ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
2.1.1 Động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm trong nghiên cứu là chuột Swiss 5 tuần tuổi (từ Viện
Nghiên cứu này sẽ sử dụng chuột được nuôi trong lồng với chu kỳ sáng-tối 12 giờ, trong điều kiện nhiệt độ ổn định 24 oC +/- 3 oC và độ ẩm 55% Thức ăn và nước được cung cấp định kỳ hai ngày một lần.
Tế bào ung thư 3LL, được cung cấp bởi ATCC (Hoa Kỳ), và tế bào da HaCaT, được nhận từ GS.TS.BS Masashi Kato thuộc khoa Y dược, Đại học Nagoya, Nhật Bản, là hai loại tế bào quan trọng trong nghiên cứu y học.
2.1.3 Hạt nano-melanin bọc polyme
Nano-melanin được tổng hợp theo phương pháp hóa học và phân tích tính chất tại Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu này được liệt kê dưới Bảng 1
Bảng 1: Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu
STT Tên hóa chất Xuất xứ
2 Formalin 10%, xylen, PBS, thuốc nhuộm hematoxylin/ eosin Trung Quốc
Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê ở Bảng 2
Bảng 2: Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Máy chiếu tia X (Presise Digital Accelerator
2 Máy ly tâm 5014 Eppendort (Đức)
3 Máy phân tích huyết học Unicel DxH 600 Beckman Coulter (Mỹ)
4 Máy xét nghiệm Cobas 6000 Roche (Thụy Sỹ)
5 Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản)
6 Ống xét nghiệm chứa EDTA, Heparin Việt Nam
7 Pipet, ống eppendort, đầu côn Eppendort (Đức)
Các phương pháp, kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư
Cancer cells are cultured in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) or RPMI with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin, incubated at 37°C in a controlled environment with 5% CO2.
2.3.2 Phương pháp tạo khối u trên chuột thí nghiệm
Nuôi chuột ổn định trong 1 tuần, khối lượng tăng lên khoảng 25-39 gram
Tiến hành chia chuột thành 4 nhóm, mỗi nhóm 5 con, bao gồm:
Nhóm 1 (ký hiệu NIL): chuột hoàn toàn khỏe mạnh, không gây u cũng như chiếu xạ
Nhóm 2 (ký hiệu NC): chuột được gây u nhưng không chiếu xạ
Nhóm 3 (ký hiệu IR): chuột được gây u và chiếu xạ
Nhóm 4 (ký hiệu IR+MEL) là nhóm chuột được gây u và bổ sung melanin trước và sau khi chiếu xạ Theo các nghiên cứu trước, nồng độ nano-melanin an toàn cho mỗi lần tiêm là 0,2 mL.
Ba nhóm chuột được gây u bằng cách tiêm dung dịch tế bào ung thư 3LL dưới da để quan sát sự hình thành khối u Khi khối u đạt kích thước thích hợp, các nhóm IR và IR+MEL sẽ được chiếu xạ Trong suốt quá trình điều trị, trọng lượng và kích thước khối u của chuột sẽ được đo lường thường xuyên mỗi 3 ngày Sau khi điều trị, chuột sẽ được thu mẫu khối u, mô xung quanh khối u và thu máu để thực hiện các thí nghiệm phân tích mô học cùng với các chỉ tiêu hóa sinh và huyết học.
2.3.3 Phương pháp chiếu xạ điều trị khối u trên chuột
Chuột sẽ được chiếu xạ tại Bệnh viện Quân y 103 bằng tia gamma với thời gian phù hợp để đạt được các liều lượng chiếu xạ mong muốn Các liều lượng dự kiến bao gồm 4, 6 và 8 Gray (Gy) với tốc độ chiếu xạ là 1,0 Gy/phút.
