Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đảng sâm (codonopsis javanica ( blume) hook f thomson

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Tổng quan về cây Đảng sâm

Theo hệ thống thực vật [6] Đảng sâm được phân loại như sau:

Loài Đảng sâm (Codonopsis javanica) mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, đặc biệt là Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng và Lạng Sơn Ở miền Nam, loài này chỉ tập trung tại cao nguyên Langbian (Lâm Đồng) và xung quanh chân núi Ngọc Linh thuộc các huyện Đắc Glây, Tu Mơ Rông (Kon Tum) và Quảng Nam - Đà Nẵng Tại Kon Tum, Đảng sâm chủ yếu phân bố ở vùng Ngọc Linh.

2.1.1 Đặc điểm hình thái Đảng sâm là loài cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn Rễ hình tru dài, đường kính có thể đạt 1,5-2cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi của thân củ, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khô thì rễ có màu vàng, có nếp nhăn Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, màu xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung,

Cây có mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông, kích thước dài 3-8cm và rộng 2-4cm Hoa có màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá với cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông gồm 5 phiến hẹp và 5 cánh có vân màu tím ở họng Khi hoa gần rụng, cánh hoa chuyển sang màu vàng nhạt và chia làm 5 thùy Nhụy hoa có 5 nhụy, chỉ nghụy hơi dẹt và bao phấn gắn ở gốc Quả hình chùy tròn, có 3 tâm bì, đầu hơi bằng và có đài ngắn, khi chín sẽ nứt ra, bên trong chứa nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng.

Rễ hình trụ tròn hơi uốn cong, dài 10 – 35 cm, đường kính 0,4 – 2 cm

Rễ có màu vàng nhạt đến vàng xám nâu, với vết lõm tròn ở phía trên và nhiều nếp vân ngang ở đoạn dưới Bề mặt rễ có nhiều nếp nhăn dọc và bì khổng rải rác Rễ dẻo, mặt cắt không bằng phẳng, với phần vỏ màu vàng nhạt và phần lõi màu trắng ngà Rễ tỏa ra mùi thơm dịu và có vị ngọt.

Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

2.1.2 Giá trị của Đảng sâm Đảng sâm là một loại thuốc bổ khí thông dụng, là đầu vị của hầu hết các bài thuốc bổ khí huyết, bổ tỳ vị, chữa bệnh mạn tính, suy nhược cơ thể, thích nghi với mọi lứa tuổi, giới tính Ðảng sâm với liều cao có thể dùng thay thế nhân sâm, nên người ta thường ví đảng sâm là “nhân sâm của người nghèo” Theo kinh nghiệm sử dụng trong nhiều năm qua, dược liệu đảng sâm của ta hoàn toàn có khả năng thay thế được đảng sâm Trung Quốc, vừa hiệu quả, vừa an toàn hơn rất nhiều [3]

Đảng sâm có thể được sử dụng thay thế cho Nhân sâm khi thiếu, hoặc kết hợp với Nhân sâm trong các trường hợp như tỳ hư, ăn uống kém, mệt mỏi, phế hư do phiền khát, thiếu máu, vàng da, phù chân, và tiểu đục Loại thảo dược này có thể dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác trong các bài thuốc như Tứ Quân Tử Thang, Thập Toàn Đại Bổ Thang, và Bát Vị Địa Hoàng Hoàn.

Cây đảng sâm không chỉ có giá trị kinh tế cao mà còn đáp ứng nhu cầu lớn về số lượng Với địa bàn phân bố rộng và thời gian thu hoạch chỉ từ 18-20 tháng, cây này rất thích hợp để trồng đại trà hoặc xen canh cùng các loại cây khác như cây ngô trên nương rẫy, góp phần tăng thu nhập và xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi.

Nhu cầu về đảng sâm trong thị trường dược liệu Việt Nam hiện rất cao, ước tính khoảng 1.000 tấn mỗi năm, chiếm khoảng 2% tổng lượng tiêu thụ Hơn 95% đảng sâm được sử dụng đều nhập khẩu từ Trung Quốc qua đường tiểu ngạch, dẫn đến khó khăn trong việc quản lý giá cả và chất lượng Các loại đảng sâm Trung Quốc thường có độ ẩm cao và có thể chứa chất bảo quản không rõ nguồn gốc Trong 2-3 năm qua, giá đảng sâm Trung Quốc đã tăng gấp 4-5 lần, khiến nhiều bệnh viện gặp khó khăn trong việc cung ứng cho bệnh nhân.

