ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Nhóm đối tượng nghiên cứu bao gồm phụ nữ trong độ tuổi sinh sản từ 18-45 tuổi, những người đã trải qua ít nhất hai lần thai chết lưu liên tiếp Các nguyên nhân phổ biến gây thai chết lưu đã được loại trừ để đảm bảo tính chính xác của nghiên cứu.
- Có kết quả âm tính với hội chứng antiphospholipid;
- Không có bất thường tử cung, buồng trứng;
- Nội tiết tố bình thường (FSH, LH);
- NST đồ của cả hai vợ chồng bình thường;
- Tinh dịch đồ của chồng bình thường, tỷ lệ đứt gẫy DNA tinh trùng < 15%;
- Chiều cao ≥ 150cm và cân nặng ≥ 40kg hoặc có BMI từ 18,5 đến 25
- Không dùng các chế phẩm có acid folic ít nhất 4 tuần.
Nhóm chứng trong nghiên cứu bao gồm phụ nữ từ 18 đến 45 tuổi, những người đã sinh con khỏe mạnh trong lần mang thai đầu tiên, không có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu và không có tiền sử mang thai dị tật.
Bệnh nhân có bệnh lý tâm thần;
Bệnh nhân có bệnh lý suy giảm miễn dịch HIV/AIDS;
Bệnh nhân mắc bệnh lý mạn tính: đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh lý tim mạch; suy gan, suy thận.
2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 6 năm 2020.
Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại Học Y Hà Nội và Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng.
Cỡ mẫu được xác định dựa trên ba biến số nghiên cứu chính: nồng độ Hcy, nồng độ folat và đa hình gen MTHFR Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng đa hình vị trí 677 có liên quan chặt chẽ hơn đến các bất thường sinh sản so với vị trí 1298, do đó chúng tôi quyết định không tính cỡ mẫu dựa trên đa hình vị trí 1298.
2.2.2.1 Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen MTHFR C677T. Ước tính cỡ mẫu cho tỷ số nguy cơ giữa bệnh nhân có đa hình C677T và tình trạng thai chết lưu tái phát.
- Công thức tính cỡ mẫu: 107 n = ( r r +1 ) ( p)(1 − p)(Z β + Z α/2 ) 2
+ r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
+ p1 = 0,724 là tỷ lệ bệnh nhân có đa hình C677T trong nhóm phụ nữ có tiền sử thai chết lưu tái phát 108
+ p 2 = 0,528 là tỷ lệ bệnh nhân có đa hình C677T trong nhóm không có tiền sử thai chết lưu tái phát mà có thai bình thường ngay lần đầu mang thai 108
+ pp̅ là giá trị trung bình của p 1 và p 2
+ Zα/2, Zβ là hằng số được rút ra từ phân phối chuẩn Từ đó ta có được bảng giá trị (Z α/2 + Z β ) 2 như sau:
Bảng 2.1: Hằng số C liên quan đến sai sót loại I và II
- Từ các số liệu trên ta tính được cỡ mẫu như sau: n - Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β như sau:
Bảng 2.2: Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen liên quan đến thai chết lưu tái phát theo mức sai sót loại I và II β α
Lựa chọn α và β đều bằng 0,1 thì cỡ mẫu là n4 cho mỗi nhóm.
2.2.2.2 Ước tính cỡ mẫu theo biến đổi nồng độ Hcy huyết thanh
- Áp dụng công thức tính cỡ mẫu: 107 n = ( r + 1 ) σ 2 (Z β + Z α /2 ) 2 r(difference) 2
+ r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
+ σ = 2,61 độ lệch chuẩn rút ra từ nghiên cứu trước đó 109
+ Difference là sự khác biệt giữa giá trị trung bình của nồng độ Hcy giữa nhúm thai chết lưu tỏi phỏt và nhúm chứng (8,95 – 7,32) àmol/L 109,110
- Áp dụng công thức chúng ta thu được kết quả như sau:
Bảng 2.3 trình bày ước tính cỡ mẫu dựa trên sự biến thiên của homocystein liên quan đến sẩy thai và/hoặc thai chết lưu, tương ứng với các mức sai sót loại I (α) và loại II (β).
Lựa chọn α và β đều bằng 0,1 thì cỡ mẫu là nD cho mỗi nhóm
2.2.2.3 Ước tính cỡ mẫu theo nồng độ folat
- Áp dụng công thức tương tự công thức tính theo nồng độ Hcy.116
-r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
- σ = 9,00 độ lệch chuẩn rút ra từ nghiên cứu trước đó 111
-difference là sự khác biệt giữa giá trị trung bình của nồng độ folat huyết thanh của nhóm bệnh và nhóm chứng (22,00 – 27,00) nmol/L 111
Bảng 2.4 Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β β α
Dựa vào công thức tính cỡ mẫu và đánh giá tính khả thi của đề tài, chúng tôi đã chọn mức α = 0,10, β = 0,10 (power = 0,90) và xác định cỡ mẫu lớn nhất là 104 cho nhóm bệnh, đồng thời ước tính rằng 15% đối tượng có thể bị loại khỏi nghiên cứu Từ đó, cỡ mẫu lựa chọn cho nhóm bệnh được tính toán.