2.3.4 Thu mẫu các bộ phận trên chuột Đầu tiên, chọn đúng con chuột cần thu mẫu Lấy mẫu máu tĩnh mạch mạch đuôi bằng cách sử dụng kim 23G để chọc ven và máu được thu thập bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim Trong trường hợp gặp khó khăn, có thể mở 0,5 đến 1 cm bề mặt da tại vị trí tĩnh mạch, chích tĩnh mạch cho chảy máu và thu thập máu bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim Lưu ý không cọ xát đuôi từ gốc đến ngọn thì vì nó sẽ dần đến tăng bạch cầu Nếu không nhìn thấy tĩnh mạch, có thể nhúng đuôi vào nước ấm (40 o C) Ống nghiệm chứa EDTA dùng để xét nghiệm huyết học, ống nghiệm chứa heparin dùng để xét nghiệm hóa sinh Lắc đều sau khi lấy mẫu để tránh làm đông mẫu máu
Đầu tiên, cố định chuột bằng chân ghim trên khay mổ và đặt chuột nằm ngửa Sau đó, nhẹ nhàng cắt lớp da ở phần bụng để lộ bên trong, dùng pank kéo lớp da sang hai bên và cố định bằng ghim Tiếp theo, xác định vị trí hạch và khối u, dùng kéo cắt chúng ra khỏi lớp da và thu vào dung dịch PBS Tiếp tục cắt dọc theo lớp cơ và xương lồng ngực, nhẹ nhàng kéo tim và phổi lên để lộ tuyến ức, sau đó thu lấy tuyến ức Cuối cùng, xác định gan, lách, thận gần khu vực ruột và thu mẫu, sau đó cân các mẫu gan, lách và khối u để xác định khối lượng.
Cuối cùng bảo quản các mẫu vừa thu được trong formalin để sử dụng cho các thí nghiệm trong tương lai
2.3.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học và hóa sinh
Các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết sắc tố, thể tích khối hồng cầu và tỷ lệ tế bào lympho được phân tích bằng máy huyết học Unicel DxH 600 Ngoài ra, các chỉ tiêu hóa sinh như ALT, AST, ure và creatinin được kiểm tra trên hệ thống máy xét nghiệm cobas 6000 tại Phòng xét nghiệm của Bệnh viện Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3.6 Phương pháp phân tích mô học
Mẫu khối u và mô lành được thu thập, cố định trong formalin 10%, sau đó loại bỏ canxi bằng axit formic 5% và cố định trong parafin Mô sau đó được cắt lát, gắn trên phiến thủy tinh, khử parafin bằng xylen và rửa bằng cồn với nồng độ tăng dần (70% - 80% - 90% - 99.9%) Cuối cùng, mẫu được nhuộm bằng hematoxylin/eosin để tạo tiêu bản mô và quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi nhằm đánh giá mức độ phá hủy mô do tia xạ.
2.3.7 Phương pháp phân tích thống kê
Kết quả từ ba lần thí nghiệm lặp lại trong mỗi nhóm sẽ được phân tích thống kê bằng phương pháp Student t-test Phần mềm SPSS (phiên bản 18, SPSS Japan Inc.) sẽ được sử dụng cho các phân tích này, với mức ý nghĩa được xác định khi giá trị p < 0,05.
KẾT QUẢ
Tạo khối u trên mô hình chuột
Sau khi thu thập mẫu khối u, một phần sẽ được gửi đi phân tích tại Bệnh viện Quân y 103, trong khi phần còn lại được bảo quản cho các nghiên cứu trong tương lai.
Kết quả được trình bày tại các hình dưới đây:
Hình 5: Mẫu u của nhóm NC và IR
Tổ chức khối u nhóm NC ở độ phóng đại 1X (5A) và 4X (5B)
Tổ chức khối u nhóm IR ở độ phóng đại 1X (5C) và 4X (5D)
Kết quả phân tích mô u cho thấy cả hai nhóm chuột đều có chẩn đoán giống nhau, với u gồm các đám tế bào biểu mô có nhân không đều, tăng sắc và chất nhân thô, cùng nhiều nhân chia bất thường Ngoài ra, u còn có các ổ hoại tử lớn nhỏ xen kẽ giữa các đám tế bào Do đó, hai mẫu u mắc dạng ung thư biểu mô có hình ảnh mô u tương tự, chỉ khác nhau về kích thước của khối u.
