên 1 lít, khử trùng 121°C, 1 atm,

- 6g peptone; 12g yeast extract; 5ml glycerol 40%; 36ml K 2 HPO 4 1M; 8,5ml KH 2 PO 4 1M Dẫn nước cất đến 500ml

Môi trường SB - 3 g NaH 2 PO 4 ; 1,5 g KH 2 PO 4 ; 0,25g NaCl; 0,5g

NH 4 Cl; 5g glucose Dẫn nước cất đến 500ml

- 3 g NaH 2 PO 4 ; 1,5 g KH 2 PO 4 ; 0,25g NaCl; 0,5g

NH 4 Cl; 2,5g yeast extract Dẫn nước cất đến 500ml M9 + 0,5% yeast extract

- 3 g NaH 2 PO 4 ; 1,5 g KH 2 PO 4 ; 0,25g NaCl; 0,5g

NH 4 Cl; 5g glucose; 2,5g yeast extract Dẫn nước cất đến 500ml

20g LB broth Bổ sung nước cất đến 500ml hấp khử trùng ở 121ºC, 1 atm, 20 phút Bổ sung 0,5ml dung dịch ampicillin 100mg/ml khi nhiệt độ môi trường ở khoảng 40ºC

Tris HCl 20mM, pH 8 3,152 g Tris HCl Hòa tan trong nước đến 1 lít, pH 8

Treatment buffer 6X 0,453g tris-base, 6 ml glycerol, 1,2 sg SDS, 6 mg bromophenol blue, 1 ml 2-mecaptoethanol

Agarose 1% 1 g bột agarose pha trong đệm TAE 1X đến 100 ml

Dung dịch nhuộm DNA Ethidium bromide pha trong nước cất đến nồng độ cuối cựng là 0,5 àg/ml Đệm chạy điện di protein

14,4 g glycine; 3,02 g trisbase; 1 g SDS Bổ sung nước cất đến 1 lít

To prepare a 12.6% gel, mix 1.0 ml of H2O, 2.25 ml of Tris HCl (pH 8.8), 1.8 ml of 50% glycerol, 3.8 ml of 30% bis-acrylamide, 90 µl of 10% SDS, 60 µl of 10% APS, and 6 µl of Temed For a 5% gel, combine 1.3 ml of H2O, 0.5 ml of Tris HCl (pH 6.8), 0.35 ml of 30% bis-acrylamide, 10 µl of 10% SDS, 20 µl of 10% APS, and 2 µl of Temed.

0,025g Coomassie Brilliant Blue; 40 ml methanol; 10 ml acid axetic Dẫn nước cất đến 100 ml

Dung dịch rửa gel 5 ml methanol; 7,5 ml acid acetic Dẫn nước cất đến

100 ml Đệm cho Western blot:

Trisbase 30 g; glycine 144,13 g Dẫn nước cát tới 1 lít

100 ml blotting 10X; 200ml methanol Dẫn nước cất đến 1 lít

- 25 ml Tris-HCl 1M, pH 7,5; 10 ml NaCl 5M Dẫn nước cất đến 1 lít

- là dung dịch TBS 1X bổ sung thêm Tween-20 đến nồng độ cuối cùng là 0,1%

- 5g skimmed milk pha trong 100 ml TBS 1X

Bảng2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Tủ an toàn sinh học BMB-II-Laminar-S LAMSYSTEMS, Đức

Máy ly tâm lạnh dung tích lớnX-15R Beckman coulter, Hoa Kỳ

Máy ly tâm để bàn Eppendorf, Đức

Cân phân tích Sartorius, Đức

Máy điện di ADN Biorad, Hoa Kỳ

Máy UV soi gel Biorad, Hoa Kỳ

Bể ổn nhiệt WCB-22 DAI HAN, Hàn Quốc

Máy đo quang phổ BioSpec-mini, Hoa Kỳ

Máy lắc ổn nhiệt NB-205VL N-biotek, Hàn Quốc

Máy nhân bản gene Eppendorf, Đức

Máy siêu âm Sonics, Hoa Kỳ

Nguồn và bể điện di protein Cleaver Scientific, Anh

Nguồn và bể chạy western blot Cleaver Scientific, Anh

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này đƣợc tiến hành dựa theo sơ đồ

