Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, con người đang dần chinh phục và ứng dụng các lợi ích từ tự nhiên vào đời sống, đặc biệt là trong việc sản xuất màu sắc và thuốc Màu sắc tự nhiên đã trở thành một ngành công nghiệp quan trọng cần được khai thác Do đó, tôi xin trình bày tham luận về "Nghiên cứu thu cao tổng methanol và định danh thành phần hóa học của dịch chiết Dichlormethanee và Ethyl Acetate từ Hoa Đậu Biếc", nhằm làm rõ hơn về phẩm màu tự nhiên.
Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dụng quy trình chiếc tách thu nhận thành phần hóa học từ Hoa Đậu biếc và Định danh thành phần có trong Hoa Đậu biếc.
- Chiếc tách màu Hoa Đậu biếc để ứng dụng vào sản xuất và phối màu với các thành phần khác để thu được sản phẩm thương mại.
Phương pháp nghiên cứu
- Lấy mẫu, xử lý, sơ chế mẫu.
- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý.
- Chiết tách thu phẩm màu và các dịch chiết.
- Phương pháp sắc ký khí (GC-MS) để định danh thành phần hóa học.
- Phương pháp AAS để xác định hàm lượng kim loại nặng.
Bố cục đề tài
Bố cục gồm 3 phần: Tổng quan, phương pháp và đối tượng, kết quả và bàn luận.
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Đậu biếc
Cây Đậu biếc (Clitoria ternatea) là loài thực vật thân thảo, dây leo, có nguồn gốc từ Đông Nam Á và được trồng phổ biến tại Ấn Độ cho y học cổ truyền Cây có thân mảnh, lá kép với 5-7 lá chét hình trái xoan và hoa màu xanh tím hoặc xanh lam đậm, nở quanh năm Ở Việt Nam, Đậu biếc được trồng làm cảnh và cải tạo đất, trong khi rễ và hạt của cây được sử dụng trong y học dân gian với tác dụng lợi tiểu và làm dịu Hoa Đậu biếc chứa anthocyanin, một loại flavonoid an toàn, thường được dùng làm phẩm màu hữu cơ cho thực phẩm Ngoài ra, hoa còn có lợi cho sức khỏe như chống lão hóa, ngăn ngừa ung thư, và tăng cường miễn dịch.
Công trình nghiên cứu về loài hoa Đậu biếc
In 1990, Norihiko Terahara and his colleagues identified six main anthocyanin ternatins present in the flowers of the CL species, designated as A1, A2, B1, B2, D1, and D2 These anthocyanin structures closely resemble that of Delphinidin-3-malonylglucoside, featuring D-glucose and p-coumaric acid units at the 3’ and 5’ positions The structure of Delphinidin-3-malonylglucoside is illustrated in Figure 1.2.
Hình 1.2 Bộ khung chung của 6 loại anthocyanin ternatin
Cấu trúc của 6 loại anthocyanin ternatin được tổng hợp ở Bảng 1.1 và có cấu chung củaHình 1.2.
Bảng 1.1 Sáu loại ternatin có trong hoa loài CL
Kazuma (2003) nghiên cứu và định danh được 4 hợp chất anthocyanin từ cánh hoa Đậu biếc có bộ khung được thể hiện ởHình 1.3 và được tổng hợp ởBảng 1.2.
Hình 1.3 Cấu trúc chung của 4 anthocyanin
Bảng 1.2 Một số loại anthocyanin khác có trong hoa loài CL
Delphinidin-3-O-(2”-O--rhamnosyl-6”-O- malonyl)--glucoside) rhamnosyl malonyl
Trong đó rhamnosyl là tên của gốc đường a-L-rhamnose và malonyl là dẫn xuất của acid malonic.
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là hoa Đậu biếc khô, được mua từ Shopee Sau khi nhận hàng, hoa được phơi khô thêm 15 phút và được bảo quản trong hộp nhựa kín, ở nơi khô ráo.
Hình 2.1 Nguyên liệu hoa Đậu biếc
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày ởBảng 2.1.
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc
1 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Dichlometane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2.2.3 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) được trang bị tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II, tọa lạc tại số 2, đường Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
- Thiết bị đo AAS của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II tại số 2, đường Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
- Máy UV-VIS của khoa Hóa học, Đại học Sư Phạm Đà Nẵng.