120, tỷ lệ nghiên cứu lựa chọn là 1:1 như vậy cỡ mẫu cho mỗi nhóm bệnh và nhóm chứng là 120, tổng số đối tượng tham gia nghiên cứu là 240.
Kết quả thực tế chúng tôi đã thu thập được 128 bệnh nhân nhóm bệnh và
Thu thập mẫu và biến số nghiên cứu
Bước đầu tiên trong nghiên cứu là thăm khám 128 đối tượng thuộc nhóm bệnh và 126 đối tượng thuộc nhóm chứng, những người đáp ứng tiêu chí chọn bệnh nhân và không vi phạm tiêu chuẩn loại trừ Thông tin được thu thập vào bệnh án nghiên cứu bao gồm tuổi, nghề nghiệp, tiền sử thai sản, số lần mang thai, số lần có bất thường thai sản, các xét nghiệm đã thực hiện, các bệnh mạn tính đã được chẩn đoán và các thuốc đã sử dụng.
Trong bước 2, đối tượng nghiên cứu sẽ được lấy máu tĩnh mạch vào hai ống: một ống chứa chất chống đông EDTA để thực hiện xét nghiệm gen, và một ống không có chất chống đông để tách huyết thanh phục vụ cho việc xét nghiệm Hcy và folat.
Đối với mẫu chống đông bằng EDTA, cần lưu trữ ở nhiệt độ -20°C và thực hiện tập trung tại bộ môn Y sinh học di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội để xác định đa hình gen MTHFR Mẫu xét nghiệm Hcy và folat nên được bảo quản lạnh và chuyển đến Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC trong vòng 4 giờ để ly tâm và thực hiện xét nghiệm Nếu không thể thực hiện xét nghiệm trong thời gian 4 giờ, cần ly tâm ngay để tách huyết thanh, bảo quản ở -20°C và thực hiện xét nghiệm trong vòng 7 ngày.
Bước 4: Mẫu phân tích gen MTHFR sẽ được tách chiết theo phụ lục 3 và xác định đa hình gen bằng phương pháp real time theo phụ lục 4 Đối với mẫu xét nghiệm Hcy và folat, thực hiện theo hướng dẫn trên hệ thống miễn dịch Achitech (phụ lục 5).
Kết quả phân tích gen MTHFR đã được xác thực thông qua việc kiểm tra 20 mẫu ngẫu nhiên, bao gồm 10 mẫu từ nhóm bệnh và 10 mẫu từ nhóm chứng, bằng phương pháp giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3500.
- Bước 6: phân tích các kết quả nồng độ Hcy, folat và đa hình gen
MTHFR để đánh giá kết quả nghiên cứu.
Độ tuổi sinh sản tối ưu ở phụ nữ là từ 18 đến 35 tuổi, trong khi khả năng sinh sản được xác định từ 15 đến 49 tuổi theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Tại Việt Nam, nghiên cứu tập trung vào nhóm tuổi 18-45 cho cả hai nhóm bệnh và chứng Phụ nữ từ 35 tuổi trở lên được xem là có nguy cơ cao trong việc mang thai và sinh con, do đó, chúng tôi cũng tiến hành phân tích và so sánh kết quả nghiên cứu giữa hai nhóm tuổi: dưới 35 tuổi và từ 35 tuổi trở lên.
Nghiên cứu của Jose GB Derraik (2016) cho thấy rằng phụ nữ có chiều cao dưới 155cm hoặc thấp hơn -2SD so với mức trung bình của dân số có nguy cơ sinh non cao hơn, với tỷ lệ odds ratio (OR) là 1,65 so với nhóm phụ nữ cao hơn.
Nghiên cứu năm 2013 chỉ ra rằng, tình trạng cân nặng của bà mẹ, bao gồm cả thiếu cân và thừa cân, có thể ảnh hưởng đến thai kỳ Mặc dù ở Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể về mối liên hệ giữa chiều cao và cân nặng của mẹ đối với quá trình mang thai, nhóm nghiên cứu đã thống nhất chọn phụ nữ có chiều cao ≥ 150cm và cân nặng ≥ 40kg, hoặc có chỉ số BMI từ 18,5 đến 25 cho cả nhóm bệnh và nhóm chứng.
Theo Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ (ASRM), thai chết lưu và sẩy thai tái diễn (mất thai tái diễn - RPL) được định nghĩa là tình trạng mất thai xảy ra từ hai lần trở lên, với sự xác nhận từ bác sĩ sản phụ khoa thông qua hồ sơ y tế.
- Nồng độ Hcy, folat huyết thanh;
- Các dạng đa hình gen MTHFR.
Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
2.4.1 Trang thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống phân tích tự động của Abbott (modul I2000 Architech plus).
- Máy li tâm Hettich model Rotanta 460.
- Máy giải trình tự Analyzer ABI3500.
- Máy li tâm để bàn Eppendorf (Đức).
- Máy quang phổ kế Nano drop 2000C.
- Micropipet (Eppendorf) các mức thể tích.
