TỔNG QUAN
Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis)
1.1.1 V ị trí phân lo ạ i c ủ a Ba kích
Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta,
Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của
Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1.1
B ả ng 1.1 Vị trí phân loại của chi Morinda
Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao)
Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)
Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)
Phân lớp Lamiidae (Phân lớp Bạc hà)
Bộ Gentianales (Bộ Long đởm)
Họ Rubiaceae (Họ Cà phê)
Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae
Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10]
Cây dây leo có thân cuốn dài từ 3 đến 5 mét, với rễ phình to thành củ hình trụ, mập và vặn vẹo Củ thường có các đốt dài từ 1 đến 3 cm, trông giống ruột gà, với vỏ ngoài màu hồng nhạt và thịt màu hồng, tím hoặc trắng Bề mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc và bên trong có lõi cứng với tỷ lệ khác nhau so với đường kính củ.
Thân hình tròn của cây có nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt, với thân non nhẵn và được phủ bởi lông ngắn-cứng hoặc lông dài Màu sắc của thân có thể là xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau đó chuyển sang màu nâu khi trưởng thành.
Lá đơn, mọc đối, có phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn với gốc hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim Mép lá phẳng hay lượn sóng, ngọn lá có thể tròn hoặc nhọn Mặt trên của lá nhẵn hoặc phủ lông dài, trong khi mặt dưới cũng nhẵn hoặc có lông Lá non có màu tím, sau đó chuyển sang xanh, có thể có hoặc không hốc Domatia giữa gân chính và phụ, với gân lá hình lông chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên nổi lên mặt dưới và lõm ở mặt trên Gân chính có thể có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới Lá kèm dính nhau, ôm lấy thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2.
4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài 4 mm [4]
Cụm hoa dạng tán của loài này có từ 1 đến 8 tán ở nách lá hoặc đầu cành, mỗi tán chứa từ 1 đến 14 hoa nhỏ Hoa khi mới nở có màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng hoặc tím đen Đài hoa có 3-4 lá, có thể dính nhau ở dưới, với hình dạng đều hoặc không đều Tràng hoa cũng có 3-4 lá, phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, bên ngoài nhẵn hoặc phủ lông; phần phiến rời, hình tam giác, mặt ngoài nhẵn hoặc phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng Quả của loài này hình cầu, có từ 1 đến 8 quả trên mỗi tán, có thể rời hoặc dính nhau thành quả kép với các mức độ khác nhau Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, màu xanh khi non và chuyển sang màu cam khi chín, vẫn giữ lại 3 đài ở đỉnh quả, với hình dạng và kích thước không đồng đều.
1.1.3 Phân b ố , thu hái, ch ế bi ế n
Cây mọc hoang ven rừng, phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du, đặc biệt tại các tỉnh phía Bắc như Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, cùng một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên như Quảng Nam, Gia Lai, và Kon Tum.
- Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10]
- Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10]
Rễ được rửa sạch để loại bỏ đất cát, sau đó loại bỏ rễ con và phơi khô cho đến khi không còn dính tay Tiếp theo, rễ được đập nhẹ cho bẹp và tiếp tục phơi hoặc sấy nhẹ cho đến khi hoàn toàn khô.
Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm:
- Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91]
- Oligosaccharid: Nystose ( 3,0%) [21], l-borneol-6-o-β-D-apiosyl-β-D- glucosid (0,0001%) [91], 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharid, heptasaccharid [19], [59], [94]
- Ngoài ra còn có 6 hợp chất Anthraquinon [58], [89], [91], [93]; 2 hợp chất sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton
[91], [94], và một số acid amin [16], [19]
Ba kích, theo Đông y, là một vị thuốc có vị cay ngọt và tính hơi ôn, chủ yếu quy vào kinh thận Vị thuốc này có tác dụng ôn thận, trợ dương, giúp mạnh gân cốt và khử phong thấp.
Dịch chiết Ba kích có một số tác dụng đã được chứng minh như: Chống viêm (nhóm chất iridoid) [35], chống loãng xương (nhóm chất iridoid và anthraquinon)
[27], [96], tăng cường miễn dịch hệ tiêu hoá (nhóm oligosaccharid) [72], tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người (nhóm oligosaccharid) [45], tác dụng chống trầm cảm (nhóm oligosaccharid) [17]…
1.1.6 Tiêu chu ẩ n ch ất lượ ng dượ c li ệ u r ễ Ba kích
Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam V đều có chuyên luận về dược liệu rễ Ba kích Các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng của dược liệu này được tóm tắt trong Bảng 1.2.
B ả ng 1.2 Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển
Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47]
5 Hàm lượng nước/độ ẩm 13,0% 15,0% 12,0%
7 Chất chiết được 50% (chiết lạnh)
Ghi chú: (+): Có chỉ tiêu; (-): Không có chỉ tiêu
Theo Dược điển Việt Nam V, chuyên luận về dược liệu rễ Ba kích vẫn còn đơn giản và chưa được tiêu chuẩn hóa về mặt hóa học Trong khi đó, Dược điển Trung Quốc cung cấp thông tin chi tiết hơn về loại dược liệu này.
Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông kiểm soát hoạt chất có dược liệu rễ Ba kích dựa vào hàm lượng nystose [37], [47]
Monotropein và nystose là hai thành phần quan trọng nhất trong rễ Ba kích, thuộc nhóm iridorid và oligosaccharid, có tác dụng dược lý đáng kể Trung Quốc và Hồng Kông đã xác định nystose là "marker" chính của dược liệu này Do đó, để đảm bảo chất lượng của rễ Ba kích, việc kiểm soát hàm lượng của monotropein và nystose là cần thiết.
Việc bổ sung các chỉ tiêu định tính và định lượng cho hai "marker" monotropein và nystose vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam là rất cần thiết Do đó, việc xây dựng phương pháp định tính, định lượng và thiết lập hai chất chuẩn monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam sẽ góp phần nâng cao chất lượng và độ tin cậy trong nghiên cứu và ứng dụng dược liệu này.
Monotropein và nystose
1.2.1.1 Công thức phân tử, tính chất hoá lý
- Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)-1,4a,7,7a- tetrahydro-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 4,14; pKa (môi trường base mạnh) = -3 [62]
- Thuộc nhóm iridoid, có công thức cấu tạo như Hình 1.1
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của monotropein [14]
Bột kết tinh màu trắng có nhiệt độ nóng chảy từ 273 oC đến 275 oC, tan tốt trong methanol, ethanol và có khả năng hòa tan trong nước với độ hòa tan 50,2 g/l Chất này hấp thụ tia UV, với cực đại hấp thụ trong ethanol ở bước sóng khoảng 235 nm.
Monotropein có tác dụng chống viêm mạnh mẽ, được chứng minh qua các nghiên cứu gần đây Nó ức chế biểu hiện của các yếu tố gây viêm như nitric oxid 18-synthase, cyclooxygenase-2, TNF-α và IL-1β trong đại thực bào RAW 264.7 Việc điều trị bằng monotropein làm giảm hoạt động của yếu tố hạt nhân κB và ngăn chặn sự phosphoryl hóa cũng như suy giảm ức chế κB-α Đặc biệt, trong mô hình viêm ruột kết do dextran sulfate sodium, monotropein giảm chỉ số hoạt động bệnh và hoạt động myeloperoxidase, đồng thời ngăn chặn sự hoạt hóa của yếu tố hạt nhân κB ở niêm mạc ruột.
Monotropein có tác dụng chống loãng xương hiệu quả, đặc biệt trong trường hợp loãng xương do cắt bỏ buồng trứng ở chuột Nghiên cứu cho thấy monotropein giúp tăng hàm lượng khoáng xương, mật độ khoáng xương và tỷ lệ thể tích xương, đồng thời cải thiện cấu trúc xương một cách đáng kể.
Như vậy, monotropein là “marker” của dược liệu rễ Ba kích do monotropein có hoạt tính tạo nên tác dụng của dược liệu rễ Ba kích
1.2.1.3 Phương pháp phân tích monotropein
Huang Lin-yun và cộng sự [49] đã tiến hành định lượng monotropein bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: SinoChrom ODS-BP (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,1 % (1 : 99)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Xu J và cộng sự [90] đã tiến hành phương pháp định tính, định lượng monotropein trong Morinda officinalis bằng phương pháp HPLC với điều kiện như sau:
- Cột sắc ký: Kromasil C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Gradient hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,4 % từ (5 :
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Phương pháp định tính và định lượng monotropein bằng HPLC sử dụng cột C18 ở nhiệt độ 25°C, với detector UV và tốc độ dòng 1 ml/phút Hệ pha động bao gồm hỗn hợp MeOH và acid phosphoric với nồng độ từ 0,1% đến 0,4%.
1.2.2.1 Công thức phân tử, tính chất hoá lý
- Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-2-[[(2R,3S,4S,5R)-2- [[(2R,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4- dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5-
(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 11,54; pKa (môi trường base mạnh) = -3,7 [63]
- Thuộc nhóm oligosaccharid, nystose bao gồm có 3 phân tử fructose liên kết 1 phân tử glucose, có công thức cấu tạo như Hình 1.2
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của nystose [85]
- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước (745 g/l) [63]
Do oligosaccharid không hấp thụ tia UV, nên việc sử dụng detector UV không phù hợp cho phân tích Thay vào đó, có thể sử dụng một số loại detector khác như khúc xạ kế vi sai và tán xạ bay hơi để phân tích oligosaccharid.