Ngành dược liệu cần quy hoạch vùng trồng và xây dựng quy trình nhân giống, kỹ thuật nuôi trồng và sơ chế dược liệu Việc phối hợp với các địa phương để vận động người dân và doanh nghiệp mở rộng sản xuất Đảng sâm là rất quan trọng, nhằm phát triển cây này thành hàng hóa địa phương Điều này sẽ góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng và tăng thu nhập cho người dân.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình trồng và phát triển các tế bào thực vật trong môi trường nhân tạo, đảm bảo điều kiện vô trùng Quá trình này bao gồm việc sử dụng nguyên liệu thực vật để tạo ra các mô mới, phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất cây trồng.

Nhân giống in vitro, hay vi nhân giống, là phương pháp ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận nhỏ khác nhau của cây.

Các nhà vi nhân giống thường sử dụng thuật ngữ nuôi cấy mô và nhân giống in vitro để chỉ các phương pháp nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau.

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật, khi mỗi tế bào đều chứa toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể Trong điều kiện thích hợp, bất kỳ tế bào nào cũng có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Tính toàn năng này là cơ sở khoa học cho phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, và hiện nay, đã có khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào đơn lẻ.

Cơ thể thực vật là một hệ thống thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan chức năng được hình thành từ các loại tế bào khác nhau Tất cả các tế bào này đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên, gọi là tế bào hợp tử Trong giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia để tạo ra nhiều tế bào phôi sinh, những tế bào này chưa có chức năng chuyên biệt Sau đó, các tế bào này sẽ phát triển và chuyên hóa thành các loại tế bào khác nhau, hình thành nên các cơ quan chức năng của thực vật.

Ket-noi.com cung cấp tài liệu miễn phí về phôi sinh, nơi các tế bào này được chuyển đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô và cơ quan với chức năng khác nhau.

Sự phân hóa tế bào là quá trình chuyển đổi các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo thực hiện các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình này rất quan trọng trong sự phát triển và duy trì các chức năng sinh lý của cơ thể.

Tế bào phôi sinh trải qua quá trình dãn và phân hóa thành các tế bào chuyên biệt với chức năng riêng Tuy nhiên, các tế bào này vẫn giữ khả năng biến đổi; trong điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình này được gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.

Sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa và ức chế các gen trong sự phát triển của cá thể Trong một giai đoạn nhất định, một số gen được kích hoạt để tạo ra tính trạng mới, trong khi một số gen khác bị ngừng hoạt động Quá trình này được mã hóa trong ADN của tế bào, giúp duy trì sự hài hòa trong sinh trưởng và phát triển của thực vật Ngoài ra, các tế bào trong một khối mô thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh; việc tách rời các tế bào hoặc giảm kích thước khối mô sẽ thúc đẩy sự hoạt hóa các gen trong tế bào.

2.2.3 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro

Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1 của quy trình nhân giống in vitro là chuẩn bị vật liệu, đóng vai trò quyết định cho toàn bộ quy trình Mục tiêu chính là tạo ra nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Để đạt được điều này, có thể sử dụng một số chất diệt khuẩn như CaOCl2, NaOCl, và HgCl2 để vô trùng mẫu nuôi cấy.

Mẫu đưa từ bên ngoài vào cần đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Các vật liệu thường được chọn để nuôi cấy bao gồm đỉnh sinh trưởng, chồi nách và đoạn thân.

Giai đoạn 2:Tái sinh mẫu nuôi cấy

Giai đoạn khử trùng mẫu để nuôi cấy in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo tỉ lệ nhiễm thấp và tỉ lệ sống cao, đồng thời giúp mô tồn tại và sinh trưởng tốt Mục tiêu chính của giai đoạn này là định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy thông qua việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy.

