LỜI CẢM ƠN Để nuôi lớn lên ngày bố mẹ hi sinh công sức nuôi nấng con, công lao to lớn không quên cảm ơn bố mẹ Để em bƣớc chân đến cánh cổng trƣờng đại học trải qua ngƣời thầy, ngƣời cô ngƣời không quảng ngày soạn trang giáo án, tìm tịi phƣơng thức dậy cho chúng em học điều em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Cho đến ngày hôm ngày em bƣớc chân khỏi cánh cổng trƣờng đại học để em làm đƣợc việc cơng ty , xí nghiệp , nhà nƣớc … Với kiến thức để làm tảng vào sống công việc sau bƣớc khởi trƣờng em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo viện công nghệ sinh trƣờng đại học lâm nghiệp tồn thể thầy, viện nhƣ thầy mơn giúp đỡ tận, tình bảo em suốt thời gian em học tập trƣờng Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô TS NGUYẾN THỊ HỒNG GẤM ngƣời cận kề bên em hƣớng dẫn bảo thời gian em suốt trình thực đề tài khóa luận, ngƣời động viên giúp đỡ giai đoạn khó khăn Ngồi tơi cịn may mắn có ngƣời bạn chịu đựng giúp đỡ tận tình cách chân thành ! Nhung cảm ơn bạn ! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu trầm hƣơng 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Sự phân bố trầm hƣơng tự nhiên 1.2 Tổng quan sản phẩm trầm hƣơng 1.2.1 Phân loại sản phẩm trầm hƣơng 1.2.2 Sự tạo trầm nhân tạo 1.3 Công dụng Trầm hƣơng 11 1.3.1 Trầm hƣơng làm dƣợc liệu quý 11 1.3.2.Trầm hƣơng chất định hƣơng 11 1.3.3 Trầm hƣơng vật dâng cúng thiêng liêng tôn giáo 12 1.4 Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng 12 1.4.1 Tạo trầm hƣơng việt nam 12 1.4.2 Trên giới 13 1.5 Tổng quan định danh nấm 14 1.5.1 Định danh nấm thơng qua hình tháí 14 1.5.2 Định danh nấm phƣơng pháp phân tử 14 PHẦN II MỤC TIÊU - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.1.1 Mục tiêu chung 15 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất phục vụ nghiên cứu 15 2.4 Phƣơng pháp phân lập nấm tạo trầm hƣơng 16 ii 2.4.1 Tiến hành xử lý mẫu 16 2.4.2 Chuẩn bị môi trƣờng phân lập 17 2.4.3 Tiến hành cấy mẫu theo dõi 18 2.4.4 Phƣơng pháp cấy chuyển (truyền) 19 2.5 Phƣơng pháp định danh nấm 19 2.5.1 Phƣơng pháp sơ định danh thơng qua đặc điểm hình thái nấm 19 2.5.2 Phƣơng pháp định danh tên loài phân tích phân tử 20 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết phân lập chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ Dó bầu 22 3.2 Kết định danh tên loài chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập đƣợc 22 3.2.1 Kết sơ định danh thông qua đặc điểm hình thái nấm 22 3.2.2 Đặc điểm chủng 3.4 25 3.2 Kết định danh tên lồi phân tích phân tử 26 3.2.1 Kết tách DNA tổng số Kết PCR 26 3.2.2 Kết giải trình tự gen xây dựng tiến hóa, xác định lồi 26 Kết luận 32 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 21 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh Dó bầu tiết nhựa Hình 1.2 Ảnh thân Dó bầu khoan lỗ tạo trầm hƣơng nhân tạo Hình 2.1 a, Hình thân gỗ Dó bầu, hình2.1.Hình ảnh điểm lấy mẫu 17 Hình 2.3 a, Đĩa mơi trƣờng chƣa cấy mẫu b, Đĩa môi trƣờng cấy mẫu vào đĩa18 Hình 3.1 Ảnh ba chủng nấm phân lập đƣợc 22 Hình 3.2 Ảnh hình thái bên ngồi soi dƣới kính hiển vi củng 1.2a 22 Hình 3.3 Ảnh nấm chủng 3.1 sau ngày phân lập 23 Hình 3.4 Ảnh tốc độ sinh trƣởng chủng nấm 3.1 24 Hình 3.5.Ảnh soi chủng 3.1 dƣới kính hiển vi 24 Hình 3.6.Hình thái bên ngồi chủng 3.4 25 Hình ảnh 3.7 Ảnh chụp chủng 3.4 dƣới kính hiển vi 25 Hình 3.8: Sản phẩm PCR 26 Hình 3.9 Sơ đồ tiến hóa chủng 1.2a 28 Hình 3.10 Sơ đồ tiến hóa chủng 29 Hình 3.11 Sơ đồ tiến hóa chủng 3.4 31 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Trầm hƣơng (Aquiliria) tên gọi chung cho chi thực vật thuộc họ Dó gồm 15 lồi Trầm hƣơng thực chất lƣợng dầu kết tinh gỗ Dó bầucó khả sinh loại sản phẩm đặc biệt gọi Trầm hƣơng hay Kì nam Trầm hƣơng có nhiều cơng dụng đƣợc biết sử dụng từ hàng ngàn năm qua, nhiều nƣớc giới Từ xƣa đến Trầm hƣơng Kì nam loại sản phẩm đặc biệt quý rừng mà thiên nhiên ƣu ban tặng cho ngƣời Chính mà Trầm hƣơng có giá trị kinh tế cao thị trƣờng Điều làm cho Dó bầu trở thành lồi thực vật đặc biệt đƣợc nhiều nhà khoa học ngƣời dân ý, có giá trị đặc biệt mặt nghiên cứu khoa học Việt Nam nói riêng nƣớc giới nói chung Tuy nhiên, nghiên cứu có tính hệ thống hình thành Trầm hƣơng Dó bầu vài thập niên gần Hầu hết kết nghiên cứu đƣợc công bố chƣa đƣa đƣợc quy trình tối ƣu nhƣ chế hình thành Trầm hƣơng để áp dụng rộng rãi sản xuất đại trà Trong với rừng nguồn trầm hƣơng tự nhiên ngày cạn dần.cùng với khai thác mức bừa bãi ngƣời làm cho lồi thuộc chi Aquilaria có khả cho Trầm bị cạn kiệt Ở Việt Nam ngƣời khai thác Trầm chặt đốn bừa bãi Dó bầu độ tuổi Với cách khai thác nhƣ thời gian ngắn có khả tạo trầm (thuộc họ Dó bầu) diệt chủng Trƣớc tình hình Hội Đồng Bộ Trƣởng (nay thuộc Chính Phủ) ban hành Nghị Định số 18-HDBT ngày 17 tháng 01 năm 1992 quy định danh mục thực vật rừng, động vật rừng quý có chế độ bảo vệ, xếp Dó bầu vào danh mục nhóm 1A, tức bảo vệ nghiêm ngặt Tình hình nƣớc ta có nhiều tổ chức, quan, cá nhân trồng Dó bầu đại trà, nhằm mục đích cải thiện kinh tế, phủ xanh đất trống đồi trọc, góp phần xóa đói giảm ngèo v.v… Tuy nhiên, phần lớn dự án giai đoạn trồng thử nghiệm gây tạo Trầm phƣơng pháp khác kết thu đƣợc chƣa đƣợc khả quan Mặt khác để Dó bầu mọc ngồi tự nhiên (ở rừng tự nhiên) khả cho Trầm hƣơng Dó bầu hạn chế (khoảng 10%) Chỉ số lí tác nhân từ bên ngồi tác động đến Dó bầu nhƣ mƣa, gió, sét đánh làm gãy thân, cành… qua vết thƣơng đó, vi sinh vật xâm nhiễm vào Và cảm ứng hình thành theo thời gian Nhƣ nhiều thời gian để hình thành trầm Vì đƣợc