- Đầu côn các loại thể tích.
- Ống eppendorf thể tích 1,5 mL và 0,2 mL vô trùng.
Hóa chất cho xét nghiệm folat:
Microparticles: Chất chống Folate Binding Protein (chuột, kháng thể đơn dòng) kết hợp với vi hạt có ái lực với Folate Binding Protein (bò) trong dung dịch đệm TRIS, sử dụng chất ổn định protein như albumin huyết thanh bò và dê Nồng độ tối thiểu yêu cầu là 0,08% rắn, với chất bảo quản Sodium Azide và các tác nhân kháng khuẩn để đảm bảo tính ổn định.
+ Conjugate: Pteroic Acid (PTA) chất kết hợp có đánh dấu acridinium trong dung dịch đệm MES với chất ổn định protein (lợn) Nồng độ tối thiểu: 4 ng/mL.
+ Assay specific diluent: dung dịch pha loãng xét nghiệm Folat chứa dung dịch đệm borate Chất bảo quản: Sodium Azide và các tác nhân kháng khuẩn.
+ Pre treatment reagent 1: Folate Pre-Treatment Reagent 1 chứa potassium hyfroxide.
+ Pre treatment reagent 2: Folate Pre-Treatment Reagent 2 chứa dithiothreitol (DDT) trong dung dịch đệm acid acetic với EDTA.
+ Specimen diluent: Folate Specimen Diluent chứa dung dịch đệm TRIS với chất ổn định protein (albumin huyết thanh người) Chất bảo quản: Sodium Azide.
+ Kit thuốc thử Architech Hcy gồm 4 lọ: vi hạt (Microparticles), chất liên hợp (Conjugate), men (Enzym), chất khử (redutant).
Một số dung dịch quan trọng khác bao gồm chất kích hoạt (triger), tiền kích hoạt (pre-triger), dung dịch đệm, dung dịch rửa máy, cũng như các dung dịch định chuẩn Hcy và huyết thanh kiểm tra.
+ Hóa chất tách chiết: DNA Qia gen blood mini kit.
+ Taq 2X Master Mix (New England Biolab, Ipswich, MA).
+ ABI Big Dye Terminator v 3.1 Sequencing Standard Kit (AppliedBiosystems, Foster City, CA).
Quy trình kỹ thuật
2.5.1 Quy trình xét nghiệm Hcy, folat
- Xét nghiệm Hcy và folat đều thực hiện trên máy miễn dịch tự động Architech của Abbott theo hướng dẫn của phụ lục 5.
Hình 2.1 Mô phỏng các bước trong quy trình xét nghiệm Hcy và folat 2.5.2 Kiểm soát chất lượng và báo cáo kết quả Kiểm soát chất lượng
- Mẫu nội kiểm được thực hiện đầu ngày theo lịch quy định gồm ba mẫu
QC bao gồm Control L, Control M và Control H, là các mẫu QC dạng nước cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 độ C Trước khi tiến hành kiểm tra chất lượng, hóa chất QC phải được lấy ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đồng thời cần trộn đều trước khi sử dụng.
Kiểm soát kết quả nội kiểm là quá trình đánh giá kết quả phân tích QC hàng ngày dựa trên các quy tắc của Westgard Các quy tắc này bao gồm 8 quy tắc thường dùng như 1 2s, 1 3s, R 4s, 2 2s, 4 1s, 10 x, cùng với việc nhận diện hiện tượng lệch (Shift) và hiện tượng trượt (Trend) Việc áp dụng đúng các quy tắc này giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả phân tích.
Để đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm, cần thực hiện việc hiệu chuẩn định kỳ theo thời gian khuyến cáo, đặc biệt sau khi thay lô hóa chất mới, bảo dưỡng máy móc ảnh hưởng đến hệ thống phân tích, hoặc khi kết quả kiểm soát chất lượng không đạt yêu cầu.
Kết quả và báo cáo kết quả
Theo dõi kết quả từ máy phân tích là rất quan trọng Cần kiểm tra các lỗi cảnh báo và nếu có nghi ngờ về kết quả, hãy xem xét lại máy móc và hóa chất Chạy lại các thử nghiệm để xác nhận tính chính xác của kết quả.
- Khoảng tham chiếu: (package insert của nhà sản xuất)
+ Khoảng tham chiếu: 3.1 – 20.5 ng/mL Homocystein:
+ Khoảng tham chiếu cho nữ: 4,44 -13,56 μmol/L
2.5.3 Phát hiện đa hình gen MTHFR
- Mẫu máu toàn phần từ các đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA DNA được tách từ máu bằng kít tách chiết DNA Qiagen blood mini kit.
- Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được xác định bởi máy Nanodrop, tỷ lệ
OD 260/280 và 260/230 có kết quả từ 1,8 đến 2,0 là mẫu DNA đạt tiêu chuẩn.