Mẫu ADN ban đầu được khuếch đại qua phản ứng PCR và tinh sạch, sau đó cắt bằng enzyme BsaI và SalI để tạo đầu nối với vector Sau khi cắt, vector và ADN được ghép lại thành vector SUMO_fliC Vector hoàn chỉnh được biến nạp vào dòng E coli DH5α để nhân lên và tiếp tục biến nạp vào tế bào E coli Rosetta 1 nhằm sản xuất protein flagellin Sản phẩm protein flagellin tái tổ hợp được tinh sạch, định lượng, sau đó giải trình tự và dự đoán cấu trúc 3D để so sánh với flagellin tự nhiên.

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm

2.2.2 Khuếch đại gene và tinh sạch sản phẩm PCR

Gene fliC cải biến từ vector pUC-FliC đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu: F-FliC/BsaI và R-FliC/SalI

Dự kiến sản phẩm PCR của các gen fliC 1, fliC 2 và fliC 3 sẽ có kích thước lần lƣợt là 813 bp, 816 bp và 891 bp

Thành phần phản ứng được thể hiện dưới bảng sau

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Thể tớch (àl)

Mẫu đối chứng âm có đầy đủ các thành phần ngoại trừ vector pUC_Flic Quy trình PCR được thực hiện theo chu kỳ nhiệt bao gồm: bước 1 biến tính ở 94°C trong 5 phút; bước 2 biến tính ở 94°C trong 20 giây; bước 3 gắn mồi ở 55°C trong 15 giây; bước 4 kéo dài ở 72°C trong 2 phút và lặp lại bước 2-4 trong 28 chu kỳ; bước 5 kéo dài trong 10 phút; và bước 6 kết thúc ở 4°C.

Sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR, sản phẩm PCR của gene fliC 1, fliC

2, fliC 3 được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET PCR Purification Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất và điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả

2.2.3 Cắt gene và vector bằng enzyme cắt giới hạn

Enzyme giới hạn là endonuclease nhận diện và cắt ADN tại các trình tự đặc hiệu 4, 6 hoặc 8 nucleotide, tạo ra đầu bằng hoặc đầu dính Plasmid pSUMO3 cùng với sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene fliC đã được tinh sạch và xử lý để tạo đầu dính bằng cặp enzyme giới hạn BsaI và SalI (Thermo) Thành phần phản ứng được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt

Thành phần Thể tớch (àl)

Sau khi thực hiện phản ứng cắt, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 2 giờ và sau đó được bất hoạt ở 65°C trong 15 phút Sản phẩm cắt sau đó được tinh sạch và kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.

The fliC gene and the pSUMO3 vector were cleaved using the restriction enzymes BsaI and SalI Subsequently, the fliC gene and the pSUMO3 vector were purified and mixed together in a specific ratio.

3 : 1 để tiến hành phản ứng ghép nối đoạn gene fliC vào vector pSUMO3 sử dụng enzyme T4 DNA ligase [53] Thành phần phản ứng được thể hiện ở bảng dưới đây:

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng nối gene fliC vào vector pSUMO3

Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ ở 22°C trong 15 phút trước khi biến nạp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt Plasmid tái tổ hợp pSUMO3 mang gene fliC, được ký hiệu là pSUMO-fliC, sẽ được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin và nuôi cấy ở 37°C qua đêm.

2.2.5 Biến nạp vào tế bào E coli

2.2.5.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli DH5α

Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp vào tế bào E coli khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt Quy trình bắt đầu bằng cách cho 5 µl sản phẩm lai hoặc 1 µl ADN plasmid vào ống eppendorf 1,5 ml chứa 50 µl tế bào E coli, sau đó đảo nhẹ và để trên đá trong 30 phút Tiếp theo, mẫu được đặt vào bể ổn nhiệt ở 42°C trong 90 giây, sau đó làm lạnh nhanh trên đá trong khoảng 2 phút Ống tế bào được bổ sung 600 µl môi trường LB và nuôi ở 37°C trong 45 phút Khi các ống tế bào vẩn đục, tiến hành ly tâm ở 5000 rpm trong 5 phút, bỏ 300 µl dịch nổi, và trộn đều dịch còn lại trước khi cấy trải trên đĩa petri có môi trường LBA đặc, nuôi ở 37°C qua đêm Cuối cùng, kiểm tra khuẩn lạc, bọc đĩa bằng parafilm và bảo quản ở 4°C.