trí ban lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, môn Công nghệ tế bào - trƣờng Đại học Lâm nghiệp dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm, thực đề tài khóa luận ‘‘ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ LOẠI NẤM CĨ KHẢ NĂNG TẠO TRẦM HƢƠNG’’ để gậy tạo trầm PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu trầm hƣơng 1.1.1 Phân loại Cây Trầm hƣơng (Dó bầu) thuộc : Lớp (Class): Magnoliopsida Bộ (Order): Myrtales Họ (Family): Thymelaeaceae Chi Aquilaria có tất 24 loài (Species) khác gồm: 1.Aquilaria beccariana van Tiegh 2.Aquilaria hirta Ridl 3.Aquilaria microcarpa Baill 4.Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl 5.Aquilaria filaria (Oken) Merr 6.Aquilaria brachyantha (Merr) Hall.f 7.Aquilaria urdanetensis (Elmer) Hall.f 8.Aquilaria citrinaecarpa (Elmer) Hall.f 9.Aquilaria apiculata Elmer 10.Aquilaria parvifolia (Quis) Ding Hou 11.Aquilaria rostrata Ridl 12.Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte 13.Aquilaria banaense Pham-Hoang-Ho 14.Aquilaria khasiana H.Hallier 15.Aquilaria subintegra Ding Hou 16.Aquilaria grandiflora Bth 17.Aquilaria secundana D.C 18.Aquilaria moszkowskii Gilg 19.Aquilaria tomentosa Gilg 20.Aquilaria bailonii Pierre ex Lecomte 21.Aquilaria sinensis Merr 22.Aquilaria apiculata Merr 23.Aquilaria acuminate (Merr) Quis 24.Aquilaria yunnanensis S.C Huang Tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) vừa phát loài thứ 25 cao nguyên Trung Bộ năm 2005 có tên khoa học Aquilaria rugosa L.C.Kiet & PJ.A [ ] Cây Dó bầu thuộc loài Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte 1.1.2 Sự phân bố trầm hương tự nhiên a) Trên giới Trong tự nhiên giống Aquilaria, tức Trầm hƣơng, phân bố khắp nƣớc vùng Châu Á từ Trung - Cận Đông, Nam Á, Trung Quốc nƣớc Đông Nam Á… Ở vùng Trung - Cận Đông Trầm hƣơng mọc nhiều rặng núi hiểm trở phía Nam Ả Rập Ở Trung Quốc Trầm hƣơng mọc tập trung số tỉnh Miền Nam, nhiều Quảng Đông Hải Nam, nhƣng chất lƣợng trầm khơng cao (Thổ Trầm) Vùng có lồi chính, là: Aquilaria grandiflora Bth, Aquilaria sinensis Merr, Aquilaria yunnanensis S.C Huang [2 ] Ở vùng Nam Á Trầm hƣơng có nhiều Ấn Độ, chủ yếu lồi Aquilaria khasiana H Hallier Vùng Đơng Nam Á bao gồm quốc gia: + Malaysia: Có lồi: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria microcarpa Baill, Aquilaria hirta Ridl Aquilaria rostrata Ridl.[12] + Thái Lan: Chủ yếu loài Aquilaria subintegra Ding Hou + Indonesia (tập trung chủ yếu đảo Sumatra) có lồi: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria hirta Ridl, Aquilaria microcarpa Baill, Aquilaria moszkowskii Gilg.