Nghiên cứu cho thấy nhóm FOS, bao gồm 1-kestose, nystose và fructofuranosyl nystose, kích thích sự phát triển của vi sinh vật có lợi như bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn gây hại, đặc biệt là Clostridia perfringens FOS cải thiện khả năng hấp thu và lưu giữ khoáng chất như canxi và magnesi ở ruột, đồng thời tăng cường hệ miễn dịch tiêu hóa, giảm nguy cơ viêm ruột và ung thư đại tràng bằng cách cải thiện cấu trúc niêm mạc và phát triển hệ bạch huyết FOS không bị cơ thể hấp thu và ít bị thủy phân, do đó không làm tăng lượng đường trong máu, thích hợp cho bệnh nhân tiểu đường và người béo phì Hơn nữa, FOS còn làm giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid và LDL cholesterol, có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tim mạch.
Nghiên cứu cho thấy oligosaccharid trong rễ M officinalis How có khả năng bảo vệ ADN tinh trùng người khỏi tác hại của H2O2, hỗ trợ điều trị vô sinh Bên cạnh đó, oligosaccharid còn cải thiện khả năng ghi nhớ ở chuột bị mất trí nhớ do beta-amyloid, có tác dụng chống trầm cảm, bảo vệ và ngăn ngừa mất xương.
Thành phần oligosaccharid từ Ba kích có khả năng chống trầm cảm, giúp giảm đáng kể các triệu chứng hành vi trầm cảm do mô hình stress kéo dài không thể dự đoán gây ra, được chứng minh qua các thử nghiệm lựa chọn sucrose và thử nghiệm bơi cưỡng bức.
Nystose là hoạt chất có tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích Do đó, nystose là “marker” của dược liệu rễ Ba kích
1.2.2.3 Phương pháp phân tích nystose a Phương pháp TLC
Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47] tiến hành định tính nystose trong dược liệu bằng phương pháp TLC với các điều kiện như sau:
Bản mỏng HPTLC silica gel F254 Bình triển khai sắc ký loại 2 ngăn
Pha động: Hỗn hợp dung môi acetat – nước – acid formic – acid acetic băng theo tỷ lệ thể tích (6:3:2:2)
Thuốc thử hiện màu: Cho từ từ 11 ml acid sulfuric đặc vào 89 ml EtOH Thêm 2,75 g -naphthol và 7 ml nước
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 mg chất chuẩn nystose, hoà tan trong 50 ml MeOH
Dung dịch thử: Cân khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml MeOH Lắc siêu âm trong 15 phút Lọc lấy dịch lọc
Tiến hành chấm 15 µl dung dịch chuẩn và 1,5 µl dung dịch thử lên bản mỏng Trước khi sắc ký, thêm pha động vào một ngăn và đặt bản mỏng vào ngăn còn lại, đậy nắp bình và để yên trong 15 phút Nghiêng bình để pha động tràn sang ngăn chứa bản mỏng, sau đó triển khai sắc ký đến khi pha động di chuyển khoảng 8 cm Lấy bản mỏng ra, đánh dấu mức di chuyển của pha động và sấy khô Phun thuốc thử lên bản mỏng và sấy ở khoảng 100°C cho đến khi vết xuất hiện So sánh giá trị Rf của vết chính từ dung dịch thử với vết nystose từ dung dịch chuẩn Phương pháp HPLC cũng được áp dụng trong quá trình này.
Dược điển Trung Quốc năm 2015 và Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông đã thực hiện việc định lượng nystose trong Morinda officinalis bằng một phương pháp cụ thể.
* Dược điể n Trung Qu ốc năm 2015
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm) Pha động: MeOH
- Nước (3 : 97) Detector ELSD: Nhiệt độ ống bay hơi: 90 ºC Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành pha dung dịch chuẩn nystose trong pha động để cú nồng độ khoảng 200 àg/ml
- Dung dịch thử: Nghiền dược liệu rễ Ba kích thành bột mịn và cho rây qua rây
250 àm Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kớch vào bỡnh nún nỳt mài
Đo 100 ml dung dịch, sau đó thêm 50 ml pha động và đậy nắp lại Tiến hành cân để xác định khối lượng, sau đó đun sôi hồi lưu trong cách thủy trong 30 phút Để dung dịch nguội, cân lại và bổ sung pha động nếu khối lượng thiếu so với ban đầu.
Tiến hành tiêm 10 µl và 30 µl dung dịch chuẩn cùng với 10 µl dung dịch thử, sau đó ghi lại sắc ký đồ Yêu cầu số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không được thấp hơn 2.000 Tính hàm lượng nystose dựa trên phương pháp đường chuẩn, tính theo dược liệu khô kiệt.
2 điểm giữa mối tương quan giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) của nystose
* B ộ tiêu chu ẩn dượ c li ệ u chu ẩ n H ồ ng Kông
Cột sắc ký HILIC có kích thước 250 mm x 4,6 mm và kích thước hạt 5 µm được sử dụng trong điều kiện sắc ký Detector ELSD hoạt động với nhiệt độ ống bay hơi 92 ºC và tốc độ dòng khí mang nitơ là 1,2 ml/phút Tốc độ dòng sắc ký được thiết lập ở mức 1,0 ml/phút, với pha động được điều chỉnh theo chương trình gradient dung môi như trình bày trong bảng 1.3.