- Sử dụng bộ kit real time PCR SNP-Express-RT của hãng Lytech (Moscow, Russia) Phân tích đa hình gen được thực hiện trên máy Biorad CF96 (USA)
Bảng 2.5 Thành phần phản ứng
Master Mix: Taqman probe FAM, HEX, mồi F, mồi R, dNTP, Taq polymerase
Bảng 2.6 Chu kì nhiệt của phản ứng realtime PCR
Phân tích kết quả: Chu kì ngưỡng (Ct) xuất hiện trước chu kì 30 được đánh giá là đạt chất lượng.
Chất huỳnh quang HEX (màu xanh lá cây) được kết hợp với probe đặc hiệu tại vị trí C677 hoặc A1298 của gen MTHFR, trong khi chất huỳnh quang FAM (màu xanh lam) được gắn với probe đặc hiệu tại T677 hoặc C1298 của gen MTHFR.
- Đồng hợp tử bình thường: tín hiệu huỳnh quang màu HEX vượt đường base line trước chu kì 30, tín hiệu màu FAM không vượt ngưỡng base line.
- Dị hợp tử đa hình: Cả màu HEX và FAM đều có tín hiệu vượt đường base line trước chu kì 30.
- Đồng hợp tử đa hình: tín hiệu huỳnh quang màu FAM vượt đường base line trước chu kì 30, tín hiệu màu HEX không vượt ngưỡng base line.
2.5.3.2 Phương pháp giải trình tự
DNA được tách từ máu toàn phần bằng kít DNA Qiagen blood mini kit theo quy trình 10 bước của nhà sản xuất Sau đó, DNA trong mẫu bệnh phẩm được khuếch đại qua phản ứng PCR Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa Ethanol/EDTA Phản ứng giải trình tự sử dụng kit BigDye ® Terminator v3.1 (Applied Biosystems Inc) Quá trình giải trình tự diễn ra một chiều, và sản phẩm sau giải trình tự tiếp tục được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol/EDTA và điện di.
Máy phân tích gen ABI3500 (ABI) được sử dụng để giải trình tự DNA, với kết quả được phân tích thông qua phần mềm DNA Sequencing v5.1 của ABI Các kết quả này sau đó được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Gene Bank.
Bảng 2.7 Trình tự mồi của phản ứng sequencing
Thành phần phản ứng bao gồm:
- Genomic DNA: 25 àl chứa 25–50 ng.
Bảng 2.8 Chu kì nhiệt của sequencing
Màu sắc của các đỉnh tín hiệu huỳnh quang tương ứng với các loại nucleotide như sau: Adenin (A) hiển thị màu xanh lá cây, Cytosin (C) có màu xanh dương, Thymine (T) mang màu đỏ, và Guanin (G) thể hiện màu đen.
Kết quả phân tích gen MTHFR tại vị trí 677 cho thấy ba kiểu gen khác nhau: đồng hợp tử bình thường với một đỉnh màu xanh dương (CC), dị hợp tử với một đỉnh màu xanh dương và một đỉnh màu đỏ (CT), và đa hình đồng hợp tử với một đỉnh màu đỏ (TT).
Kết quả gen MTHFR tại vị trí 1298 có thể được phân loại như sau: đồng hợp tử bình thường với 1 peak màu xanh lá cây (AA), dị hợp tử với 1 peak màu xanh lá cây và 1 peak màu xanh dương (AC), và đa hình đồng hợp tử với 1 peak màu xanh dương (CC).
Xây dựng mô hình tiên lượng
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Nhóm đối tượng nghiên cứu bao gồm phụ nữ trong độ tuổi sinh sản từ 18-45 tuổi, những người đã trải qua ít nhất hai lần thai chết lưu liên tiếp Các nguyên nhân gây thai chết lưu phổ biến đã được loại trừ trong quá trình nghiên cứu.
- Có kết quả âm tính với hội chứng antiphospholipid;
- Không có bất thường tử cung, buồng trứng;
- Nội tiết tố bình thường (FSH, LH);
- NST đồ của cả hai vợ chồng bình thường;
- Tinh dịch đồ của chồng bình thường, tỷ lệ đứt gẫy DNA tinh trùng < 15%;
- Chiều cao ≥ 150cm và cân nặng ≥ 40kg hoặc có BMI từ 18,5 đến 25
- Không dùng các chế phẩm có acid folic ít nhất 4 tuần.
Nhóm chứng trong nghiên cứu bao gồm phụ nữ từ 18 đến 45 tuổi, những người đã sinh con khỏe mạnh trong lần mang thai đầu tiên Các đối tượng này không có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu hay mang thai dị tật.
Bệnh nhân có bệnh lý tâm thần;
Bệnh nhân có bệnh lý suy giảm miễn dịch HIV/AIDS;
Bệnh nhân mắc bệnh lý mạn tính: đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh lý tim mạch; suy gan, suy thận.
2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 6 năm 2020.
Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại Học Y Hà Nội và Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC.
Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng.
Cỡ mẫu được xác định dựa trên ba biến số nghiên cứu chính: nồng độ Hcy, nồng độ folat và đa hình gen MTHFR Các nghiên cứu trước đây cho thấy đa hình vị trí 677 có liên quan chặt chẽ hơn đến các bất thường sinh sản so với vị trí 1298, do đó chúng tôi đã không lựa chọn tính cỡ mẫu theo đa hình vị trí 1298.
