NGUYỄN QUANG VINH BÙI PHƯƠNG THUẬN - PHAN TUẤN NGHĨA THỰC TẬP HÓA SINH HỌC ■ ■ (ỉn lần thứ 2) NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Mục lục • ■ Lời nói đ ầ u V C h n g P V o tein 1.1 Tính chất lưỡng tính axit amin protein 1.2 Tính chất keo dung dịch protein 1.2.1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch p ro tein 1.2.2 Sự biến tính p ro tein 1.3 Các phản ửng màu axit amin protein 1.3.1 Phản ứng b iu r e 1.3.2 Phản ứng với ninhiđrin 11 1.3.3 Phản ứng với axit n itrơ 13 1.3.4 Phản ứng xantoprotein axit amin v ò n g .14 1.3.5 Phản ứng Pauli để phát histiđin tirozin 15 1.3.6 Phản ứng M illon đặc trưng cho tirozin 16 1.3.7 Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho triptophan: 17 1.3.8 Phản ứng prolin VỎ1 thuốc thử iz a tin 19 1.3.9 Phản ứng axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng F o lia ) 20 1.3.10 Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho a cg in in 21 1.4 Định lượng axit am in protein 23 1.4.1 Xác định nitơ amin (N-amin) phương pháp chuẩn độ focmol 23 1.4.2 Định lượng p ro tein 25 Chương Enzim » „.33 2.1 Các thí nghiệm định tính số e n z im ;i3 2.1.1 Pepxin (peptit-peptidohidrolaz) ;Ỉ3 2.1.2 Amilaz nước bọt ;ì4 2.1.3 U r e a z 35 2.1.4 Peroxidaz .36 2.2 Tính chất enzim ;Ỉ6 2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính am ilaz nước b ọ• t 36 2.2.2 Anh hưởng pH môi trường đến hoạt độ enzim - Xác định pH thích hợp am ilaz nưốc bọt 'M 2.2.3 Ảnh hưởng chất kích thích chất kìm h ã m .‘59 2.2.4 Tính đặc hiệu enzira ,‘59 2.3 Xác định hoạt độ sô"enzim .40 • • • • '% , 2.3.1 Xác định hoạt độ• catalaz 40 • • 2.3.2 Xác định hoạt độ a - am ilaz theo phương pháp W ohlgem u th 42 2.3.3 Xác định hoạt độ ureaz theo phương pháp chuẩn độ 43 2.3.4 Xác định hoạt độ proteinaz theo phương pháp Anson cải tiế n 45 2.3.5 Xác định hoạt độ lip a z 47 Chương S a ca rit 48 3.1 Các phản ứng định tín h 49 3.1.1 Các phản ứng mono - đ isa ca rit 49 3.1.2 Phản ứng định tính polisacarit 58 ii 3.2 Định lượng s a c a n t 61 3.2.1 Định lượng đường khử theo phương pháp B ertrand 62 3.2.2 Định lượng tinh b ộ t 64 C h n g A x it n u c l e i c .66 4.1 Các tính chât lí - hố axit n u c le ic 66 4.1.1 Tính tan axit n u cleic 66 4.1.2 Các phản ứng màu axit n u c le ic 67 4.2 Định lượng axit nucleic 70 4.2.1 Định lượng A D N 70 4.2.2 Định lượng A R N 72 ('h n g L ip it 74 5.1 Mỡ trung tính (tn axylglixerin ) 74 5.1.1 Tính chất lý hố mỡ 74 5.1.2 Phản ứng phân biệt thành phần cấu tạo mở 75 5.1.3 Xác định sô mỡ 78 5.2 L ip it 81 5.2.1 Tách lơxitin từ lòng đỏ trứ n g 82 5.2.2 Một sơ" tính chất lơ x itin .82 5.3 Đ ịnh lượng L ipit 83 C h n g V ita m in 86 6.1 Các phản ứng định tính vitam in 86 6.1.1 Các vitam in hòa tan chất b éo 86 6.1.2 Các vitam in hòa tan n c .90 6.2 Đ ịnh lượng vitam in 96 6.2.1 Định lượng vitam in c theo phương pháp chuẩn độ 96 iii 6.2.2 Định lượng vitam in A 97 