B ả ng 1.3 Chương trình gradient dung môi định lượng nystose
Nước (% thể tích/thể tích)
Acetonitril (% thể tích/thể tích)
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn nystose, cần cân chính xác khoảng 4 mg chất chuẩn và hòa tan trong 2 ml EtOH 60% Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch này trong EtOH 60% để tạo ra dãy dung dịch chuẩn với nồng độ nystose khoảng 160.
Để chuẩn bị dung dịch thử, cân khoảng 0,25 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón nút mài 50 ml, sau đó thêm 10 ml EtOH 60 % Tiến hành lắc siêu âm trong khoảng 15 phút Sau khi lấy dịch chiết, lọc vào bình định mức 25 ml và lặp lại quá trình chiết Rửa bã dược liệu bằng EtOH 60 %, gộp các dịch chiết vào bình định mức đã chuẩn bị, thêm EtOH 60 % đến vạch định mức và lắc đều Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
1.3.1 Tình hình thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n monotropein, nystose trên th ế gi ớ i và t ạ i Vi ệ t Nam
Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh được Bộ Y tế giao nhiệm vụ thiết lập chất chuẩn cho Dược điển Việt Nam và chuẩn phòng thí nghiệm Tính đến tháng 03/2020, quỹ chất chuẩn của hai Viện có hơn 600 chất chuẩn hóa dược và khoảng 40 chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu Tuy nhiên, trong danh mục các chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu, không có chất chuẩn monotropein và nystose.
Trên toàn cầu, việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn chủ yếu được thực hiện bởi các tổ chức như Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USPRS), Ban thư ký kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (EPRS), Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới (ICRS) và Hội đồng chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) Tuy nhiên, hiện tại, tất cả các tổ chức này vẫn chưa thiết lập chất chuẩn cho monotropein và nystose.
Một số đơn vị đã thành công trong việc thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose chiết xuất từ rễ Ba kích, như được thể hiện trong Bảng 1.4.
B ả ng 1.4 Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose
Stt Tên chất chuẩn Nhà cung cấp Hàm lượng
6 Nystose TRC-Canada [82] - Lọ 10 mg 45 USD
Viện Kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc
Theo Bảng 1.4, một số công ty toàn cầu cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose với giá thành khá cao, dao động từ 45 đến 290 USD cho một lọ chứa từ 5 mg đến 25 mg chất chuẩn.
Tại Việt Nam, hiện chưa có đơn vị nào cung cấp các chất chuẩn monotropein và nystose, mặc dù các chất này có độ tinh khiết từ 92% đến 98% và thời gian cung cấp thường kéo dài từ 6 đến 8 tuần Do đó, việc phân lập và thiết lập chuẩn từ dược liệu rễ Ba kích là cần thiết để phục vụ cho hệ thống kiểm nghiệm chất lượng dược liệu này tại Việt Nam.
1.3.2 Phân l ậ p, tinh ch ế monotropein và nystose t ừ Ba kích
1.3.2.1 Nghiên cứu chiết xuất phân lập monotropein từ Ba kích
Monotropein và hỗn hợp các iridoid có khả năng tan trong nước, ethanol loãng và methanol Để chiết xuất, nước hoặc ethanol 50% thường được sử dụng làm dung môi kết hợp với các phương pháp như cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký và chiết dung môi Ngoài ra, methanol thường được áp dụng để chiết xuất monotropein nhằm loại bỏ các thành phần không mong muốn.
Liu Dongfeng và cộng sự [61] đã xây dựng qui trình chiết xuất monotropein từ
Morinda offcinalis gồm các bước sau:
Chiết xuất Ba kích được thực hiện bằng cách nghiền nát rễ thành bột mịn, sau đó rây qua lưới cỡ 40 Tiếp theo, thêm ethanol 30% với tỷ lệ 8 – 10 lần so với khối lượng dược liệu, lắc siêu âm để hòa tan, rồi lọc lấy dịch chiết Cuối cùng, đem cô bay hơi dung môi để thu được cao chiết EtOH.
Phân lập cao chiết khô bằng cách hòa tan vào nước và chiết lần lượt với ethyl acetat và n-butanol, sau đó lấy lớp propyl carbinol và cô bay hơi dưới áp suất giảm để thu được cao chiết Tiếp theo, hòa tan cao chiết trong nước và nạp lên cột resin HPD600, sau đó rửa giải bằng dung dịch NaOH có pH = 10 để thu dịch rửa giải Cuối cùng, điều chỉnh pH của dịch rửa giải về mức trung tính và nạp dịch này lên cột resin HPD600, thực hiện rửa giải bằng EtOH 30% để thu lấy dịch EtOH 30%.