Trong lĩnh vực thí nghiệm và nghiên cứu, các thiết bị như tủ sấy, lò nung, bộ chiết hồi lưu, bếp cách thủy, pipet, ống đong, bình định mức, chén sứ, cốc, nhiệt kế, cân phân tích, bình hút ẩm, tủ hút, thiết bị cô quay chân không, bình tam giác, phễu chiết, phễu thủy tinh và giấy lọc đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của các quy trình thí nghiệm Sử dụng đúng các thiết bị này không chỉ giúp nâng cao chất lượng nghiên cứu mà còn tiết kiệm thời gian và nguồn lực.
2.3.1 Phương pháp xác định thông số hóa lý của nguyên liệu
2.3.1.1 Xác định độ ẩm a Nguyên tắc
Sử dụng nhiệt độ cao để loại bỏ hoàn toàn hơi nước trong mẫu nguyên liệu Từ sự chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy, ta có thể tính toán hàm lượng nước có trong mẫu nguyên liệu Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho quá trình này cũng rất quan trọng.
Chén sứ, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích chính xác đến 0.001. c Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 chén sứ đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 100 - 105 o C trong 30 phút Sau khi sấy, cho chén vào bình hút ẩm đến khi đạt nhiệt độ phòng và cân khối lượng ban đầu (m0) Tiếp theo, cho vào mỗi chén m gam bột nguyên liệu, dàn đều và cân lại để có khối lượng chén cộng với nguyên liệu (m1) Đem chén chứa nguyên liệu vào tủ sấy ở 105 o C trong 1 giờ 30 phút, sau đó lấy mẫu ra, cho vào bình hút ẩm và cân lại Lặp lại quá trình sấy và cân cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không vượt quá 0.001 gam, ghi lại khối lượng cuối cùng (m2) Hàm lượng nước sẽ được xác định theo công thức.
Trong đó: m1: khối lượng của chén sứ và mẫu trước khi sấy (g); m2: khối lượng của chén sứ và mẫu sau khi sấy (g); m: khối lượng của mẫu nguyên liệu (g).
2.3.1.2 Xác định hàm lượng tro a Mục đích
Mục đích xác định hàm lượng tro của nguyên liệu là để đánh giá khối lượng chất phi hữu cơ không cháy còn lại sau quá trình nung mẫu ở nhiệt độ cao Nguyên tắc của phương pháp này giúp phân tích thành phần khoáng chất trong nguyên liệu.
Nguyên tắc tro hóa hoàn toàn mẫu thực vật được thực hiện bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ cao từ 450-500°C trong 7 giờ cho đến khi khối lượng không thay đổi, theo phương pháp tro hóa khô Trong quá trình nung, các thành phần hữu cơ sẽ bị đốt cháy thành CO2 và hơi nước, trong khi các thành phần vô cơ còn lại chủ yếu là các oxit kim loại.
Chén sứ, lò nung, bình hút ẩm, bếp điện, cân phân tích. d Cách tiến hành
Mẫu hoa Đậu biếc sau khi sấy sẽ được than hóa sơ bộ trên bếp điện cho đến khi không còn khói Sau đó, mẫu than hóa được nung ở nhiệt độ 450-500 °C trong 7 giờ để đảm bảo không bay hơi kim loại Khi quá trình tro hóa hoàn tất, chén sứ chứa mẫu sẽ được đưa vào bình hút ẩm đến khi đạt nhiệt độ phòng và sau đó cân trên cân phân tích để ghi lại khối lượng Tiếp theo, chén sứ sẽ được nung thêm 30 phút, sau đó ghi lại khối lượng Quá trình này sẽ được lặp lại cho đến khi sự chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không vượt quá 0.001g Hàm lượng tro của hoa Đậu biếc sẽ được tính theo công thức đã quy định.
Trong đó: m3: khối lượng của chén sứ và mẫu sau khi nung (g) m0: khối lương của chén sứ (g) m: khối lượng của nguyên liệu ban đầu (g)
%H: hàm lượng tro trong mẫu (%)
2.3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng a Mục đích
Các loại thực vật thường chứa một lượng kim loại nặng nhất định, có thể gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe con người nếu tích trữ lâu dài Do đó, các dược liệu phải tuân thủ quy định về giới hạn hàm lượng kim loại nặng an toàn Việc xác định hàm lượng này giúp đánh giá mức độ an toàn khi sử dụng thực phẩm hoặc dược liệu Nếu hàm lượng kim loại nặng thấp, chúng an toàn cho người dùng; ngược lại, nếu hàm lượng cao, cần sử dụng với mức độ phù hợp.