2.2.5.2 Tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp từ tế bào E coli

ADN plasmid đƣợc tách sử dụng hóa chất và quy trình của bộ kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) Sản phẩm ADN plasmid đƣợc hòa trong

50 àl đệm elution buffer và bảo quản ở -20°C

2.2.5.3 Biến nạp và biểu hiện protein tái tổ hợp trên tế bào E coli Rosetta 1

Sản phẩm ADN vector thu đƣợc từ tế bào E coli DH5α đƣợc biến nạp vào tế bào E coli Rosetta 1 bằng phương pháp như đối với E coli DH5α

Lấy 1 khuẩn lạc E coli Rosetta 1 mang plasmid pSUMO_fliC tái tổ hợp được nuôi cấy trong 10 ml môi trường LBAmp ở nhiệt độ 37°C, 250 vòng/phút qua đêm (khoảng 16 – 18 giờ) Dịch tế bào được chuyển sang 10 ml môi trường LBAmp sao cho mật độ tế bào ban đầu OD600 = 0,05 Tiếp tục nuôi cấy cho đến khi tế bào đạt giá trị OD600 = 0,4 - 0,6 thì tiến hành cảm ứng IPTG tới nồng độ cuối cùng là 0,5 mM Nhiệt độ biểu hiện đƣợc duy trì ở 37°C Sau 4 giờ, thu mẫu đo mật độ tế bào ở bước sóng 600 nm Tế bào được thu lại ở 5000 vòng/phút trong 5 phút và đƣợc hoà lại trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH8 để đạt OD600 = 10 Sau đó, 50àl dịch tế bào đƣợc trộn với 10àl đệm biến tớnh mẫu 6X và biến tớnh ở 100°C

21 trong 15 phỳt Hỳt khoảng 5àl mẫu tra vào giếng SDS-PAGE 12,6% và điện di kiểm tra sự biểu hiện flagellin [44]

Dòng tế bào E coli Rosetta 1 được nhà cung cấp khuyến nghị cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, tuy nhiên, tỷ lệ biến nạp thành công vào dòng tế bào này thấp hơn so với dòng E coli DH5α Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa quy trình biến nạp plasmid vào E coli Rosetta 1 theo phương pháp của Sambrook và cộng sự.

Vào năm 2003, tế bào thu được sẽ được tách và điện di trên gel SDS-PAGE Hình ảnh sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm ImageJ nhằm xác định các điều kiện tối ưu Các điểm được hiểu chỉnh trong quá trình này bao gồm:

- Thành phần môi trường nuôi cấy cảm ứng

- Nồng độ chất cảm ứng

2.2.6 Tinh sạch và định lượng protein flagellin tái tổ hợp

2.2.6.1 Điện di protein trên SDS-PAGE và phân tích hình ảnh

Protein được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE theo phương pháp Laemmli (1970) Khoảng 5 µl dịch protein biến tính được đưa vào giếng và điện di ở hiệu điện thế 200V trong 1 giờ Sau đó, gel được gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Coomassie brilliant blue ít nhất 1 giờ Gel được rửa bằng dung dịch rửa cho đến khi quan sát thấy băng Cuối cùng, ảnh được chụp và phân tích kết quả bằng phần mềm ImageJ.

2.2.6.2 Tinh sạch protein flagellin tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực his-tag

Dịch tế bào sẽ được phá vỡ bằng sóng siêu âm trong 15 phút bằng máy siêu âm tự động (20ml) Sau đó, ly tâm dịch ở 11000 vòng/phút trong 10 phút để thu pha tủa chứa protein SUMO-fliC Phần cặn được hòa lại trong đệm 50mM PBS, 500mM NaCl, 1% Triton X100 và 4 M urea, lắc nhẹ trong 10 phút, rồi ly tâm lần nữa ở 11000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi chứa protein SUMO-fliC Cuối cùng, tiến hành sắc ký trên cột Hi trap (GE Healthcare) bằng cách đưa toàn bộ dịch nổi lên cột, rửa cột với 35 ml đệm rửa I chứa 10 mM Imidazole, và đẩy protein SUMO-fliC ra khỏi cột bằng 20 ml đệm thu mẫu chứa 100 mM Imidazole.