Chương H ocm on 99 7.1 Hocmon động v ậ t 100 ĩ.l.l.H o c m o n stero it 100 7.1.2 Hocmon peptit p ro tein 102 7.1.3 Hocmon dẫn xuất axit a m in .103 7.2 Hocmon thực v ậ t .106 7.2.1 Các hocmon dẫn xuất indol .106 7.2.2 G iberelin 109 Chương Các chất thực vật thứ sin h 113 8.1 G licozit 113 8.1.1 Định tính glicozit acbutin trúc đ o 114 8.1.2 Glicozit đào (Prunus persica L B atsch) 115 8.2 A n k a lo it 119 8.2.1 Một sơ" phản ứng định tín h 119 8.2.2 Định lượng an k aloit 120 8.3 Các hợp chất ph en ol 122 Phu• lu• c .126 Một sô" chất thị màu để đo p H 126 Chuẩn bị dung dịch Folin (để xác định protein) 127 Chuẩn bị giấy Picrô - s ô đ ê .127 Bảng chuyển đổi lượng đồng thành lượng đường (mg) theo phương pháp B ectra n d 128 Tài liêu tham khảo c h ín h 129 # Lời nói đầu Giáo trình "Thực tập hóa sinh học” biên soạn để dùng làm tài liệu thực hành chương trình uHóa sinh học đại cươrg” bậc đại học Mục đích thí nghiệm tron* KĨáo trình minh họa củng phần kiến thức lý th m ết sinh viên học Ngồi ra, giáo trình củng cịn nhằm giúp sinh viên làm quen với sô phương pháp định lượng thường dùng phịng thí nghiệm Hóa sinh Trên sở giáo trình "Thực tập hóa sinh học” tập thể cán 3Ộ giảng dạy Bộ mơn Hóa Sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay trường Đại học Khoa học Tự nhiên) biên soạn trước qua thực tế sử dụng vối kinh nghiệm hướng dẫn thực tập điều kiện phịng thí nghiệm tại, chúng tơi chọn lọc biên soạn lại giáo trình, có sửa đổi 'à bô sung sô phần như: hocmon, chất thực vật thứ sinh nhằm đáp ứng yêu cầu đào tạo Giáo trình phân thành tám chương, giới thiệu tám nhón hợp chất quan trọng tê bào thể sông như: protein, enzim, sacarit, axit nucleic, lipit v ề bản, chưcng bao gồm phần chính: phần định tính phần định lượn* nhóm chất Trong đó, chịu trách nhiệm về: Chương I - Bùi Phương Thuận, Nguyễn Quang Vinh; Chương II - Phan Tuân Nghĩa, Nguyễn Quang Vinh; Chương III - Bùi Phương Thuận; Chương IV, VI - Phan Tuấn Nghĩa; Chương V, VII, VIII - Nguyễn Quang Vinh Chúng hy vọng sách tài liệu tham khảo tốt cho người làm cơng tác thuộc lĩnh vực Hóa sinh học lĩnh vực liên quan khác Những thiếu sót Chúng tơi mong nhận chun mơn, người tiến tốt lần xuất giáo trình khơng thể tránh khỏi ý kiến đóng góp từ nhà sử dụng bạn đọc để cải C ác tá c g iả Chương Protein Protein hợp chất hữu phân tử lốn nhiều gốc a-L -axit amin kết hợp vói liên kết peptit Trong thể sông protein thực nhiều chức quan trọng khác như: nguyên liệu tạo nên tế bào (vai trò cấu trúc), xúc tác sinh học, vận tải, chuyển động, điều hòa, bảo vệ Các protein chia thành hai nhóm lớn: protein đơn giản vỉ* protein phức tạp Thuộc loại protein đơn giản đại phân tử thủy phân nhận axit amin Trong th àn h phần protein phức tạp, ngồi axit amin, cịn chất protein như: axit nucleic, sacarit, lipit, sểic tơ, ion kim loại Có khoảng 20 loại axit amin tham gia vào thành phân tử protein khác Các axit