2.2.2.1 Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen MTHFR C677T. Ước tính cỡ mẫu cho tỷ số nguy cơ giữa bệnh nhân có đa hình C677T và tình trạng thai chết lưu tái phát.
- Công thức tính cỡ mẫu: 107 n = ( r r +1 ) ( p)(1 − p)(Z β + Z α/2 ) 2
+ r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
+ p1 = 0,724 là tỷ lệ bệnh nhân có đa hình C677T trong nhóm phụ nữ có tiền sử thai chết lưu tái phát 108
+ p 2 = 0,528 là tỷ lệ bệnh nhân có đa hình C677T trong nhóm không có tiền sử thai chết lưu tái phát mà có thai bình thường ngay lần đầu mang thai 108
+ pp̅ là giá trị trung bình của p 1 và p 2
+ Zα/2, Zβ là hằng số được rút ra từ phân phối chuẩn Từ đó ta có được bảng giá trị (Z α/2 + Z β ) 2 như sau:
Bảng 2.1: Hằng số C liên quan đến sai sót loại I và II
- Từ các số liệu trên ta tính được cỡ mẫu như sau: n - Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β như sau:
Bảng 2.2: Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen liên quan đến thai chết lưu tái phát theo mức sai sót loại I và II β α
Lựa chọn α và β đều bằng 0,1 thì cỡ mẫu là n4 cho mỗi nhóm.
2.2.2.2 Ước tính cỡ mẫu theo biến đổi nồng độ Hcy huyết thanh
- Áp dụng công thức tính cỡ mẫu: 107 n = ( r + 1 ) σ 2 (Z β + Z α /2 ) 2 r(difference) 2
+ r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
+ σ = 2,61 độ lệch chuẩn rút ra từ nghiên cứu trước đó 109
+ Difference là sự khác biệt giữa giá trị trung bình của nồng độ Hcy giữa nhúm thai chết lưu tỏi phỏt và nhúm chứng (8,95 – 7,32) àmol/L 109,110
- Áp dụng công thức chúng ta thu được kết quả như sau:
Bảng 2.3 trình bày ước tính cỡ mẫu dựa trên sự biến thiên của homocystein liên quan đến sẩy thai và/hoặc thai chết lưu, tương ứng với các mức sai sót loại I (α) và loại II (β).
Lựa chọn α và β đều bằng 0,1 thì cỡ mẫu là nD cho mỗi nhóm
2.2.2.3 Ước tính cỡ mẫu theo nồng độ folat
- Áp dụng công thức tương tự công thức tính theo nồng độ Hcy.116
-r = 1 là tỷ số giữa nhóm chứng so với nhóm bệnh.
- σ = 9,00 độ lệch chuẩn rút ra từ nghiên cứu trước đó 111
-difference là sự khác biệt giữa giá trị trung bình của nồng độ folat huyết thanh của nhóm bệnh và nhóm chứng (22,00 – 27,00) nmol/L 111
Bảng 2.4 Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β β α
Chúng tôi đã áp dụng công thức tính cỡ mẫu với mức α = 0,10 và β = 0,10 (power = 0,90), dẫn đến việc lựa chọn cỡ mẫu lớn nhất là 104 cho nhóm bệnh Đồng thời, chúng tôi ước tính rằng 15% đối tượng có thể bị loại khỏi nghiên cứu, từ đó xác định được cỡ mẫu cần thiết cho nhóm bệnh.
120, tỷ lệ nghiên cứu lựa chọn là 1:1 như vậy cỡ mẫu cho mỗi nhóm bệnh và nhóm chứng là 120, tổng số đối tượng tham gia nghiên cứu là 240.
Kết quả thực tế chúng tôi đã thu thập được 128 bệnh nhân nhóm bệnh và
2.3 Thu thập mẫu và biến số nghiên cứu
Bước 1: 128 đối tượng thuộc nhóm bệnh và 126 đối tượng thuộc nhóm chứng sẽ được thăm khám và khai thác thông tin cho bệnh án nghiên cứu, dựa trên tiêu chí chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ Thông tin thu thập bao gồm tuổi, nghề nghiệp, tiền sử thai sản, số lần mang thai, số lần có bất thường thai sản, các xét nghiệm đã thực hiện, các bệnh mạn tính đã được chẩn đoán và các thuốc đã sử dụng.
Bước 2 trong quy trình nghiên cứu bao gồm việc lấy máu tĩnh mạch từ đối tượng nghiên cứu vào hai ống: một ống chứa chất chống đông EDTA để thực hiện xét nghiệm gen, và một ống không có chất chống đông để tách huyết thanh phục vụ cho xét nghiệm Hcy và folat.
Mẫu chống đông bằng EDTA cần được lưu trữ ở nhiệt độ -20°C và chuyển đến bộ môn Y sinh học di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội để xác định đa hình gen MTHFR Các mẫu xét nghiệm Hcy và folat phải được bảo quản lạnh và chuyển đến Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC trong vòng 4 giờ để thực hiện ly tâm và xét nghiệm Nếu không thể thực hiện xét nghiệm trong khoảng thời gian này, mẫu máu cần được ly tâm ngay, tách huyết thanh và bảo quản ở -20°C, thực hiện xét nghiệm trong vòng 7 ngày.