Giai đoạn 3:Giai đoạn nhân nhanh chồi

Giai đoạn kích thích mô nuôi cấy là bước quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và phôi vô tính, nhằm đạt được hệ số cao nhất Để tối ưu hóa kết quả, các chất điều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, cùng với các chất bổ sung khác như nước dừa và dịch chiết nấm mem Ngoài ra, các yếu tố như ánh sáng và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng, với chế độ nuôi cấy lý tưởng ở nhiệt độ 23-27ºC, 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày và cường độ ánh sáng từ 2000-4000 lux Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, có thể áp dụng các phương pháp kích thích khác nhau để tăng nhanh sự phát triển.

Ket-noi.com cung cấp tài liệu miễn phí để phát triển các cụm chồi, kích thích sự hình thành chồi nách và tạo ra cây từ phôi vô tính.

Giai đoạn 4:Giai đoạn ra rễ cho mẫu

Khi các chồi đạt kích thước nhất định, chúng sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ Sau khoảng 2 - 3 tuần, các chồi này sẽ hình thành rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Trong giai đoạn này, các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin, như IAA, IBA, NAA và 2,4-D, được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát triển của rễ phụ từ mô nuôi cấy.

Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chất auxin tự nhiên phổ biến trong thực vật là indol axetic acid (IAA), có tác dụng kích thích sinh trưởng tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4-Diclorophenoxy acid (2,4 D) cũng là những dẫn xuất quan trọng, hỗ trợ trong sự phân chia mô và hình thành rễ NAA, một auxin nhân tạo, không chỉ tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy mà còn nâng cao hoạt tính enzym, ảnh hưởng đến trao đổi chất của nitơ và cải thiện khả năng tiếp nhận đường trong môi trường Với hoạt tính mạnh hơn IAA, NAA đóng vai trò thiết yếu trong phân chia tế bào và tạo rễ.

Auxin là hormone thực vật được tổng hợp chủ yếu ở các mô non, đặc biệt là ở lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những khu vực này, auxin sẽ được vận chuyển xuống các phần phía dưới của cây.

Cytokinin là một loại hormone thực vật có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phân chia tế bào, với các dạng phổ biến như kinetin và 6-Benzyl aminopurin (BA) Kinetin, được phát hiện bởi Skoog trong chiết xuất acid nucleic, là một dẫn xuất của adenine Trong khi đó, BA là cytokinin tổng hợp có hoạt tính mạnh hơn kinetin Cả kinetin và BA đều kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm chậm quá trình lão hóa tế bào Ngoài ra, chúng còn ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của một số enzyme Cơ chế tác dụng của auxin tại cấp độ phân tử liên quan đến sự tương tác của cytokinin với nucleoprotein, làm yếu mối liên kết giữa histone và ADN, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp ADN.

Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) chỉ ra rằng các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh không hoạt động độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Sự phân chia, phân hoá và biệt hoá tế bào được điều khiển bởi sự tương tác giữa các hoocmon này Auxin và cytokinin phối hợp với nhau có vai trò quyết định trong sự phát triển và hình thái tế bào, với tỷ lệ auxin/cytokinin cao thúc đẩy hình thành rễ, trong khi tỷ lệ thấp lại hỗ trợ quá trình phát sinh chồi Tỷ lệ cân bằng giữa chúng thuận lợi cho sự phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng sự kết hợp đồng thời của auxin và cytokinin kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN và phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972), auxin kích thích giai đoạn đầu của quá trình phân bào.

Ket-noi.com kho tai lieu mien phi tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller

Cytokinin, được phát hiện vào năm 1957, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tế bào, đặc biệt là trong việc điều khiển chuyển pha của mitosis và duy trì sự diễn ra bình thường của quá trình này Hormone này được tổng hợp chủ yếu bởi rễ và hạt đang phát triển.

Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm

Đoàn Trọng Đức và CS (2015) đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn giống cây và phương thức trồng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đảng sâm tại Kon Tum, Việt Nam Kết quả cho thấy việc sử dụng cây nhân giống bằng nuôi cấy mô và củ mang lại hiệu quả cao hơn so với cây giống từ hạt và mầm củ, mở ra khả năng mở rộng vùng nguyên liệu cho cây đảng sâm.