Để vô cơ hóa mẫu, cần sử dụng các loại acid có tính oxi hóa mạnh như HNO3 và H2SO4 Sau khi vô cơ hóa, mẫu sẽ được phân tích bằng phương pháp AAS Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho quá trình này cũng rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
Bình định mức, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. d Cách tiến hành
Sau khi tro hóa, mẫu được hòa tan bằng HNO3 2N (pha từ acid HNO3 68%) và lọc qua giấy lọc để loại bỏ cặn không tan Dung dịch sau đó được định mức lên 50ml trong bình định mức, tạo ra mẫu dung dịch trong suốt Mẫu này cùng với ống mẫu trắng (HNO3 2N) được đem đi phân tích hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm kỹ thuật đo lường tiêu chuẩn chất lượng II, Đà Nẵng Công thức tính hàm lượng kim loại nặng trong mẫu ban đầu được áp dụng để xác định kết quả.
Trong đó: m: khối lượng mẫu hoa Đậu biếc trước khi tro hóa (g)
C (mg/kg): Hàm lượng kim loại năng tính theo mg/kg
C (mg/l): Hàm lượng kim loại nặng tính theo mg/L
V: Thể tích của bình định mức (ml)
2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
Phương pháp AAS (Spectroscopy hấp thụ nguyên tử) hoạt động dựa trên nguyên lý hấp thụ ánh sáng, khiến nguyên tử chuyển sang trạng thái kích thích Khi ánh sáng có bước sóng phù hợp chiếu vào, nguyên tử hấp thụ năng lượng và phát ra bức xạ, tạo ra phổ đặc trưng Quá trình này làm tăng năng lượng lớp vỏ ngoài của nguyên tử, dẫn đến sự chuyển động mạnh mẽ của các electron và tăng cường tính từ của nguyên tử Kết quả là, sự phát xạ này tạo ra các mã phổ khác nhau, phản ánh các đặc tính riêng biệt của từng nguyên tố.
2.3.2.2 Sơ đồ của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử được thể hiện trong Hình 2.2
Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân tích là thiết bị tạo ra ánh sáng đơn sắc, chủ yếu chiếu vào đám hơi nguyên tử tự do để thực hiện quá trình phân tích.
Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích chuyển đổi mẫu từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của các nguyên tử tự do thông qua nhiệt độ Đám hơi này là môi trường hấp thụ bức xạ, tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử Có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu hiện nay.
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa, sử dụng khí C2H2 và không khí nén, hoặc N2O2, gọi là F-AAS.
+ Kỹ thuật nguyên tử hóa ngọn lửa, sử dụng lò đốt điện, gọi là ETA-AAS.
Hình 2.2 Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
2.3.3 Phương pháp chiết tách thu nhận cao chiết từ mẫu thực vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện 2 phương pháp chiết tách là ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) và chiết phân đoạn (chiết lỏng – lỏng).
2.3.3.1 Phương pháp ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) a Dụng cụ, hóa chất
Methanol (CH3OH), bình cầu 1000ml, ống sinh hàn, bếp cách thủy, giấy lọc, máy cất quay chân không áp suất thấp. b Cách tiến hành
Cho nguyên liệu hoa Đậu đã cắt nhuyễn vào bình cầu 1000ml và đổ methanol sao cho dung môi ngập bề mặt nguyên liệu Lắp ống sinh hàn, mở hệ thống nước, đặt bình cầu vào bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ để dung môi sôi nhẹ Dung môi sẽ bốc hơi, ngưng tụ tại ống sinh hàn và chảy xuống Sau khi chiết xong, để nguội bình cầu, tháo ống sinh hàn, và lọc dịch chiết qua vải lọc 1-2 lần, sau đó qua giấy lọc 2-3 lần để loại bỏ cặn Dịch chiết sau khi lọc sẽ được cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không dưới áp suất thấp và cân xác định khối lượng.