Tinh chế bằng phương pháp kết tinh được thực hiện bằng cách cô bay hơi dung dịch EtOH 30% để thu được cao EtOH Sau đó, cao EtOH được hòa tan trong ethyl acetat và cô bay hơi để thu được chất kết tinh Quy trình này được lặp lại hai lần, cho ra monotropein với độ tinh khiết đạt 92,54% theo phương pháp HPLC.
Phương pháp này có chi phí thấp nhưng độ tinh khiết của nguyên liệu không cao Sử dụng dung môi EtOH 30% và cột resin có nhược điểm là không loại bỏ triệt để các thành phần khác có tính đồng tan hoặc độ phân cực tương tự với monotropein.
1.3.2.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế nystose từ Ba kích
Liu Dongfeng và cộng sự [60] đã xây dựng phương pháp chiết xuất nystose từ
Morinda offcinalis gồm các bước sau:
Để chiết xuất dược liệu Morinda officinalis, nghiền nguyên liệu và thực hiện quá trình chiết siêu âm từ 2-3 lần, mỗi lần kéo dài 20-40 phút với tỉ lệ nước gấp 5-10 lần lượng nguyên liệu Sau đó, lọc dịch chiết qua màng cellulose, gộp các dịch chiết lại và cô đặc để thu được cao Cuối cùng, hòa tan cao trong ethanol 95% và để kết tủa qua đêm nhằm thu được chất kết tủa.
Hòa tan chất kết tủa trong nước khử ion, trộn với silica gel và sấy khô Sau đó, nhồi vào cột sắc ký, rửa giải lần lượt với methanol và nước để thu dung dịch rửa Cuối cùng, cô đặc, kết tủa bằng ethanol và làm đông khô để thu được nystose với độ tinh khiết 95,2%.
Phương pháp sản xuất nystose mang lại lợi ích với quy trình công nghệ đơn giản và năng suất cao, dễ dàng áp dụng trong công nghiệp Tuy nhiên, việc chỉ sử dụng sắc ký cột silica gel và màng lọc cellulose không đủ để loại bỏ hoàn toàn các thành phần khác, dẫn đến độ tinh khiết của sản phẩm chưa đạt yêu cầu cao.
Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis
Ba kích (Morinda officinalis How) hay bị nhầm lẫn do hình dáng gần giống với
Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây Mặt quỷ (Morinda villosa Hook) và cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost) là những dược liệu quan trọng Việc định danh dược liệu thông qua hình thái học gặp nhiều khó khăn, bởi sau khi thu hái và xử lý, thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu thường không đầy đủ Do đó, cần áp dụng các phương pháp bổ trợ để cải thiện độ chính xác trong việc định danh các loại dược liệu này.
Ba kích được chính xác Và phương pháp định danh bằng phân tích trình tự ADN là một trong những phương pháp chính xác đáp ứng yêu cầu đó
Phân tích trình tự nucleotid của gen theo nguyên lý mã vạch DNA là quá trình xác định loài thông qua việc phân tích các đoạn ngắn chuỗi gen chuẩn hóa được trích xuất từ bộ gen.
1.4.1 Quy trình phân tích mã v ạ ch ADN cho th ự c v ậ t
Mã vạch ADN (DNA barcoding) là các đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã được xác định trong ngân hàng gen Phương pháp này được sử dụng để định danh các loài sinh vật chưa biết thông qua việc so sánh với trình tự ADN trong ngân hàng gen.
Quy trình ứng dụng mã vạch ADN để phân loại và theo dõi cây phân loài cho thực vật được chuẩn hóa nhằm giúp các nhà khoa học toàn cầu dễ dàng tra cứu và cập nhật thông tin vào ngân hàng dữ liệu gen Việc tuân thủ quy trình chuẩn hóa hoặc sử dụng các bộ kit thiết kế sẵn cho phân tích các hệ gen như ADN nhiễm sắc thể, ADN ty thể, và ADN lạp thể là rất cần thiết.
- Chọn bộ gen cần phân tích là bộ gen ty thể, lạp thể hay nhân Chiết tách và tinh chế DNA gen đích theo quy trình tương ứng
- Khuếch đại đoạn gen cần phân tích bằng mồi chung hoặc mồi đặc hiệu
- Giải trình tự đoạn gen khuếch đại thu được
- So sánh với ngân hàng dữ liệu gen (GeneBank)
Tính đến tháng 4 năm 2018, GeneBank của NCBI đã lưu trữ 208.452.303 trình tự gen quy ước, và cơ sở dữ liệu này đang tiếp tục gia tăng hàng ngày.