amin khác phân biệt bơi mạch bên (gốc R) chúng Tính chất protein phụ thuộc vào thành phần, trình tụi xếp gốc axit amin cấu hình khơng gian Tiùy thuộc phân tử protein có gốc axit amin nào, nhóm hóa học mà chúng biểu khác dưng dịch (về tính tan, khả tích điện), tác du ng với chât riêng biệt (thuốc thử) cho sản phẩm màu đặc trưng Các tính chất ứng dụng đẻ định tính định lượng protein 1.1 Tính châ't lưỡng tính axit amin protein Trong phân tử axit amin protein có nhóm cacboxyl nhóm am in tự nên chúng có tính chất lưỡng tính Trong dung dịch nưóc, số (0,1%) phân tử axit amin dạng khơng tích điện, cịn phần lớn dạng lon lưởng cực Tùy thuộc vào pH môi trường mà axit amin có tính chất axit hay bazơ Trong môi trường kiểm, axit amin cho proton (tính chất axit) trở thành anion Trong mơi trường axit, nhận proton (tính chất bazơ) trở thành cation Sơ đồ phản ứng sau: c o o _ T+ OH / a) R -C H —— ► N NHg c o o / R -C H + * ,0 NN H Anion b) / cocr R -C H \ n h + J TT+ +H — —— ► COOH / R -C H \ + nh; Cation Vì vậy, điện trường, tùy theo pH môi trường mà axit am in protein di chuyển vể anơt catơt Giá trị pH mà chúng khơng di chuyển vê cực gọi pH đẳng điện (pHi) Ở pH đẳng điện, dung dịch protein không bền, dễ dàng bị kết tủa Tính chất ứng dụng để xác định điểm đẳng điện protein Xác định điểm đẳng điện cazein Hỏa chất: Axit axetic (CHịCOOH) 0,1 N; dung dịch cazein 0,4% natri axetat (CH^COONa) 0,1 N Cách Làm: Lấy ông nghiệm khỏ Đánh sô thứ tự từ [ (tên V Cho vào ông lượng axit axetic nước cất tiược ghi bảng, lắc Sau cho vào ống lm l cluiig dịnh cazein 0,4% natri axetat 0,1 N Sau hịa lẫn dung dịch ơng có pH xác định Quan sát ta thấy sỏ ông dung dịch vẩn đục, đê lúc kết tủa lang xuống đáy n g có nhiều kết tủa nghĩa pH tương ứng với điểm đẳng điện cua.cazein Ghi mức độ kết tảa ỏ ông dâu + sci TT ống nghiệm 1.2 Số ml CH3COOH 0,1 N Sỏ ml nước Sỏ ml cazein 0,4% CH3COONa 0,1 N pH 0,1 8,9 1,0 5,6 0,2 8,8 1.0 5,3 1,0 8,0 1,0 4,7 4,0 5,0 1,0 4,1 8,0 1,0 1,0 3,8 ị Mức độ kết tủa Tính chất keo dung dịch protein protein dung dịch loại keo ưa nước Chúng bền vững dung dịch nhờ màng nước hay lớp vỏ hiđrat bao quanh phân tử (được tạo thành nhóm phân cực tích điện bề mặt hấp phụ phân tử nước lưỡng cực) nhờ phân tử tích điện dấu có xu hướng đẩy nhau, Cách làm : Lấy ơng nghiệm, cho vào ông I: lml dung dịch g’lu:ozơ 1%; ống II: lml mantozơ %; ông III: lml sacarozd % T hán vào ông lml thuôc thử Fehling Lắc đun ôĩng đến bắt dầu sôi Quan sát, so sánh kêt ơrng giái thích Có thể dùng phản ứng để tìm thấy đường lát cắt mơ, cách làm sau: đặt lát cắt lam kính, nhỏ vài g?iọt thuôc thử Fehling, đậy lamen lại, hơ nhẹ đèn cồn liic len nước bắt đầu sơi Quan sát kính hiển vi N ếi có đưịng sè thấy nhừng chấm nâu nhỏ Cu >0 lát cắt cj) Phản útig Benedict Phản ứng đặc trưng nhạy đường khử plhản ứng với thuốc thử Fehling Trong thuốc thử Benedict dùng N a.C()3 thay cho NaOH, natri