Đánh giá sự thay đổi trước và sau khi chiếu xạ trên mô hình chuột
3.2.1 Khối lượng trung bình chuột các nhóm và thể tích trung bình khối u trước và sau khi xạ trị
Thời gian thí nghiệm được tính ngày đầu tiên chính là ngày 3 nhóm chuột
NC, IR và IR+MEL được gây u bằng cách tiêm dưới da dòng tế bào ung thư 3LL vào vùng lưng Sau khoảng 10 ngày, khi thể tích trung bình các khối u đạt khoảng 500 mm³, nhóm IR và IR+MEL được chiếu xạ với cường độ 1 gray/phút, tổng liều chiếu là 6 gray Kết quả cho thấy sự khác biệt trong hiệu quả điều trị giữa các nhóm.
Khối lượng trung bình các nhóm chuột
Chuột được nuôi và cân định kỳ mỗi 3 ngày, với khối lượng trung bình của các nhóm chuột được tính toán và trình bày trong bảng 3 Sự khác biệt về khối lượng giữa 4 nhóm chuột được thể hiện rõ hơn qua biểu đồ trong hình 6.
Bảng 3: Khối lượng trung bình các nhóm chuột
Hình 6: Biểu đồ biểu diễn khối lượng trung bình các nhóm chuột
Sau 25 ngày thí nghiệm, sự khác biệt rõ rệt giữa bốn nhóm chuột đã được ghi nhận Nhóm chuột khỏe mạnh (NIL) không mang u và không xạ trị có khối lượng trung bình đạt khoảng 51 gram, vượt trội hơn so với ba nhóm còn lại Nhóm gây u không xạ trị (NC) có khối lượng trung bình khoảng 44 gram, trong khi nhóm được bổ sung melanin trước khi xạ trị (IR+MEL) chỉ đạt 38 gram Đặc biệt, nhóm gây u và được xạ trị (IR) có khối lượng trung bình thấp nhất, chỉ còn 35 gram Cụ thể, khối lượng trung bình của nhóm NC là khoảng 86% so với nhóm NIL, nhóm IR đạt 69% và nhóm IR+MEL đạt 74% so với nhóm NIL.
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc gây u và xạ trị đều ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tăng trưởng và phát triển của chuột, đặc biệt khi hai yếu tố này kết hợp với nhau, gây cản trở mạnh mẽ hơn Xạ trị đã chứng minh là một yếu tố quan trọng làm giảm khả năng phát triển của chuột.
Nghiên cứu cho thấy chuột là mô hình lý tưởng để nghiên cứu tác dụng phụ của xạ trị, vì tia xạ không chỉ tiêu diệt tế bào ung thư mà còn gây hại cho tế bào và mô lành Việc chiếu xạ toàn thân trên chuột giúp làm nổi bật rõ ràng hơn tác động của tia xạ so với chiếu xạ cục bộ ở con người Đặc biệt, việc bổ sung melanin trước khi chiếu xạ đã cải thiện khả năng tăng trưởng của chuột, cho thấy melanin có tác dụng tích cực trong điều trị xạ trị.
Thể tích khối u các nhóm trước và sau khi xạ trị
Thể tích khối u là một chỉ số quan trọng để đánh giá hiệu quả của liệu pháp xạ trị, giúp giảm kích thước khối u mà không cần phẫu thuật hay hóa chất, tránh được sự đau đớn về thể xác Dưới đây là bảng kết quả thể tích trung bình khối u giữa các nhóm chuột.