Thực hiện 22 lần thu mẫu, mỗi lần thu 2 ml, và rửa cột lần hai bằng đệm rửa I có chứa 500 mM Imidazole Sau đó, đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và kiểm tra chất lượng protein thông qua điện di trên gel SDS-PAGE 12,6%.

Dịch protein sau tinh sạch sẽ chứa 2M ure đƣợc đặt trong túi thẩm tách (SnakeSkin TM Dialysis Tubing, 10K MWCO, Thermo Scientific) và đƣợc thẩm tích

Protein được thẩm tách hai lần trong dung dịch đệm 20mM Tris-HCl, pH 8, không chứa ure, mỗi lần kéo dài 1 giờ ở nhiệt độ 4 độ C Hàm lượng protein sau thẩm tách được xác định bằng máy Nanodrop và được bảo quản ở -80 độ C.

2.2.6.4 Phương pháp lai Western blot

Phương pháp Western blot được sử dụng để xác định flagellin trong mẫu theo quy trình của Burnette (1981) Sau khi thực hiện điện di trên SDS-PAGE, protein được chuyển lên màng PVDF bằng bộ chuyển màng Biorad (Mỹ) ở hiệu điện thế 100V trong 1 giờ Màng sau đó được phủ bằng dung dịch Skimmed milk 5% để che chắn những vị trí không gắn protein, rồi rửa bằng đệm TBS 1X và ủ với kháng thể 1 trong 1 giờ Tiếp theo, màng được rửa lại và ủ với kháng thể 2 Cuối cùng, hiện màu bằng dung dịch TMB và quan sát sự xuất hiện của băng protein flagellin trên màng lai.

2.2.7 Phương pháp đọc trình tự acid amin của bằng LC/MS

Tinh sạch và định lƣợng protein FliC

3.3.1 Xử lý tiền tinh chế

Tính tan của protein là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của nó Sau khi kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, cả hai dạng tan và không tan của protein đã được phân tích Phương pháp siêu âm kết hợp với sốc nhiệt đã được sử dụng để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn, giải phóng protein Sau khi ly tâm, protein tan được thu thập ở dạng dịch nổi, trong khi các thành phần tế bào và protein không tan lắng xuống dưới dạng tủa Cuối cùng, cả hai pha đã được kiểm tra bằng điện di protein trên gel polyacrylamide 12,6%.

Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy protein SUMO-fliC 3 biểu hiện ở dạng không tan Để đảm bảo hoạt tính của protein flagellin tái tổ hợp, mẫu protein không tan đã được làm tan trong các nồng độ ure từ 0, 2, 4, 6 và 8M Kết quả cho thấy protein SUMO fliC3 tan tốt ở nồng độ 2M ure, và các protein tạp đã được loại bỏ hiệu quả qua các bước làm tan và tủa.

Hình 3 10: Kết quả xử lý tiền tinh chế flagellin tái tổ hợp trong ure Giếng TS: Protein tổng số,

Giếng M: Thang chuẩn protein (Thermo-26610)

Giếng S2-S5:Protein pha tan trong 2M, 4M, 6M, 8M ure,

Giếng P1: Protein pha không tan

Giếng P2-P5: Protein pha không tan trong 2M, 4M, 6M, 8M ure

Protein tái tổ hợp chủ yếu xuất hiện trong pha không tan P1, do đó cần xử lý bằng ure để chuyển protein sang pha tan, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch tiếp theo.