2.3.3.2 Phương pháp chiết phân đoạn (Chiết lỏng – lỏng) a Dụng cụ, hóa chất
- Dụng cu: phễu chiết 250ml, bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 500ml, máy cô quay chân không, bếp cách thủy, bình penicillin.
- Hóa chất: Dichlormethane, Ethyl acetate, muối Na2SO4khan
Hình 2.3 Phương pháp chiết lỏng – lỏng b Cách tiến hành
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1 Độ ẩm mẫu nguyên liệu Độ ẩm mẫu nguyên liệu được xác định theo mục 2.3.1 và kết quả thể hiện trên Bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của nguyên liệu Hoa Đậu biếc
Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy độ ẩm chênh lệch nằm trong khoảng cho phép 10 - 15%, cho phép mẫu hoa Đậu biết có thể sử dụng lâu dài mà không bị hư hỏng hay mốc Do đó, mẫu hoa này có thể được sử dụng trong chiếc tách và trong các nghiên cứu.
3.1.2 Xác định hàm lượng tro
Mẫu sau khi xác định độ ẩm được đem đi than hóa sơ bộ và tro hóa trong vòng
7 tiếng Bằng phương pháp định lượng đã nêu ở chương 2, hàm lượng tro của nguyên liệu Hoa Đậu biếc được xác định và tổng hợp ởBảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro của nguyên liệu Hoa Đậu biếc
Hàm lượng tro trung bình (%) 10.525
Hàm lượng tro trung bình của bột nguyên liệu Hoa Đậu biếc đạt 10.525%, cho thấy sự hiện diện của các chất vô cơ không bay hơi trong nguyên liệu này.
3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng
Mẫu tro hóa được hòa tan trong HNO3 2N, sau đó lọc để loại bỏ cặn và định mức lên 50ml Hàm lượng kim loại nặng được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Trung tâm kỹ thuật đo lường tiêu chuẩn chất lượng II, Đà Nẵng Kết quả được tổng hợp trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Hàm lượng một số kim loại nặng có trong Hoa Đậu biếc
STT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả
(mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg)
Căn cứ vào quy chuẩn Việt Nam QCVN 8-2:2011/BYT, theo thông tư số 02/2011/TT-BYT ngày 13 tháng 01 năm 2011, hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô được quy định rõ ràng Trong đó, các kim loại như chì (Pb) cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.
Hàm lượng Cu, Cr và As trong nguyên liệu Hoa Đậu biếc khô thấp hơn mức tối đa cho phép, tuy nhiên hàm lượng Zn lại cao hơn quy chuẩn cho phép Sự khác biệt này phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và nguồn nước Do đó, cần lưu ý và áp dụng biện pháp sử dụng Hoa Đậu biếc với lượng phù hợp.
3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách
3.2.1 Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng
Cho khoảng 10 gam (mo) nguyên liệu hoa Đậu biếc đã được cắt nhỏ và V (ml)
Cho CH3OH vào bình cầu 1000ml và lắp ống sinh hàn, tiến hành đun hồi lưu ở 75°C bằng bếp cách thủy cho 5 mẫu thí nghiệm với thể tích lần lượt là 75ml, 100ml, 125ml, 150ml, và 175ml Sau 60 phút, lấy dịch chiết ra, lọc qua vải và giấy lọc để loại bỏ cặn, sau đó đo thể tích dịch chiết (Vdc).
Để xác định toàn bộ lượng chất tan trong dịch chiết, trước tiên, chuẩn bị một bình định mức đã sấy khô và biết trước khối lượng Hút 10ml dung môi methanol tinh khiết vào bình định mức và cân để thu được khối lượng của 10ml dung môi methanol (m1) Tiếp theo, sử dụng một bình định mức khác đã sấy khô, hút 10ml dịch chiết vào bình và cân để có khối lượng của 10ml dịch chiết (m2) Cuối cùng, áp dụng công thức m3 = m2 - m1 để tính toán lượng chất tan (m3) có trong dịch chiết.
10 × V dịch chiết (ml) Lượng chất tan ở mỗi thí nghiệm được xác định và tổng hợp tạiBảng 3.4.