1.4.2 Phương pháp khuếch đạ i gen (PCR)
1.4.2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp ADN, sử dụng một trình tự ADN ban đầu làm khuôn để khuếch đại số lượng bản sao lên đến hàng triệu bản Quá trình này diễn ra nhờ enzym polymerase và cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN mục tiêu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:
Trong bước đầu tiên của quá trình PCR, được gọi là biến tính tách đôi sợi ADN, nhiệt độ được nâng lên từ 94 đến 95 độ C trong khoảng 30 giây đến 1 phút Quá trình này giúp tách hai mạch của phân tử ADN mạch kép thành hai mạch đơn, và chính những mạch đơn này sẽ trở thành khuôn mẫu cho việc tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Trong bước 2 của quy trình, được gọi là bắt cặp và annealing, nhiệt độ được giảm xuống dưới nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, tạo điều kiện cho các primer bắt cặp với mạch khuôn Thông thường, nhiệt độ này dao động từ 55 đến 65 độ C, tùy thuộc vào từng thí nghiệm cụ thể.
Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây
Trong bước 3 của quá trình khuếch đại DNA, nhiệt độ được tăng lên 72 o C để tối ưu hóa hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme này sẽ gắn các nucleotid vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian cho giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại ADN có thể được tính toán dựa trên các yếu tố này.
Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2 n trong đó: m: là số bản sao của chuỗi mã hóa; n: là số chu kỳ
Qua mỗi chu kỳ nhiệt, ADN đích được nhân bản thành hai bản sao Nếu chu kỳ này lặp lại liên tục từ 30 đến 40 lần, số lượng bản sao sẽ tăng lên từ 2^30 đến 2^40, tương đương với hàng tỷ bản sao.
(a) Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (b) Các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase Hình 1.3 Sơ đồ và các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase [15]
1.4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Phản ứng khuếch đại tối ưu trong quy trình PCR yêu cầu ADN mẫu phải thật tinh sạch Tuy nhiên, nhiều kỹ thuật chẩn đoán vẫn cho kết quả khả quan với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Đặc biệt, lượng ADN mẫu cần thiết đã giảm đáng kể, từ 1 µg xuống còn 100 ng, nhờ vào việc sử dụng các DNA polymerase hiệu quả cao.
DNA polymerase là enzym chịu nhiệt, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp sợi ADN mới bằng cách bổ sung nucleotid vào trình tự đích Taq DNA polymerase, được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng, là enzym đầu tiên và phổ biến nhất trong lĩnh vực này, với khả năng chịu nhiệt tốt mà không bị phá vỡ Hiện nay, nhiều loại polymerase chịu nhiệt khác đã được phát triển và ra mắt thị trường, mang lại nhiều chức năng chuyên biệt và cải tiến hơn.
Primer là đoạn ADN đơn ngắn chứa trình tự đích, đóng vai trò quan trọng trong thí nghiệm PCR Enzym polymerase bắt đầu tổng hợp sợi ADN mới từ đầu 3’ của primer Việc thiết kế primer chính xác là yếu tố quyết định thành công hay thất bại của thí nghiệm, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả khuếch đại của mảnh ADN đơn.
Nồng độ dNTP (deoxynucleotid triphosphat) thường được sử dụng trong phản ứng PCR là từ 20 đến 200 μM Việc sử dụng nồng độ dNTP cao hơn có thể dẫn đến sự khuếch đại không mong muốn Hơn nữa, sự cân bằng giữa các thành phần dNTP cũng đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả của phản ứng PCR.
Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase [6]
Nồng độ MgCl2 là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phản ứng PCR, vì ion Mg2+ cần thiết cho việc liên kết các dNTP và xúc tác cho enzym Taq polymerase, đồng thời làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch kép Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp, Taq polymerase sẽ không hoạt động hiệu quả trong giai đoạn kéo dài, dẫn đến hạn chế quá trình này Ngược lại, nồng độ Mg2+ cao giúp ổn định ADN đôi và ngăn ngừa biến tính hoàn toàn trong mỗi chu kỳ, tuy nhiên cũng có thể làm gia tăng hiện tượng bắt cặp giả, dẫn đến sản phẩm PCR với số lượng lớn nhưng độ chuyên biệt thấp.
- Dung dịch đệm: Dung dịch đệm có nồng độ cao được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR [6]
Tính cấp thiết của luận án
Ba kích là một dược liệu quý với nhiều tác dụng và nhu cầu sử dụng cao tại Việt Nam, do đó cần kiểm soát chặt chẽ về chất lượng Monotropein và nystose được xác định là hai "marker" chính của dược liệu này, vì chúng có hoạt tính sinh học và hàm lượng lớn Để nâng cao chất lượng dược liệu Ba kích, cần cập nhật chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V, bổ sung chỉ tiêu định tính và định lượng cho monotropein và nystose, đồng thời phân lập và thiết lập chất chuẩn cho hai hợp chất này nhằm cải thiện quy trình kiểm nghiệm trên toàn quốc, giảm giá thành và thời gian cung ứng.