Bảng 4: Thể tích trung bình khối u các nhóm chuột
Thể tích trung bình khối u trước và sau khi xạ trị của các nhóm chuột ở bảng 4 được trình bày rõ ràng hơn dưới dạng biểu đồ (hình 7)
Hình 7: Thể tích trung bình khối u trước và sau khi xạ trị
(sai số được tính theo SD với mức ý nghĩa 95%)
Vào ngày thứ 10, khi thể tích khối u chuột đạt khoảng 500 mm³, nhóm IR và nhóm IR+MEL đã được xạ trị Kết quả cho thấy, sau 5 ngày, tức ngày thứ 15, thể tích khối u của hai nhóm này bắt đầu giảm Trong khi thể tích khối u của nhóm NC tiếp tục tăng và đạt đỉnh 1300 mm³ vào ngày 25, nhóm IR đã giảm đáng kể còn khoảng 250 mm³ và nhóm IR+MEL còn khoảng 210 mm³ Cụ thể, thể tích khối u của nhóm IR chỉ còn 19% so với nhóm NC, trong khi nhóm IR+MEL chỉ còn 16% so với nhóm NC.
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung melanin trước khi xạ trị mang lại hiệu quả rõ rệt, vượt trội hơn so với phương pháp xạ trị thông thường, khi làm giảm đáng kể thể tích khối u ở chuột, chính là tác dụng chính của xạ trị.
3.2.2 Đánh giá sự thay đổi của chỉ số huyết học sau khi chiếu xạ
Mẫu máu chuột cần được đưa ngay đi xét nghiệm sau khi thu vào ống chống đông để đảm bảo không bị hư hỏng Kết quả xét nghiệm sẽ được trình bày trong bảng 5 dưới đây.
Bảng 5: Kết quả xét nghiệm công thức máu các nhóm chuột
Thông số Đơn vị Nhóm NIL Nhóm NC Nhóm IR Nhóm
Kết quả xét nghiệm huyết học cho thấy các chỉ số RBC, HGB và HCT ở nhóm chuột NC và IR đều giảm nhẹ Cụ thể, so với nhóm NIL, số lượng hồng cầu của nhóm NC đạt 87%, nhóm IR là 71%, và nhóm IR+MEL là 68% Sự khác biệt giữa nhóm IR (5,48 ± 1,09) và nhóm IR+MEL (5,21 ± 0,68) là không đáng kể (-4,9%) và không có ý nghĩa thống kê Tương tự, số lượng huyết sắc tố của nhóm NC đạt 97%.
Tỷ lệ huyết sắc tố trong nhóm IR đạt 76%, trong khi nhóm IR+MEL là 71% Mặc dù có sự chênh lệch nhỏ về nồng độ huyết sắc tố giữa hai nhóm (8,34 ± 0,65 ở nhóm IR và 7,77 ± 0,69 ở nhóm IR+MEL), nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê.
Kết quả cho thấy, thể tích khối cầu của nhóm NC, IR và IR+MEL lần lượt đạt 96%, 73% và 67% so với nhóm NIL, chỉ ra rằng xạ trị hoàn toàn có tác động đến các chỉ số máu Đối với hai chỉ số hồng cầu và nồng độ huyết sắc tố, sự khác biệt về thể tích khối cầu giữa nhóm IR (24,94 ± 2,05) và nhóm IR+MEL (23,1 ± 1,21) là không lớn (-8%) và không có ý nghĩa thống kê.
Trong nghiên cứu, nhóm IR cho thấy sự giảm mạnh về số lượng bạch cầu và tiểu cầu, chỉ đạt 11% và 23% so với nhóm NIL, điều này tương ứng với kích thước lách của nhóm IR giảm đáng kể, chỉ còn khoảng 17% so với nhóm NIL Đặc biệt, số lượng bạch cầu trong nhóm IR+MEL đạt 0,7 ± 0,22, tăng 55,5% so với nhóm IR (0,45 ± 0,10), và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê rõ rệt.