Nguyễn Thùy Dương và CS (2014) đã tiến hành nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình nhân giống in vitro cây Đảng sâm Nghiên cứu tập trung vào tác động của chất khử trùng NaClO 15% và HgCl2 0,1% đối với tỷ lệ sống sót của mẫu chồi Đảng sâm Bên cạnh đó, họ cũng đã khám phá các phương pháp nhân nhanh Đảng sâm từ chồi đỉnh và chồi nách.

Trần Thị Lệ và CS (2013) đã nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây Đảng sâm thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes[8]

Nguyễn Kiều Uyên Vi và nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đối với sự tổng hợp saponin trong cây Đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume)) qua phương pháp nuôi cấy In-Vitro Việc định tính và định lượng saponin được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp cân, nhằm xác định rõ ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo saponin.

Bùi Văn Thắng, Cao Thị Việt Nga, Vùi Văn Kiên, Nguyễn Văn Việt

(2016), nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm (codonopsis javanica ( Blume) Hook f et Thomson) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô [9]

Huỳnh Thị Kim, Nguyễn Thị Điệp, Vương Thị Hồng Loan, Kha Nữ Tú Uyên và Trần Thị An đã tiến hành nghiên cứu quy trình nhân giống in-vitro cây Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume)) Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa các phương pháp nhân giống, góp phần bảo tồn và phát triển giống cây quý hiếm này.

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Giống Đảng sâm thu thập từ huyện Nam Trà My, tỉnh

Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển phương pháp tạo ra vật liệu vô trùng và khả năng tái sinh nhanh chóng cũng như ra rễ của Đảng sâm thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật.

Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Địa điểm tại phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2018 đến tháng 5/2018.

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: Hóa chất khử trùng (cồn, NaClO, HgCl2), môi trường MS cơ bản,

WPM, B5, saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng: BA, Kinetine, α- NAA, IAA

Thiết bị: Máy đo pH, máy khuấy từ, cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2, bếp ga, lò vi song, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, box cấy vô trùng.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

(BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

(NAA, IAA) đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với nồng độ IAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1

- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:

- Mẫu cấy là các đoạn thân, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4 lần bằng nước cất

Để khử trùng mẫu hiệu quả, trước tiên cần làm sạch bụi bẩn và cắt bỏ phần thừa Sau đó, tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° và rửa lại nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ cồn và bụi bẩn còn sót lại trong box cấy Cuối cùng, thực hiện khử trùng bằng dung dịch NaClO 0,5% và HgCl2 0,1%.

- Sử dụng đoạn thân Đảng sâm đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn

Sau khi cấy xong, mẫu được đưa vào phòng nuôi với điều kiện nhiệt độ từ 22 – 25 độ C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm 60 – 65%, và quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối Cần tiến hành theo dõi mẫu bằng cách quan sát bằng mắt thường.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

NaClO 0.5%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm (sau 10 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với mỗi loại hóa chất được bố trí 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần

Thí nghiệm được bố trí như sau:

Hóa chất Công thức Thời gian (phút)

Không sử dụng hóa chất CT1 (Đ/C) 0

Không sử dụng hóa chất CT5(Đ/C) 0

Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 10 ngày các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết

- Phương pháp tái sinh in vitro:

+ Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), B5 (Gamborg ’ s), WPM có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH: 5,6-5,8

Chồi được cấy đều trên bề mặt môi trường và sau đó được đưa vào phòng nuôi cấy với nhiệt độ từ 22-25 độ C, cường độ chiếu sáng 2000-2500 lux, độ ẩm 60-65%, và quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối Việc theo dõi số lượng và chất lượng chồi sẽ được thực hiện bằng mắt thường.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình,

Ket-noi.com kho tai lieu mien phi mỗi bình cấy 5 chồi Mỗi công thức bổ sung thêm: Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH: 5,6-5,8

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi

- Phương pháp nhân nhanh in vitro:

+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từ đoạn thân

Sử dụng chồi sạch bệnh và sinh trưởng tốt với chiều dài từ 0,5-1cm Để đảm bảo an toàn, hãy khử trùng pank trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội trước khi gắp chồi vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.