Bước 4: Mẫu phân tích gen MTHFR sẽ được tách chiết theo phụ lục 3 và xác định đa hình gen bằng phương pháp real time theo phụ lục 4 Đối với mẫu xét nghiệm Hcy và folat, thực hiện theo hướng dẫn trên hệ thống miễn dịch Achitech (phụ lục 5).
Kết quả phân tích gen MTHFR đã được xác thực qua 20 mẫu ngẫu nhiên, bao gồm 10 mẫu từ nhóm bệnh và 10 mẫu từ nhóm chứng, bằng phương pháp giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3500.
- Bước 6: phân tích các kết quả nồng độ Hcy, folat và đa hình gen
MTHFR để đánh giá kết quả nghiên cứu.
Độ tuổi sinh sản tốt nhất ở phụ nữ là từ 18 đến 35 tuổi, trong khi khả năng sinh sản được xác định trong khoảng từ 15 đến 49 tuổi theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Tại Việt Nam, độ tuổi nghiên cứu được chọn là từ 18 đến 45 tuổi cho cả hai nhóm bệnh và chứng Phụ nữ từ 35 tuổi trở lên được xem là có nguy cơ cao hơn trong việc mang thai và sinh con Do đó, chúng tôi cũng tiến hành phân tích và so sánh kết quả nghiên cứu giữa hai nhóm tuổi: dưới 35 tuổi và từ 35 tuổi trở lên.
Nghiên cứu của Jose GB Derraik (2016) cho thấy rằng phụ nữ có chiều cao dưới 155cm hoặc thấp hơn -2SD so với mức trung bình dân số có nguy cơ sinh non cao hơn, với tỷ lệ Odds Ratio (OR) là 1,65 so với nhóm phụ nữ cao hơn.
Nghiên cứu năm 2013 chỉ ra rằng các bà mẹ thiếu cân hoặc thừa cân có thể ảnh hưởng đến quá trình mang thai Mặc dù tại Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể về chiều cao và cân nặng của mẹ trong thai kỳ, nhóm nghiên cứu đã thống nhất chọn nhóm phụ nữ tham gia, bao gồm cả nhóm bệnh và nhóm chứng, với chiều cao ≥ 150cm và cân nặng ≥ 40kg, hoặc có chỉ số BMI từ 18,5 đến 25.
Theo Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ (ASRM), mất thai tái diễn (Recurrent Pregnancy Loss - RPL) được định nghĩa là tình trạng xảy ra khi một người phụ nữ trải qua hai lần mất thai trở lên, với sự xác nhận từ bác sĩ sản phụ khoa thông qua hồ sơ y tế.
- Nồng độ Hcy, folat huyết thanh;
- Các dạng đa hình gen MTHFR.
2.4 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
2.4.1 Trang thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống phân tích tự động của Abbott (modul I2000 Architech plus).
- Máy li tâm Hettich model Rotanta 460.
- Máy giải trình tự Analyzer ABI3500.
- Máy li tâm để bàn Eppendorf (Đức).
- Máy quang phổ kế Nano drop 2000C.
- Micropipet (Eppendorf) các mức thể tích.
- Đầu côn các loại thể tích.
- Ống eppendorf thể tích 1,5 mL và 0,2 mL vô trùng.
Hóa chất cho xét nghiệm folat:
Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Nghiên cứu này đã được thông qua hội đồng đạo đức của Trường Đại
Học Y Hà Nội theo quyết định số 208/ HĐĐĐĐHYHN ngày 30 tháng 12 năm 2016.
Trước khi tham gia nghiên cứu, tất cả bệnh nhân đều được thông báo chi tiết về lợi ích, quyền lợi và rủi ro liên quan đến nghiên cứu.
Nghiên cứu được thực hiện đúng mục tiêu, đảm bảo an toàn cho người bệnh, nhằm phục vụ cho sự nghiệp khoa học và nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu
Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy tuổi trung bình của nhóm chứng là 31,1 ± 4,67, trong khi nhóm bệnh là 30,5 ± 5,17 Sự phân tích cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về độ tuổi trung bình giữa hai nhóm (p > 0,05).
Bảng 3.2 So sánh nồng độ Hcy và folat huyết thanh theo tuổi
Từ bảng 3.2 cho thấy không có sự khác biệt giữa nồng độ Hcy và folat huyết thanh ở nhóm phụ nữ 0,05
Nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR
3.2.1 Nồng độ homocystein và folat huyết thanh ở nhóm nghiên cứu
Bảng 3.3 So sánh kết quả Hcy và folat của nhóm bệnh và nhóm chứng
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ trung bình của Hcy ở nhóm chứng là 7,64 ± 1,78 (μmol/L) và ở nhóm bệnh là 11,73 ± 6,08 (μmol/L), với sự khác biệt rõ rệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Trong khi đó, nồng độ folat ở nhóm chứng là 11,53 ± 3,21 (ng/mL) và nhóm bệnh là 11,45 ± 3,17 (ng/mL), không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,84).