3.3.2 Tinh sạch protein SUMO-fliC bằng sắc ký ái lực

Hệ dung hợp SUMO có đầu N chứa 6 gốc Histidine, giúp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Trước khi đưa mẫu lên cột, cột được ổn định bằng đệm gắn mẫu để gắn SUMO_FliC với Ni2+ Các protein không bám sẽ bị rửa trôi, trong khi protein tái tổ hợp được thu hồi bằng đệm chứa imidazol ở nồng độ cao Các đệm thường dùng cho sắc ký bao gồm tris, phosphate hoặc acetate với nồng độ NaCl từ 150-500 mM, trong đó đệm PBS thường được sử dụng cho tinh sạch protein dung hợp với SUMO và là đệm hoạt động của enzym SUMO protease 2 Do đó, đệm PBS được thử nghiệm để tinh chế SUMO-FliC Hiệu quả bám của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần đệm, pH và đặc điểm protein, do đó thí nghiệm được tiến hành để kiểm tra nồng độ đệm gắn mẫu và đệm rửa nhằm đánh giá khả năng bám của SUMO-FliC và mức độ tinh sạch của protein thu được.

Sau khi xử lý protein từ dạng không tan thành dạng tan bằng 4M urea, chúng tôi tiến hành tinh sạch bước đầu với dung dịch đệm 10mM Imidazile, rửa trôi những protein không bám Phân đoạn được thu ở dung dịch đệm 100mM Imidazol và tiến hành điện di trên gel polyacrylamide 12,6% Kết quả cho thấy protein SUMO-fliC 3 bám vào cột, chủ yếu tập trung ở phân đoạn E4 và E5 Do đó, các phân đoạn này được thu nhận để thẩm tách và kiểm tra độ tinh sạch Sử dụng phần mềm Gel Analyzer, kết quả cho thấy hàm lượng protein thu được sau tinh sạch là 2488μg, so với 5450μg trên cột, đạt hiệu suất thu hồi 45,7% với độ tin cậy trên 95%.

Hình 3.11: Kết quả tinh sạch flagellin tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực

Giếng TS: Protein tổng số,

Giếng F: Dung dịch qua cột,

Giếng W1-W2: Dung dịch rửa cột,

Giếng E2-E5: Các phân đoạn protein thu được ở nồng độ 100mM Imidazole

Protein không bị thôi ra ở các bước rửa E4 và E5 là hai phân đoạn được chọn để thu protein tái tổ hợp

3.3.3 Đánh giá sự ổn định cấu trúc của protein dung hợp trong quá trình tinh sạch bằng phương pháp Western blot

Protein flagellin tái tổ hợp khi sản xuất sẽ kết hợp với protein SUMO mang trình tự histag, tạo thành chuỗi polipeptid lớn Để xác định xem cấu trúc này có được tế bào sản xuất hay không và có bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, chúng tôi đã sử dụng phương pháp Western blot với sản phẩm từ plasmid pSUMO_fliC3 Sau khi điện di trên SDS-PAGE, protein được chuyển lên màng PVDF và ủ với kháng thể đơn dòng kháng His-tag (mouse IgG, Acris Antibodies), sau đó phát hiện bằng kháng thể anti-mouse IgG gắn peroxidase (Sigma) Cuối cùng, chúng tôi quan sát sự xuất hiện của băng protein SUMO-fliC3 trên màng lai.

Kết quả từ Hình 3.12 cho thấy sự xuất hiện của một vạch băng đậm đúng kích thước ở mẫu đối chứng âm R1-pSUMO (giếng 2) và đối chứng dương (protein HT -49 gắn histidine) (giếng 3) Mẫu protein tổng số (giếng 4) có hai băng tương ứng với protein dung hợp và SUMO Phần dịch hòa tan cũng ghi nhận băng của SUMO, chứng tỏ tế bào đã sản xuất ra protein không dung hợp hoặc protein dung hợp đã bị đứt gãy trước khi tinh sạch Trong pha không tan (giếng 6), xuất hiện vạch băng tương ứng với protein SUMO-fliC (khoảng 50 kDa), trong khi pha tan (giếng 5) chỉ có băng của SUMO mà không có protein dung hợp Điều này cho thấy protein dung hợp có tính tan rất kém, khác với protein SUMO, là cơ sở để tiền xử lý tinh sạch thu hỗn hợp có tỷ lệ protein dung hợp cao Sau khi tinh sạch, phần protein flagellin (giếng 7) hiển thị một băng duy nhất rõ nét, kích thước khoảng 50 kDa, xác nhận rằng quá trình tinh sạch đã giữ ổn định sản phẩm protein FliC dung hợp.