Cấy chồi lên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều và đưa vào phòng nuôi sau khi hoàn tất Tiến hành theo dõi số lượng và chất lượng chồi thông qua quan sát bằng mắt thường.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 5 chồi

Công thức Nồng độ BA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi

Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8

Nồng độ BA thích hợp cho nhân nhanh chồi Đảng sâm xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp với

Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 chồi Kinetin được bổ sung vào MT nền và A (nồng độ BA thích hợp cho nhân nhanh chồi Đảng sâm xác định ở thí nghiệm 3) với các nồng độ sau:

Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi

- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro

Chọn chồi Đảng sâm có từ 2-3 lá để chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường này được xây dựng dựa trên môi trường MS, với việc bổ sung các nồng độ NAA và IAA khác nhau nhằm kích thích sự hình thành rễ bất định và phát triển cây con hoàn chỉnh.

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 2 chồi

Công thức Nồng độ NAA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Số rễ/cây, chất lượng rễ

Nồng độ NAA thích hợp cho ra rễ của Đảng sâm xác định ở thí nghiệm

5 (ký hiệu B) được sử dụng cho thí nghiệm sau

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA kết hợp với nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 2 chồi Hàm lượng IAA được bổ sung vào MT nền và B (nồng độ NAA thích hợp cho ra rễ của Đảng sâm xác định ở thí nghiệm 5) với các nồng độ sau:

Công thức Nồng độ IAA (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Số rễ/cây, chất lượng rễ

3.4.2.6 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá

- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):

(%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống):

Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100%

Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100%

Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi)

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật:

+ Chồi tốt: Chồi khoẻ, xanh

+ Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt + Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt

- Số rễ trung bình/cây:

Số rễ trung bình/cây (rễ) Tổng số rễ ra (rễ)

Tổng số mẫu cấy (mẫu) Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt : Rễ khoẻ, dài

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn

Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học và IRRISTAT 5.0

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 0,5%, HgCl 2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm

Khử trùng vật liệu nuôi cấy là bước đầu tiên trong quy trình nhân giống in vitro, nhằm tạo ra nguyên liệu thực vật vô trùng cho quá trình nuôi cấy Phương pháp sử dụng các chất hóa học có khả năng diệt nấm và vi khuẩn được lựa chọn để nghiên cứu nhằm tạo ra vật liệu sạch Sau 10 ngày nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.1.

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 0,5%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm (sau

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Không sử dụng hóa chất 1(Đ/c) 0 60 0 100 0

Không sử dụng hóa chất 5 0 60 0 100 0

Hiệu quả vô trùng của các chất khử trùng đến chồi Đảng sâm thể hiện qua hình 02: a) NaClO 0.5% b) HgCl2 0,1%

Hình 02: Ảnh khử trùng bằng NaClO 0.5%, HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Đảng sâm

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 9,84 theo giá trị LSD.05, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% giữa các công thức Công thức 6, sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút, ghi nhận tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất với 78,33% Điều này chứng tỏ hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% đối với nấm và vi khuẩn trên mẫu Đảng sâm là rất cao.

Thời gian và loại dung dịch khử trùng ảnh hưởng đến khả năng diệt nấm và vi khuẩn cũng như tỷ lệ mẫu sống không nhiễm Dung dịch HgCl2 0,1% cho hiệu quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 78,33% sau 5 phút Ngược lại, dung dịch NaClO 0,5% có hiệu quả khử trùng thấp hơn, với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất chỉ đạt 36,67% sau 5 phút và giảm xuống còn 15% sau 12 phút.

Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh hơn gốc ClO-, gây thoái hóa tổ chức và tạo thành các hợp chất protein dễ tan, làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH) và hệ thống enzyme của tế bào Hg2+ có khả năng liên kết với protein trong máu và mô, dẫn đến sự phá hủy tế bào nấm và vi khuẩn Khi thời gian khử trùng với HgCl2 0,1% và NaClO 0,5% tăng lên 10-12 phút, tỷ lệ mẫu chết cũng tăng (71,67-81,67% với HgCl2 và 63,33-56,67% với NaClO) do hóa chất thẩm thấu sâu vào mẫu, gây độc cho mô nuôi cấy và làm mất khả năng tái sinh chồi.

Do vậy đối với Đảng sâm khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút cho hiệu quả tạo vật liệu vô trùng cao nhất đạt 78,33%.

Ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm

Hệ thống tái sinh cây bằng phương pháp in vitro đã được áp dụng thành công tại Việt Nam và trên thế giới, với nhiều bộ phận nuôi cấy như vảy củ, chồi nách, đoạn thân, bầu hoa, đế hoa, lá và đỉnh sinh trưởng Đối tượng được sử dụng để tạo nguồn vật liệu khởi đầu là mắt đốt ngang thân, đây là giai đoạn quyết định cho sự thành công của quá trình nhân giống in vitro Để mẫu đưa vào môi trường nuôi cấy đạt hiệu quả, cần đảm bảo tỷ lệ nhiễm vi sinh vật thấp, tỷ lệ sống cao và mô sinh trưởng tốt.

Hiện nay, có nhiều loại môi trường được sử dụng cho các loại cây khác nhau, bao gồm thành phần khoáng, chất kích thích sinh trưởng, nguồn carbon và vitamin Mỗi loại môi trường có sự khác biệt về nồng độ các chất cơ bản Tuy nhiên, chỉ một số môi trường nhất định thường được áp dụng, như môi trường MS, phù hợp cho cây một và hai lá mầm Khi nuôi cấy một loại cây trồng mới, việc lựa chọn môi trường phù hợp là rất quan trọng.

MS được sử dụng để thử nghiệm đầu tiên Để tìm ra môi trường thích hợp chúng

Ket-noi.com cung cấp tài liệu miễn phí và đã tiến hành thử nghiệm trên ba loại môi trường nuôi cấy: MS, B5 và WPM Sau 20 ngày nuôi cấy, kết quả thu được được thể hiện trong bảng 4.2 và hình 03.

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Tổng mẫu số đưa vào (mẫu)

Tổng số mẫu tái sinh (mẫu)

Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)

Hình 03 Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường MS, B5,WPM đến khả năng tái sinh chồi Đảng sâm

Khả năng tái sinh chồi Đảng sâm phát triển trong các môi trường được thể hiện qua hình 04: a) Môi trường MS b) Môi trường MS c) Môi trường B5 d) Môi trường WPM

Hình 04: Ảnh chồi Đảng sâm tái sinh trên các môi trường MS, B5, WPM

Với giá trị LSD.05 đạt 18,82, các công thức khác nhau cho thấy sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% CT1 (MS) có tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất đạt 77,78%, với chồi tốt (chồi khỏe và xanh) Tiếp theo, CT2 (B5) giữ chất lượng chồi ổn định nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh giảm xuống còn 66,67% Tỷ lệ mẫu tái sinh thấp nhất ở CT3 (WPM) chỉ đạt 50%, thấp hơn 27,78% so với CT1 (MS) Kết quả này chứng tỏ rằng Đảng sâm phát triển tốt trong môi trường giàu dinh dưỡng.

Kết quả cho thấy cả ba loại môi trường MS, B5 và WPM đều chứa các thành phần dinh dưỡng như khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin và chất kích thích sinh trưởng Trong đó, môi trường MS giàu dinh dưỡng, môi trường B5 ở mức trung bình, còn môi trường WPM thì nghèo dinh dưỡng Đảng sâm, một loài thực vật ưa thích sống trên thảm mục giàu khoáng và chất hữu cơ, sẽ phát triển tốt nhất khi được cung cấp đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết.

Như vậy với 3 môi trường MS, B5, WPM thì môi trường MS thích hợp nhất cho tái sinh chồi Đảng sâm, được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

BA là một chất có khả năng phân chia tế bào mạnh mẽ và kích thích sự phát sinh chồi bất định, vì vậy tôi đã chọn chất này để thử nghiệm khả năng tái sinh chồi của cây đảng sâm Thí nghiệm được thực hiện trong 20 ngày, và kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của đảng sâm được trình bày trong bảng 4.3 và hình 05.

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Hệ số nhân (lần) Chất lượng chồi

Hình 05: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với giá trị LSD.05 là 0,69, các công thức thí nghiệm cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Trong số đó, công thức với nồng độ BA 1mg/l (CT2) đạt được hệ số nhân chồi cao nhất là 2,8 chồi/mẫu, tuy nhiên chất lượng chồi chỉ ở mức trung bình.