xitrat thay cho mi segnet thư)C thử Fehling Vì phản ứng không tạo thành đồng h:iđ*oxit mà tạo thành đồng cacbonat Độ nhạy phản ứng caio cần dùng dung dịch đưòng , %cũng làm thay đối màu dung dịch phản ứng (từ xanh da trịi đến xanh lục) Míàìi xanh lục màu Cu20 hòa lẫn vối màu xanh tbiưếc thử Hóa chát: - Glucozơ 0,1%- Chuẩn bị thuốc thử Benedict: hòa tan 173g natri xitrat trorg 700ml nước sôi, thêm 10 g Na2C0 khan, làm lạnh, thêm từí ;ừ 10 ml dung dịch CuS04.5H20 17,3%, thêm nước đến lQOỈml Cách làm : Cho vào ống nghiệm 5ml thuốc thử Benedict gọt dụng dịch glucozơ 0,1% Đặt ống nghiệm vào nồi cách 51 thủy sôi phút Dung dịch chuyển thành màu Xan h lục, có kết tủa đỏ tùy theo lượng glucozd dung dịch d) Phản úng với động axetat [(CH3COO)2Cu] (Phản úng Barf*d) Phản ứng khác với phản ứng ỏ chỗ không ‘,iến hành môi trường kiềm mà môi trường gần trintg tính, điều kiện đisacarit khơng bị oxi hóa Vì phản ứng để phân biệt đisacarit monosacarit có tín h khử Hóa chất: - Glucozơ 5%, mantozơ 5% - Chuẩn bị thuốc thử đồng axetat: Hòa tan 13,3g dồrug axetat 200 ml nước cất nóng, lọc, thêm vào dung dịch lọc 19 ntil axit axetic bàng (đậm đặc) Cách làm : Lấy nghiệm, cho vào ông I: linl dung dịch glucozơ 5%; ống II: lml mantozơ 5% Thêm vào ống lnnl thuốc thử đồng axetat, sau đế hai vào nồi cách tiủ y sôi 10 phút Quan sát, so sánh giải thích kết nhận Viết phương trình phản ứng Chú ý khơng đun q lâu, đisacarit bị thủy piân thành monosacarit cho phản ứng dương tính e) Phản úng tráng gương (tạo thành bạc kim loại) Các mono - đisacarit khử bạc dạng muối thành bạic kim loại (Ag+ -> Ag) Cách làm : Cho vào ống nghiệm lml dung dịch AgN03 5% Thêm giọt amoniac, tạo thành kết tủa Sau tiêm amoniac đến vừa tan, cho tiếp vào 3ml dung dịch glucozd đun Quan sát Phản ứng xảy sau: 52 5°/i Và AgNO, + 3NH OH = [Ag(NH,)2 OH] + NH |NO;1 + 2H,0 CH2OH - (CHOH ) - c - H + [Ag(NH3)2]OH -> CH2OH-(CHOH)4 - c - ONH4 + Ag + NH3i + H, Phản útìg khử xanh metylen E>ưới tác dụng glucozơ, xanh metylen bị khử thành chất không: màu Xanh metilen (Dạng oxi hóa, màu xanh) + e + H -2e -211 H Lơco metiien (Dạng khử khơng màu) Hóa chất : Xanh metylen %, NaOH 5%, glucozơ % Ciách làm : Lấy hai ông nghiệm: O’ng I: cho 2ml nưỏc, thêm giọt xanh metylen 1% giọt VíaOH % Đun sôi - quan sát ốĩng II: Làm thay nước cât dung dịch lucoz (CHOH)4 - (COOH)2 + K,Fe(CN)e + H20 (kali ferixianua) (kali feroxianua) Phản ứng dùng để định lượng đường khử Hóa chất: K3Fe(CN)6l%> KOH 5%, glucozd %, xanh metylen % Cách làm : Cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch K3Fe(CN)6 %, ml KOH 5%, lml glucozd % Đun, quan sát Thêm giọt xanh metylen, quan sát h) Sự tạo thành họp chất vòng s ố phản úng màu đặc trưng chúng Dưói tác dụng axit vô đặc nhiệt độ cao, monosacarit có sơ"cacbon phân tử lớn bị nước tạo thành hợp chất vòng: từ pentozơ tạo thành fucfurol, từ hexozơ tạo thành oximetylfucfurol: —7—— ! H-C-OH