Quá trình khảo sát tỉ lệ rắn lỏng nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho từng thể tích dung môi, trong đó dung môi càng nhiều thì lượng chất bán dẫn được chiết xuất càng lớn Sự chuyển dịch chất từ mẫu hoa vào dung môi xảy ra khi các phân tử dung môi, như methanol, bắt đầu sôi và thấm dần vào hoa Đậu Biếc Khi ngâm ở nhiệt độ nhất định, methanol vượt qua điểm cân bằng, len lõi vào các vị trí mà chất nền trong hoa để lại, từ đó chiết xuất được lượng chất đặc hữu có trong hoa.
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn lỏng
STT mo(g) Vdm(ml) m1(g) m2(g) Vdc(ml) m3(g)
Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy khi chiết hồi lưu nguyên liệu hoa Đậu biếc bằng dung môi methanol, tỉ lệ tối ưu là 1:10, với 10 gam nguyên liệu và 100ml dung môi, cho lượng chất tan cao nhất Do đó, tỉ lệ này sẽ được chọn trong giai đoạn chiết thứ hai.
Cho khoảng 10 gam (mo) nguyên liệu hoa Đậu biếc đã được cắt nhỏ và 100ml
Cho CH3OH vào bình cầu 1000ml, lắp ống sinh hàn và thực hiện đun hồi lưu ở nhiệt độ 75 oC bằng bếp cách thủy cho 6 mẫu thí nghiệm với các thời gian khác nhau.
Sau 30, 60, 90, 120 và 150 phút, tiến hành lấy dịch chiết ra khỏi bình cầu Tiếp theo, lọc dịch chiết bằng vải lọc và giấy lọc để loại bỏ cặn từ nguyên liệu Cuối cùng, đo thể tích dịch chiết (Vdc) để xác định kết quả.
Để xác định lượng chất tan trong dịch chiết, đầu tiên, chuẩn bị một bình định mức đã sấy khô và biết trước khối lượng Hút 10ml dung môi methanol tinh khiết vào bình định mức và cân để thu được khối lượng của 10ml dung môi methanol (m1) Tiếp theo, chuẩn bị một bình định mức khác đã sấy khô, hút 10ml dịch chiết vào bình và cân để có khối lượng của 10ml dịch chiết (m2) Cuối cùng, áp dụng công thức m3 = m2 - m1 để tính toán toàn bộ lượng chất tan (m3) có trong dịch chiết.
10 × V dịch chiết (ml)Lượng chất tan ở mỗi thí nghiệm được xác định và tổng hợp tại Bảng 3.5.
Quá trình khảo sát thời gian đóng vai trò quan trọng trong việc xác định điều kiện tối ưu của sự tan rã chất, với tỉ lệ rắn lỏng cho biết lượng chất tan tối đa trong một thể tích nhất định Thời gian, được hiểu như chu kỳ xoay của mặt trời quanh trái đất, ảnh hưởng đến sự tồn tại và tương tác của các chất trong môi trường Khi có đồng hồ, các khái niệm về thời gian được quy chuẩn, với các mốc thời gian như 12 giờ trưa và 18 giờ hoàng hôn Ý nghĩa của thời gian trong quá trình này là mọi vật chất đều có khối lượng và thời gian, trong đó khối lượng thể hiện sự hiện diện và thời gian là khoảng cắt của sự tồn tại với môi trường Sự tương tác giữa các chất như hoa Đậu Biếc và methanol phụ thuộc vào thời gian, vì chỉ có thời gian mới giúp xác định thời điểm tối ưu cho sự tương tác này.
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thời gian
(phút) mo(g) Vdm(ml) m1(g) m2(g) Vdc(ml) m3(g)
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy khi chiết hồi lưu nguyên liệu Hoa Đậu biếc bằng dung môi methanol với tỉ lệ 1:10 (10 gam nguyên liệu chiết với 100ml dung môi), thời gian tối ưu để chiết là 2 giờ (2.040 g) Tuy nhiên, do sự chênh lệch không đáng kể về thời gian, nghiên cứu chọn 1 giờ làm tiêu chuẩn.
Cho khoảng 10 gam (mo) nguyên liệu hoa Đậu biếc đã được cắt nhỏ và 100 ml
Cho CH OH vào bình cầu 1000ml và lắp ống sinh hàn Tiến hành đun hồi lưu trong 60 phút cho 5 mẫu thí nghiệm ở các nhiệt độ 71°C, 66°C và 61°C.