3.2.2 Đánh giá đa hình gen MTHFR
3.2.2.1 Phát hiện đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR bằng phương pháp realtime PCR Để kiểm soát quá trình nhiễm chéo và đánh giá chất lượng bộ kit, mỗi lần chạy realtime PCR đều có kèm theo các chứng âm và chứng dương cho từng kiểu đa hình.
Hình 3.1: Chứng âm không có DNA
Mẫu chứng cho kết quả tốt, mẫu chứng âm không có DNA không có tín hiệu huỳnh quang chứng tỏ không có hiện tượng nhiễm chéo.
Hình 3.2 Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 677CC
Kết quả mẫu chứng kiểu gen MTHFR 677CC cho thấy một đường tín hiệu màu xanh lá cây rõ nét ở chu kỳ 22, cho thấy phân tích đạt kết quả tốt.
Hình 3.3 Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 1298AA
Kết quả mẫu chứng kiểu gen MTHFR 1298AA là một đường tín hiệu màu xanh lá cây lên ở chu kì 24 cho kết quả phân tích đạt yêu cầu.
Hình 3.4 Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 677CT
Kết quả xét nghiệm mẫu chứng dị hợp tử gen MTHFR 677CT cho thấy hai đường tín hiệu xuất hiện ở chu kỳ 26, bao gồm một đường tín hiệu màu xanh lam và một đường tín hiệu màu xanh lá cây.
Hình 3.5 Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 1298AC
Kết quả xét nghiệm mẫu chứng dị hợp tử gen MTHFR 1298AC cho thấy có hai đường tín hiệu xuất hiện ở chu kỳ 24, bao gồm một đường tín hiệu màu xanh lam và một đường tín hiệu màu xanh lá cây.
Hình 3.6 Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 677TT
Kết quả mẫu chứng đồng hợp tử gen MTHFR vị trí 677TT là một đường tín hiệu màu xanh lam lên ở chu kì 23.
Hình 3.7 Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 1298CC
Kết quả mẫu chứng đồng hợp tử gen MTHFR vị trí 1298CC là một đường tín hiệu màu xanh lam lên ở chu kì 23.
Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh phẩm cho thấy các đường tín hiệu và màu sắc tương tự như các mẫu chứng: nếu không có đa hình gen, sẽ chỉ có 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây; kiểu dị hợp tử sẽ hiển thị 2 đường tín hiệu, trong khi kiểu đa hình đồng hợp tử sẽ cho 1 đường màu xanh lam.
3.2.2.2 So sánh phương pháp giải trình tự gen với kết quả realtime PCR trong phát hiện đa hình gen MTHFR Để khẳng định kết quả của kỹ thuật realtime PCR khi xác định đa hình gen MTHFR chúng tôi đã so sánh với kết quả giải trình tự gen trên máy ABI
3500 Danh sách 20 mẫu phân tích đối chứng theo phụ lục 6.
Hình 3.8 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298AA (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12
Kết quả mẫu gen MTHFR 1298AA cho thấy tín hiệu màu xanh lá cây khi sử dụng phương pháp real time, và khi thực hiện giải trình tự, vị trí 1298 xuất hiện đỉnh màu xanh lá tương ứng với nucleotide A của kiểu gen AA.
Hình 3.9 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 20
Kết quả xét nghiệm gen MTHFR 1298CC cho thấy tín hiệu màu lam trong phương pháp real time, và khi áp dụng phương pháp giải trình tự, vị trí 1298 hiển thị một đỉnh màu xanh lam tương ứng với nucleotide C của kiểu gen CC.
Hình 3.10 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 677TT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12
Kết quả real time cho thấy đường tín hiệu màu xanh lam biểu thị mẫu có kiểu gen đồng hợp tử MTHFR 677TT Phân tích giải trình tự xác nhận vị trí 677 có đỉnh màu đỏ, tương ứng với kiểu gen đồng hợp TT.
Hình 3.11 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
677CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 56
Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR 677CC bằng phương pháp real time cho
Khi thực hiện phương pháp giải trình tự, đường tín hiệu màu xanh lá cây cho thấy vị trí 677 tạo ra một đỉnh màu lam tương ứng với nucleotide C của kiểu gen CC.
Hình 3.12 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298AC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 58
Kết quả mẫu cho thấy kiểu gen MTHFR dị hợp tử 1298AC được xác định bằng phương pháp real time với hai tín hiệu màu: xanh lá cây và xanh lam Qua phương pháp giải trình tự, tại vị trí 1298, có một đỉnh màu lam tương ứng với nucleotid C và một đỉnh màu xanh lá tương ứng với nucleotid A của kiểu gen AC.
Hình 3.13 Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 677CT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số
Kết quả xét nghiệm mẫu cho thấy kiểu gen MTHFR dị hợp tử 677CT được xác định bằng phương pháp real time với hai đường tín hiệu: một màu xanh lá cây và một màu xanh lam.