Khối lượng trung bình lách của các nhóm chuột cho thấy rằng tiểu cầu trong hai nhóm IR và IR+MEL đều giảm so với nhóm đối chứng Tuy nhiên, nồng độ tiểu cầu của nhóm IR+MEL (218,7 ± 23,0) cao hơn nồng độ tiểu cầu của nhóm IR (178,14 ± 62,5) với sự chênh lệch là +23%.
Tỉ lệ bạch cầu lympho trong nhóm IR+MEL đạt 60,9 ± 3,15, cao hơn 8,8% so với nhóm IR với tỉ lệ 55,96 ± 3,82, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê.
Đánh giá mô học các mẫu mô lân cận
3.3.1 Kết quả về mô lách
Lách đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch và rất nhạy cảm với tổn thương do bức xạ Những thay đổi mô bệnh học ở lách có thể được sử dụng để theo dõi tổn thương trong hệ thống tạo máu Dưới đây là hình ảnh minh họa sự khác biệt về mô lách giữa các nhóm chuột nghiên cứu.
Hình 12: Mẫu lách của nhóm NIL và NC
Mẫu lách của nhóm NIL ở độ phóng đại 1X (12A) và 4X (12B) Mẫu lách của nhóm NC ở độ phóng đại 1X (12C) và 4X (12D)
Hình ảnh vi thể của mẫu lách nhóm NIL cho thấy tủy đỏ với các xoang mạch sung huyết và nhiều nguyên mẫu tiểu cầu, trong khi tủy trắng có các tiểu thể Malpighi với tế bào lympho vây quanh động mạch bút lông Điều này dẫn đến chẩn đoán giải phẫu bệnh là sung huyết mô lách.
Chẩn đoán giải phẫu bệnh cho hình ảnh vi thể của nhóm NC cho thấy hiện tượng sung huyết mô lách Mô lách bao gồm các tủy đỏ và các xoang mạch bị sung huyết.
Tủy trắng chứa các tiểu thể Malpighi nhỏ với tế bào lympho bao quanh động mạch bút lông Sự suy giảm tế bào lympho và sự gia tăng tế bào võng mạc đã được ghi nhận Những quan sát này nhất quán với các phát hiện từ các nghiên cứu trước đây.
Phơi nhiễm với bức xạ đã gây ra những thay đổi đáng kể ở lá lách của chuột sau khi chiếu xạ Hình ảnh mô lách của hai nhóm IR và IR+MEL cho thấy sự khác biệt rõ rệt sau quá trình này.
Hình 13: Mẫu lách của nhóm IR và IR+MEL
Mẫu lách của nhóm IR ở độ phóng đại 1X (13A) và 4X (13B)
Mẫu lách của nhóm IR+MEL ở độ phóng đại 1X và 4X cho thấy sau khi gây u và chiếu xạ, mô lách có các tủy đỏ với xoang mạch sung huyết, xuất huyết mạnh, và nguyên mẫu tiểu cầu Tủy trắng xuất hiện ít tiểu thể Malpighi nhỏ với tế bào lympho quanh động mạch bút lông Hệ thống võng nội mô tăng sinh mạnh các tế bào sợi, và mẫu tiêu bản được chẩn đoán là sung huyết, xuất huyết và xơ hóa mô lách.
Hình ảnh vi thể của mẫu lách nhóm IR+MEL cho thấy mô lách sung huyết và xơ hóa nhẹ hơn so với nhóm IR Mô lách ở nhóm này có tủy đỏ với các xoang mạch sung huyết mạnh và số lượng nguyên mẫu tiểu cầu nhiều hơn Tủy trắng chứa các tiểu thể Malpighi với tế bào lympho bao quanh động mạch bút lông, trong khi hệ thống võng nội mô cũng cho thấy sự tăng sinh tế bào sợi.