Kế tiếp là công thức 3 bổ sung 2mg/l BA hệ số nhân chồi đạt 2.4 chồi/mẫu

Hệ số nhân chồi thấp nhất ở CT5 bổ sung 4mg/l BA là 2,03 chồi/mẫu

Kết quả cho thấy BA là chất kích thích sinh trưởng hiệu quả khi sử dụng với nồng độ thích hợp, nhưng nếu dùng quá liều sẽ gây ức chế sự phát triển và độc hại cho mẫu Hệ số nhân chồi của Đảng sâm tăng dần từ 0 đến 1mg/l, kích thích sự hình thành chồi nách và ngăn chặn quá trình lão hóa Tuy nhiên, khi nồng độ BA tăng lên 2mg/l, hệ số nhân chồi giảm do cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, làm giảm sự hình thành chồi.

Với nồng độ BA là 1mg/l, hệ số nhân chồi cao nhất đạt 2,8 chồi, và chất lượng chồi trung bình này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Khả năng nhân nhanh của chồi Đẳng sâm đối với từng nồng độ BA khác nhau được thể hiện qua hình 06:

Ket-noi.com cung cấp tài liệu miễn phí về việc sử dụng BA với các nồng độ khác nhau: BA nồng độ 1 mg/l, BA nồng độ 2 mg/l, BA nồng độ 3 mg/l và BA nồng độ 4 mg/l.

Hình 06: Ảnh nhân nhanh chồi Đảng sâm với các nồng độ BA khác nhau

4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm

Mục tiêu chính của nhà nhân giống là đạt được hệ số nhân giống cao và cây con khỏe mạnh Nhóm Cytokine đã được ứng dụng hiệu quả trong việc nâng cao hệ số nhân chồi qua phương pháp in vitro Việc tìm kiếm môi trường tối ưu cho hệ số nhân chồi cao luôn là ưu tiên hàng đầu của các nhà nhân giống Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ BA kết hợp với Kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân nhanh chồi Đảng sâm, như thể hiện trong bảng 4.4 và hình 07.

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình 07: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Với giá trị LSD.05 là 0,77, sự khác biệt giữa các công thức có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% CT3 với nồng độ 0,3mg/l đạt hệ số nhân chồi cao nhất là 4,2 chồi, trong khi CT4 với nồng độ 0,5mg/l chỉ giảm nhẹ xuống còn 3,9 chồi Các công thức CT2 và CT5 có sự khác biệt nhưng không đạt ý nghĩa thống kê CT1 (đối chứng) có hệ số nhân chồi thấp nhất, chỉ đạt 2,8 chồi/mẫu.

BA và Kinetine là hai cytokine quan trọng có khả năng phân bào, kích thích sự phát triển chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh và làm chậm quá trình lão hóa của tế bào.

Như vậy kết hợp nồng đồ BA (1mg/l) với Kinetin (0,3mg/l) cho hệ số nhân chồi cao nhất là 4,26 chồi

Khả năng nhân nhanh của chồi Đẳng sâm được thể hiện qua các nồng độ khác nhau của BA kết hợp với các nồng độ Kinetin Cụ thể, hình 08 cho thấy hiệu quả của việc sử dụng Kinetin ở các nồng độ 0.1 mg/l, 0.3 mg/l, 0.5 mg/l và 1 mg/l.

Hình 08: Ảnh nhân nhanh Đảng sâm sử dụng nồng độ các Kinetin khác nhau

4.4 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm Ðể cảm ứng tạo rễ, các chồi Ðảng sâm cao từ 2-3cm được chuyển sang môi trường có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin Rễ ra 100% trong cùng một môi trường, cây con có rễ sinh trường và phát triển tốt

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm(sau 20 ngày nuôi cấy)

Số rễ/cây (rễ) Đặc điểm của rễ

Hình 09: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

Từ bảng 4.5 và hình 9 cho thấy:

Các công thức thí nghiệm cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, với giá trị LSD.05 đạt 0,31 CT3, với nồng độ 1,0mg/l, cho số rễ/cây cao nhất là 3,96, gấp 1,4 lần so với CT1 Khi nồng độ NAA tăng lên 1,5mg/l (CT4), số rễ/cây giảm xuống còn 3,5 Ở CT5, với nồng độ cao nhất 2,0mg/l, số rễ/cây chỉ đạt 2,7, là mức thấp nhất trong các công thức.