Hình 3.12: Xác định fliC bằng Western blot Giếng 1: Rosetta 1;

Giếng 6: fliC 3 pha không tan,

Vạch băng sản phẩm protein tái tổ hợp trùng với kích thước dự đoán và xác định được protein SUMO-fliC tồn tại chủ yếu ở pha không tan

Kết quả phân tích Western blot cho thấy hệ biểu hiện protein dung hợp SUMO_FliC hoạt động hiệu quả, sản xuất protein với kích thước đúng thiết kế và tồn tại dưới dạng thể vùi không tan, thuận lợi cho việc thu nhận và tiền tinh sạch Tuy nhiên, cần sàng lọc tế bào để nâng cao hiệu suất sản xuất protein dung hợp và tối ưu hóa quá trình thu dịch chiết thô nhằm bảo đảm cấu trúc sản phẩm Protein FliC dung hợp có cấu trúc bền vững và ổn định trong quá trình tinh sạch trên cột Niken agarose.

3.3.4 Giải trình tự axit amin và dự đoán cấu trúc của flagellin tái tổ hợp

Từ kết quả giải trình tự đoạn gen flic 3, chúng tôi xác định đƣợc trình tự axit samin của protein flagellin nhƣ Hình 3 13

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQ AIANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQAT NGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAN DGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNSPGISGGGGGILDSMGTLINEDAAAAK KSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNTVTNLNSARSRIE DADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

Hình 3 13: Trình tự acid amin tương ứng gen fliC 3 tự nhiên

Protein flagellin tái tổ hợp đã được phân tích trình tự axit amin thông qua phương pháp LC-MS/MS, với kết quả được trình bày ở Hình 3.14 Phân tích cho thấy flagellin tái tổ hợp được tổng hợp đúng khung đọc mở.

Để dự đoán cấu trúc và hoạt tính sinh học của flagellin tái tổ hợp từ gen fliC, đoạn trình tự axit amin của protein tái tổ hợp đã được đọc ngẫu nhiên.

3, chúng tôi sử dụng chương trình PHYRE2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2)

Kết quả protein flagellin tái tổ hợp có cấu trúc tương tự flagellin tự nhiên (phần D2 và D3 đã bị loại bỏ) (Hình 3.15)

Hình 3.15: So sánh cấu trúc 3D dự đoán của protein flagellin tái tổ hợp với cấu trúc flagellin tự nhiên

Kết quả giải trình tự ADN gen fliC 3 và protein flagellin tái tổ hợp cho thấy không có sự khác biệt giữa sản phẩm thiết kế và cấu trúc tự nhiên Việc duy trì cấu trúc không gian tương tự với flagellin tự nhiên cho thấy protein flagellin tái tổ hợp có khả năng cao để có được hoạt tính sinh học như protein tự nhiên Điều này là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học của chế phẩm từ flagellin trên mô hình động vật thực nghiệm.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:

1 Thiết kế thành công đoạn gen fliC 3 cải biến mã hóa flagellin tái tổ hợp trong E.coli DH5α

2 Biểu hiện thành công gen fliC cải biến tái tổ hợp trong tế bào E.coli

3 Tối ƣu đƣợc một số điều kiện lên men cho dòng tế bào R1_SUMO_fliC 3 ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protein flagellin tái tổ hợp như sau:

- Môi trường sử dụng LB

- Nồng độ chất cảm ứng IPTG sử dụng là 0,5mM

- Thời gian thu mẫu sau cảm ứng là 3 giờ

4 Tinh sạch thành công protein SUMO-fliC 3 bằng sắc ký ái lực với hiệu suất thu hồi protein đạt 45,7%, độ tin cậy lớn hơn 95%

5 Kết quả giải trình tự, cấu trúc protein flagellin tái tổ hợp từ gen fliC 3 tương đồng với trình tự, cấu trúc protein flagellin tái tổ hợp dự đoán

Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm:

- Sàng lọc, lựa chọn các dòng tế bào có hiệu suất sản xuất protein flagellin tái tổ hợp cao

- Tạo sản phẩm flagellin tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu làm dƣợc phẩm

- Đánh giá hoạt tính sinh học của flagellin tái tổ hợp