Việc chọn ngẫu nhiên 10 mẫu từ nhóm bệnh và 10 mẫu từ nhóm chứng đã cho thấy sự tương đồng 100% giữa hai phương pháp, khẳng định rằng kết quả của phương pháp realtime PCR là đáng tin cậy.
3.2.3 Đa hình gen MTHFR trên đối tượng nghiên cứu
Từ bảng 3.4 nhận thấy, tỷ lệ xuất hiện alen T ở nhóm chứng chỉ chiếm 14,29%, ở nhóm bệnh là 32,81% và tỷ lệ xuất hiện chung ở cả hai nhóm là 22,62%, p< 0,001.
Bảng 3.5 Phân bố kiểu gen MTHFR C677T trong nhóm nghiên cứu
Bảng 3.5 cho thấy sự khác biệt rõ rệt về phân bố kiểu gen giữa nhóm bệnh và nhóm chứng Cụ thể, kiểu gen C677CC (kiểu dại) chiếm 73,02% ở nhóm chứng nhưng chỉ 43,75% ở nhóm bệnh Ngược lại, kiểu gen đa hình đồng hợp tử 677TT chỉ có 1,59% ở nhóm chứng và 9,38% ở nhóm bệnh Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p18 àmol/L được coi là yếu tố nguy cơ gây mất thai, xuất hiện ở 4 phụ nữ trong nhóm nghiên cứu Puri M và cộng sự phát hiện nồng độ Hcy trung bình ở nhóm có tiền sử thai chết lưu tái phát là 16,1 àmol/L, cao hơn rõ rệt so với nhóm chứng Tăng nồng độ Hcy và thiếu vitamin B12 được xác định là yếu tố nguy cơ rõ rệt đối với tình trạng mất thai tái diễn Nghiên cứu của Liu C và cộng sự cũng chỉ ra rằng nồng độ Hcy cao ở phụ nữ mang thai có kết cục bất lợi, và việc bổ sung folat giúp giảm thiểu các biến cố sản khoa, bao gồm thai chết lưu Kết luận cho thấy nồng độ Hcy cao là yếu tố nguy cơ với bất thường sinh sản, liên quan đến tình trạng thiếu vitamin B như folat và vitamin B12 cùng với đa hình gen MTHFR.
Sự liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và đa hình gen
Khi so sánh nồng độ Hcy huyết thanh theo các đa hình gen MTHFR vị trí
Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt về nồng độ Hcy huyết thanh giữa các kiểu gen ở vị trí 1298 trong nhóm chứng và nhóm bệnh Tuy nhiên, nồng độ Hcy ở nhóm bệnh có sự khác biệt rõ rệt tại vị trí 677, cho thấy nồng độ Hcy có thể phụ thuộc vào các đa hình gen MTHFR tại vị trí này, với kiểu gen MTHFR 677TT có nồng độ Hcy cao hơn so với 677CT và 677CC Đối với nồng độ folat huyết thanh, không có sự khác biệt giữa các kiểu gen ở cả hai vị trí C677T và A1298C, cho thấy nồng độ folat và đa hình gen MTHFR có thể là những yếu tố độc lập trong việc tiên lượng nguy cơ thai chết lưu tái diễn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tích nồng độ homocystein, nồng độ folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR để xác định ngưỡng cắt của nồng độ homocystein trong dự đoán nguy cơ thai chết lưu tái diễn Mô hình hồi quy logistic đa biến và phương pháp suy luận Bayes được áp dụng để tối ưu hóa mô hình dựa trên chỉ số BIC Suy luận Bayes cho phép ước lượng mức độ tin tưởng vào giả thuyết trước và sau khi có bằng chứng, mặc dù không phải lúc nào cũng khách quan Mô hình với BIC thấp nhất được ưu tiên, cho thấy nồng độ folat huyết thanh không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm chứng Mô hình tối ưu bao gồm ba biến: nồng độ homocystein, đa hình MTHFR C677T và A1298C, với xác suất tiên lượng thai chết lưu tái diễn cao nhất là 77% Mô hình này đạt diện tích dưới đường cong AUC là 86,24%, cho thấy dữ liệu phù hợp Để kiểm tra chất lượng mô hình, chúng tôi sử dụng chỉ số Cook’s Distance và hat-values, với kết quả cho thấy các giá trị chủ yếu nằm trong khoảng nhỏ hơn 0,05.
Các giá trị 126, 163, 214, 215 và 225 được xem là ngoại lai trong dữ liệu, nhưng thực tế vẫn nằm trong giới hạn cho phép Mối tương quan giữa hat-values và studentized Residuals là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng mô hình Biểu đồ 3.12 minh chứng rằng chất lượng mô hình 155 là khá tốt, khi hầu hết các hat-values nằm trong khoảng -2 đến 2 của studentized Residuals.
Bảng đánh giá mô hình tiên lượng qua tỷ suất chênh OR cho thấy, đối tượng có kiểu gen A1298C và C677T với nồng độ Hcy huyết thanh lớn hơn 1 àmol/L có khả năng thai chết lưu tái diễn cao hơn 1,64 lần (khoảng tin cậy 95%: 1,41-1,96, p