Như vậy với nồng độ NAA 1,0mg/l thì số rễ/cây đạt cao nhất 3,96 rễ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Khả năng ra rễ của chồi Đẳng sâm đối với từng nồng độ NAA khác nhau được thể hiện qua hình 10:

Sử dụng NAA nồng độ 0,5 mg/l Sử dụng NAA nồng độ 1 mg/l

Sử dụng NAA nồng độ 1,5 mg/l Sử dụng NAA nồng độ 2 mg/l

Hình 10: Ảnh Chồi Đảng sâm ra rễ khi sử dụng NAA nồng độ khác nhau

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Chỉ tiêu theo dõi Tổng số rễ (rễ)

Số rễ/cây (rễ) Đặc điểm của rễ

Hình 11 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ của Đảng sâm

Từ kết quả bảng 4.6 và hình 11 cho thấy:

Giá trị LSD.05 là 0.54, cho thấy sự sai khác ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Cụ thể, CT2 với nồng độ IAA 0,5mg/l đạt số rễ/cây cao nhất là 4,4 rễ, cao hơn 1,1 lần so với ĐC Tuy nhiên, khi nồng độ IAA vượt quá 0,5mg/l, khả năng ra rễ giảm rõ rệt; ví dụ, ở CT5 với nồng độ IAA 2,0mg/l, số rễ/cây chỉ đạt 2,7 rễ và chất lượng rễ kém.

NAA và IAA là hai loại auxin có tác động mạnh mẽ đến quá trình trao đổi chất của nitơ, hô hấp tế bào, nuôi cấy mô, và hoạt động enzyme, đồng thời tăng khả năng hấp thụ và sử dụng đường Chúng kích thích sự sinh trưởng và kéo dài tế bào, cũng như điều khiển sự hình thành rễ Tuy nhiên, khi nồng độ auxin vượt ngưỡng, chúng có thể ức chế sự sinh trưởng tế bào Nguyên nhân của sự ức chế này có thể do tăng cường tổng hợp xenlulozo và pectin, khiến thành tế bào cứng lại, cùng với sự gia tăng tổng hợp etylen, hormone có tác động ngược lại với auxin, làm giảm sự phân chia tế bào và hình thành rễ.

Như vậy số rễ/cây tốt nhất đạt 4,4 rễ khi kết hợp NAA 1,0 mg/l với IAA 0,5mg/l, chất lượng rễ tốt

Khả năng ra rễ của chồi Đẳng sâm đối với nồng độ NAA kết hợp với nồng độ IAA khác nhau được thể hiện qua hình 12:

Sử dụng IAA nồng độ 0,5 mg/l Sử dụng IAA nồng độ 1 mg/l

Sử dụng IAA nồng độ 1,5 mg/l Sử dụng IAA nồng độ 2 mg/l

Hình 12: Ảnh Chồi Đảng sâm ra rễ khi phối hợp IAA nồng độ khác nhau 4.5 Tồn tại

Nghiên cứu hiện tại chỉ tập trung vào việc phân tích hình ảnh của các thời điểm khác nhau, mà chưa xem xét hiệu quả của việc sử dụng cùng một loại chất khử trong cùng một thời điểm Điều này ảnh hưởng đến khả năng tạo ra vật liệu sạch, cần có thêm nghiên cứu để hiểu rõ hơn về mối liên hệ này.

- Nghiên cứu nhân nhanh mới chỉ nghiên cứu được môi trường nuôi cấy cơ bản chưa có thêm các chât hữu cơ

- Đề tài mới chỉ nghiên cứu tới rã rễ vẫn chua thể ra môi trường để thích ứng với môi trường ngoài phòng nghiệm

Tiêu đề	Nghiên Cứu Nhân Giống In-Vitro Cây Đảng Sâm (Codonopsis Javanica (Blume) Hook.F.& Thomson)
Tác giả	Trần Thị Thu
Người hướng dẫn	PGS.TS Trần Thị Thu Hà
Trường học	Đại học Thái Nguyên
Chuyên ngành	ST & BTĐDSH
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Thái Nguyên

Định dạng
Số trang	55
Dung lượng	1,79 MB