Như vậy, luận án "Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix
Morindae officinalis) của Việt Nam" được thực hiện với 3 mục tiêu chính như trên là cấp thiết.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu dược liệu (có độ tuổi trên 3 năm) được thu hái trong các vùng Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Hà Giang, được mã hoá tại Bảng 2.1
B ả ng 2.1 Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích
Stt Mã hoá Nơi thu hái Số hiệu tiêu bản Nơi lưu mẫu
1 BK1 Lục Ngạn, Bắc Giang 2018.DT02.BK1 Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
2 BK2 Vị Xuyên, Hà Giang 2018.DT02.BK2
3 BK3 Vân Đồn, Quảng Ninh 2018.DT02.BK3
4 BK4 Hoành Bồ, Quảng Ninh 2018.DT02.BK4
5 BK5 Tây Giang, Quảng Nam 2018.DT02.BK5
6 BK6 Quản Bạ, Hà Giang 2018.DT02.BK6
- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose trên mẫu BK4 Nguyên liệu thu được của quá trình này dùng để thiết lập chất chuẩn
- Đối tượng nghiên cứu để định danh dược liệu rễ Ba kích bằng chỉ thị ADN là
6 mẫu dược liệu thu hái theo Bảng 2.1.
Phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Ch ấ t chu ẩ n và dượ c li ệ u chu ẩ n
- Chất chuẩn monotropein: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: SLBN8437V; Hàm lượng: 99 % C16H22O11 (nguyên trạng)
- Chất chuẩn nystose: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: BCBT3105; Hàm lượng: 99,6 % C24H42O21 (nguyên trạng)
- Dược liệu chuẩn Ba kích (Morinda officinalis How, họ cà phê (Rubiaceae)): Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc; Số lô: 121163-201405
2.2.2 Hóa ch ấ t và thu ố c th ử
- Methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dichloromethan, aceton, acid trichloacetic, acid acetic, acid chlohydric, amoniac, chloroform (hãng Merck)
- Bản mỏng pha đảo, bản mỏng pha thuận, silica gel sắc ký cột (hãng Merck, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm)
- Mồi chung cho phản ứng PCR, 40 - 50 nucleotid/cặp
- Kit chiết tách Dneasy mini plant kit (Qiagen - Mỹ)
- Thang ADN (DNA ladder) 1000 àl/lọ - Mỹ
- Dung dịch dNTPs 10mM - Mỹ
- Ethidium bromide (lọ 10ml)- Sigma
- Đệm TBE 1X: 89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA pH 8,3 ± 0,2 (Thermo Scientific – Mỹ)
- Thuốc nhuộm gel Runsafe Stain: Bromophenol Blue, Xylene Cyanol FF, Orange G (Clever Scientific – Anh)
- Loading dye: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA, 0,005 % bromophenol blue, 0,005 % xylen cyano FF, 10 % glycerol (Thermo Scientific – Mỹ)
- Bộ sắc ký cột thuỷ tinh
- Buồng đóng chuẩn Terra Universal, model: Glove Series 400 Glovebox
- Cân phân tích: Mettler Toledo MS105 (d = 0,01 mg); Mettler Toledo AB204 (d = 0,1 mg)
- Máy định lượng DNA Biophotometer plus
- Máy đo điểm chảy Buchi 535 Melting point
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AM500 FT-NMR
- Máy đo quang phổ hồng ngoại Thermo Nicolet Nexus 670 FTIR
- Máy đo UV – VIS Hitachi UV 3210
- Máy giải trình tự gen AIB 3130XL
- Máy PCR AB Aplied BioSystems Veriti
- Máy phân tích nhiệt trọng lượng TGA Mettler Toledo
- Máy sắc ký lỏng điều chế Shimadzu LC 10 AT VP, detector PDA
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Detector DAD Shimadzu LC 20A
- Máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector ELSD Hitachi
- Máy soi gel UV transilluminator
- Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Waters QTOF
- Các dụng cụ và thiết bị phụ trợ khác
Các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 và GLP.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Th ẩm đị nh phương pháp định tính, định lượ ng monotropein và nystose 2.3.1.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein a Phương pháp định tính, định lượng monotropein
Dựa trên tài liệu [49], [57] và kết quả khảo sát thực tế, phương pháp định tính và định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích đã được thực hiện với các điều kiện cụ thể.
- Cột sắc ký: Phenomenex Gemini RP 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,5 % theo tỷ lệ thể tích 5 : 95
- Detector DAD: Bước sóng UV tại 237nm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn monotropein, sau đó hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol (MeOH) Tiếp theo, lấy chính xác 1 ml dung dịch đã pha loãng và định mức thành 20 ml bằng nước.
* Chuẩn bị dung dịch thử
Để định lượng monotropein trong nguyên liệu, đầu tiên cần cân chính xác khoảng 10 mg nguyên liệu monotropein và hòa tan trong 10 ml dung dịch MeOH Sau đó, lấy 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 20 ml bằng nước.