Nhìn chung, chuột trong nhóm không gây u và không điều trị phát triển bình thường, trong khi nhóm gây u và không điều trị cho thấy khối u phát triển và di căn sang vùng lân cận Tuy nhiên, khi được xạ trị, tổn thương không còn xuất hiện, và tổ chức giữa hai nhóm IR và IR+MEL đều bị xơ hóa, nhưng mức độ xơ hóa ở nhóm IR+MEL nhẹ hơn Điều này cho thấy tác dụng tích cực của xạ trị trong việc tiêu diệt tế bào ung thư Thêm vào đó, việc tiêm melanin trước khi xạ trị giúp giảm xơ hóa mô lách hiệu quả hơn, đồng thời thúc đẩy quá trình hồi phục nhanh chóng so với xạ trị thông thường.
Tia xạ ảnh hưởng tiêu cực đến hệ miễn dịch, dẫn đến giảm số lượng bạch cầu và thay đổi số lượng tiểu cầu ở lá lách, cũng như giảm hồng cầu và huyết sắc tố, gây ra tình trạng thiếu máu Sự giảm tiểu cầu ảnh hưởng đến khả năng tạo cục máu đông Tuy nhiên, việc bổ sung melanin có thể bảo vệ bạch cầu, bảo vệ lá lách và duy trì các mô tạo máu, giúp chống lại tác động của bức xạ.
43 nào chứng minh được rằng melanin hoạt động như một chất bảo vệ bức xạ và điều hòa miễn dịch
3.3.2 Kết quả về hạch lympho
Hạch lympho là các cơ quan bạch huyết nhỏ nằm dọc theo các mạch bạch huyết, có chức năng giữ lại những chất lạ và tế bào có hại trong bạch huyết Sau khi được lọc qua hạch lympho, bạch huyết sẽ được làm sạch trước khi trở lại tuần hoàn máu.
Từ các mẫu tiêu bản mô hạch lympho, nhóm NIL không gây u và có cấu trúc hạch rõ ràng với vùng vỏ chứa các nang lympho lớn và tâm mầm rộng, cùng với các xoang nang giãn rộng chứa nhiều đại thực bào Trong khi đó, nhóm NC cho thấy cấu trúc hạch tương tự nhưng có dấu hiệu tăng sản, đặc biệt là sự phát triển tại chỗ của khối u và di căn vào tổ chức mô.
Hình 14: Mẫu hạch lympho của nhóm NIL và NC
Mẫu hạch lympho của nhóm NIL ở độ phóng đại 1X (14A) và 4X (14B) Mẫu hạch lympho của nhóm NC ở độ phóng đại 1X (14C) và 4X (14D)
Cấu trúc hạch lympho ở hai nhóm IR và IR+MEL không có các nang lympho, với các tế bào lympho nhỏ và đồng đều Các xoang nang giãn rộng và chứa nhiều đại thực bào, cho thấy đặc điểm của hạch lympho nguyên thủy.
Hình 15: Mẫu hạch lympho của nhóm IR và IR+MEL
Mẫu hạch lympho của nhóm IR ở độ phóng đại 1X (15A) và 4X (15B)
Mẫu hạch lympho của nhóm IR+MEL ở độ phóng đại 1X (15C) và 4X (15D)
Các mẫu tiêu bản mô hạch lympho cho thấy nhóm NIL không gây u, với cấu trúc hạch rõ ràng và các nang lympho lớn, trong khi nhóm NC thể hiện sự phát triển tại chỗ của khối u và di căn vào mô do không được điều trị bằng xạ trị Việc sử dụng tia xạ trong nhóm IR và IR+MEL có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư.
Trong điều trị ung thư, việc sử dụng melanin trước khi xạ trị vẫn chưa cho thấy lợi ích rõ ràng hơn, mặc dù 46 thương đã không còn và không có di căn hạch.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Xạ trị bằng tia X hiệu quả trong việc tiêu diệt tế bào ung thư và làm giảm kích thước khối u Tuy nhiên, phương pháp này cũng gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn, như giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của chuột, cũng như làm giảm số lượng và tỷ lệ một số thành phần quan trọng trong máu, bao gồm bạch cầu, tiểu cầu và tế bào lympho.