H-c-H HO-C-H H C - CH o H -c-cr,, o H HO Pentozd H * c -c r „ HC \ / cr H Fucfurol Fucfurol oximetylfucfurol đểu phản ứng với hợp chất fenol a-naftol, timol, antron để tạo thành hợp chất màu đặc trưng Ngoài ra, chúng củng khác khả phản ứng với sơ' chất Do dùng phản ứng để phân biệt anđozơ xetozd, pentozơ hexozơ 54 Phản ứng Xêliưanôp (phản ứng xetozơ với rezoxin) Khi đun dung dịch fructozơ (hoặc xetohexozơ khác) với HC1 (có thuốc thử) tạo thành oximetylfucfurol, hợp chất n*à' phản ứng VỚI rezoxin tạo thành hợp chất có màu đỏ tỉhẫm Trong điêu kiện thí nghiệm, anđozơ củng cho phản ứng chậm, ngược lại xetozơ cho phản ứng sau 30 giâ/, nhanh gấp nhiêu lần so với andozd Vì phản ứng Xêl.vanôp coi phản ứng đặc trưng xetozơ cỉ ùrg làm sở cho phương pháp định lương fructozơ Có thể xác đim cường độ màu sản phẩm phản ứng máy so màu q ugng điện vối kính lọc bước sóng 490nm Hóa chát: - Dung dịch fructozơ 0,5%, glucozd 0,5% - Chuẩn bị thc thử Xêlivanơp: hịa tan 0,05g rezoxin tror.g 10 ml dung dịch HC1 N Cách làm : Lấy hai ông nghiệm, cho vào ống lml thuôc thủ Xêlivanôp Thêm vào ống I: - giọt dung dịch fructozơ 0,5%, lác đều, đặt vào nồi cách thủy sôi, sau 30 giây lấy quan sát xua't màu ống Thêm vào ống II: - giọt dung dịch glucozơ 0,5% làm tiếp ống I, theo dõi thời gian xuấ: màu ống Giải thích kết nhận Phản ứng với antron Khi kết hợp với antron, hợp chất vòng tạo thành từ hexozơ (dưới tác dụng H2S0 có thc thử) cho sảinphẩm ngưng tụ có màu xanh nước biển đặc trưng: o Sản phẩm ngưng tụ (màu xanh nước biển) Ox i metylf ufuroi Antron 55 Phản ứng với antron dùng làm sở cho phương pháp định lượng glicogen thơng dụng, glicogen dược xác định cách trực tiếp mà không cần phải qua thủy phân nên tiết kiệm nhiều thời gian Cường độ màu sản phẩm phản ứng xác định máy so màu quang điện với kính lọc màu đỏ (Ằ = 620nm) Hóa chất: - Glucozơ 1% % - Chuẩn bị thuốc thử antron: Hòa tan g tioure 50mg antron (đã kết tinh lại) 10 ml H2S 66 % nồi cách thủy 80- 90°c, lây để nguội, cho vào lọ nâu bảo quản tủ lạnh Thòi hạn sử dụng: - tuần Cách làm : Cho vào ống nghiệm 0,5ml glucozơ, thêm inl thuổc thử antron, lắc đều, để nhiệt độ phịng - ]5 phút, sau để nồi cách thủy sôi 15 phút (chú ý không để nước bắn vào làm đục dung dịch) Để nguội Quan sát màu tạo thành (có thể để thêm 30 phút chỗ tối cho cường độ màu đạt tới cực đại), giải thích Phản ứng Bial Khi có muối sắt, fucfurol tạo thành từ pentozơ (trong môi trường axit thuổc thử) phản ứng với ocxin tạo thành hợp chất màu xanh lục: Phản ứng vói ocxin phản ứng đặc trưng pentozơ, sở cho phương pháp định lượng pentozd theo Meibauin Cường độ màu sản phẩm phản ứng xác định máy so màu quang điện với kính lọc bước sóng 660nm Hóa chất: Dưng dịch pentozơ - % Chuẩn bị thuổc thử ocxin: hòa tan ,2 g ocxin 10 ml HC1 30%, thêm ,lg FeCl3 Giữ thuốc thử lọ nâu đậy kín 56 Cách làm : Cho vào ông nghiệm -2 nil thuốc thử ocxin, cỉun đ