Để định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích, đầu tiên cân 0,6 g bột rễ Ba kích vào ống ly tâm thủy tinh có nắp, sau đó thêm 15 ml EtOH 40 % và lắc siêu âm trong 30 phút Tiến hành ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút và chiết tiếp 2 lần, mỗi lần 10 ml EtOH 40 % Gộp tất cả dịch chiết và điều chỉnh thể tích thành 50 ml bằng EtOH 40 % Cuối cùng, lấy 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 10 ml bằng nước.
Hệ thống sắc ký cho thấy độ thích hợp cao với độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic monotropein không vượt quá 2,0% từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn Số đĩa lý thuyết tính trên pic monotropein đạt tối thiểu 4.000, trong khi hệ số đối xứng của pic monotropein nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5.
- Hàm lượng (%) monotropein (C16H22O11) trong nguyên liệu được tính theo công thức:
ST và SC đại diện cho diện tích của pic monotropein trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng Trong khi đó, mT và mC là khối lượng của mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng, được đo bằng đơn vị miligam (mg).
- Hàm lượng monotropein (%) trong dược liệu rễ Ba kích (tính theo dược liệu khô kiệt) được tính theo công thức:
ST, SC: diện tích pic monotropein trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng
CC: nồng độ dung dịch chuẩn monotropein (mg/ml)
W: lượng cân của mẫu thử (g)
A: độ ẩm của mẫu thử (%) b Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích
Thẩm định phương pháp định tính và định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích được thực hiện bằng kỹ thuật HPLC-DAD, dựa trên các chỉ tiêu quy định trong Bảng 2.2.
B ả ng 2.2 Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein
Chỉ tiêu Cách xác định/đánh giá Giới hạn chấp nhận Độ thích hợp của hệ thống
Hiệu lực phân tách của cột Số đĩa lý thuyết (N)
≥ 4.000 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu, diện tích pic monotropein trong dung dịch chuẩn
Thời gian lưu của pic monotropein trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử rất quan trọng, với thời gian lưu tương ứng cho thấy độ tinh khiết của pic chính đạt khoảng 1 Trong sắc ký đồ dung dịch mẫu dung môi, không có pic tại thời gian lưu của pic monotropein, cho thấy độ tuyến tính với hệ số tương quan r ≥ 0,995 Độ chính xác được xác định qua độ lặp lại với giá trị RSD của kết quả định lượng không vượt quá 2,0 % (n = 6), đảm bảo độ chính xác trung gian.
Xác định giá trị RSD kết quả định lượng RSD ≤ 2,0 % (n = 6)
Tập hợp kết quả độ lặp lại và khác ngày RSD ≤ 2,0 % (n = 12) Độ đúng
Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn monotropein trong các dung dịch tự tạo có mức nồng độ tương ứng 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng
LOD, LOQ Kết quả thực nghiệm
Phương pháp tiế n hành Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên hệ thống sắc ký để ghi lại sắc ký đồ Kết quả cho thấy độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic monotropein và số đĩa lý thuyết được xác định, đảm bảo độ đặc hiệu của phương pháp.
- Mẫu trắng (dung môi): Nước cất
- Dung dịch chuẩn, dung dịch thử: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử
Tiến hành sắc ký lần lượt các dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung môi vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ Độ tuyến tính
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng nước để tạo ra các dung dịch chuẩn có nồng độ monotropein lần lượt là 20%, 60%, 100%, 140% và 200% so với nồng độ định lượng.
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và ghi lại sắc ký đồ để xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ monotropein Xác định hệ số tương quan tuyến tính (r) nhằm đánh giá độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp.
- Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính của mục Độ tuyến tính
- Dung dịch thử: Chuẩn bị 6 dung dịch thử theo phương pháp nêu tại Mục 2.3.1.1
– a – Chuẩn bị dung dịch thử
Xác định hàm lượng monotropein trong 6 dung dịch thử, tính độ lệch chuẩn tương đối của 6 giá trị hàm lượng Độ chính xác trung gian
Tiến hành thử nghiệm tương tự như phần độ lặp lại nhưng thay đổi ngày và người thử nghiệm Tính toán độ lệch chuẩn tương đối cho 6 kết quả định lượng khác ngày và 12 kết quả định lượng của độ lặp lại cũng như khác ngày để đánh giá độ chính xác.
* Định lượng monotropein trong nguyên liệu: Sử dụng phương pháp mẫu tự tạo
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Để chuẩn bị dung dịch 80%, cân chính xác khoảng 8 mg monotropein chuẩn, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol (MeOH) Sau đó, lấy 1 ml dung dịch này và pha loãng thành 20 ml bằng nước Quy trình này cần được thực hiện trên 3 mẫu khác nhau.
Để chuẩn bị dung dịch 100%, cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn monotropein và hòa tan trong 10 ml methanol (MeOH) Sau đó, lấy 1 ml dung dịch này và pha loãng thành 20 ml bằng nước Quy trình này được thực hiện trên 3 mẫu để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.