[15,17] + Philippin: Bao gồm loài: Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl, Aquilaria filaria (Oken) Merr, Aquilaria apiculata Merr, Aquilaria acuminate (Merr.) Quis + Singarpore: Chủ yếu loài Aquilaria hirta Ridl + Campuchia, Trầm hƣơng thƣờng mọc phân tán khu rừng nằm ven biển, có lồi là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte + Ở Việt Nam: Trầm hƣơng có tất lồi, là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte, Aquilaria banaense PhamHoang-Ho loài Aquilaria rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler (do tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy cao nguyên Trung Bộ) Đây loài thứ Việt Nam thứ 25 giới.[ 4] b) Ở Việt Nam Ở Việt Nam Trầm hƣơng phân bố địa bàn nhƣ: + Phía Bắc: Hồng Liên Sơn, Vĩnh Phú, Hịa Bình, Hà Tây, Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Bắc + Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú n, Bình Thuận, Khánh Hịa [14 ] + Tây Nguyên: Gia Lai, Kontum, ĐăLăk, Lâm Đồng + Miền Nam: Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang, Đảo Phú Quốc Đặc biệt thấy nhiều suốt chiều dài dãy Trƣờng Sơn, song khai thác bừa bãi dân, đến thấy Dó bầu vùng xa xơi, đầu nguồn rừng già Trong tự nhiên Dó bầu thƣờng mọc vùng rừng nhiệt đới ẩm địa hình có độ cao so với mực nƣớc biển từ 300-1000m, nhƣng tập trung nhiều độ cao 700m thích hợp nơi có độ dốc từ 25 trở lên Tuy nhiên thực tế Dó bầu sinh trƣởng tốt nơi có độ cao dƣới 40m so với mực nƣớc biển Nhìn chung, Dó bầu lồi thực vật ƣa sáng, mọc rải rác khu rừng nhiệt đới, mọc độ cao 50-1200m Nơi cao đƣợc tìm thấy núi Chu Yang Sinh thuộc tỉnh Đăklăk Việt Nam Thƣờng Dó bầu mọc riêng lẻ nhƣng có tìm thấy nhóm 5-6 mọc gần Theo Lê Mộng Chân (1995), Dó bầu mọc nhanh, lƣợng tăng trƣởng đƣợc ghi nhận 1-1,2m/năm chiều cao, 1,2-1,5cm/năm đƣờng kính Cây đƣợc tuổi trở lên có khả cho hoa kết Dƣới tán rừng thứ sinh Dó bầu tái sinh Thƣờng gặp Dó bầu tái sinh khoảng trống rừng nhƣ bìa rừng ven đƣờng mịn … Ngồi Dó bầu có khả tái sinh chồi tốt Việc nhân giống phƣơng pháp chiết cành, ghép cành, có tác động thuốc kích thích đƣợc thực hiện, phƣơng pháp nuôi cấy mô phổ biến rộng rãi.[16] 1.2 Tổng quan sản phẩm trầm hƣơng 1.2.1 Phân loại sản phẩm trầm hương Sản phẩm trầm hƣơng thực chất tên gọi bao gồm tinh dầu gỗ Dó bầu Sự tạo trầm q trình tích lũy tinh dầu số khu vực mô gỗ bên thân dƣới tác động yếu tố tự nhiên, theo chế đặc biệt Quá trình xảy thời gian dài đến chục năm Nói cách khác, tƣợng tụ trầm kết tiến trình bệnh lý diễn mơ gỗ Dó bầu Dó bầu hƣơng, cịn gọi Dó Xót, Dó Bả Mía hay Hàn, có khả kết tụ trầm chất lƣợng cao thiên nhiên Dó bầu trắng, Dó bầu đen, Dó bầu Lƣỡi trâu có khả tụ trầm thấp (dùng làm nhang) Theo Vũ Văn Cần Vũ Văn Dũng (1978) phân loại nguồn gốc hai loại Trầm Trầm sinh (Trầm lấy từ sống ) Trầm rục (Trầm lấy từ đốn hay chết lâu ngày) Trầm sinh lấy từ cịn sống thƣờng có màu sáng, ngƣợc lại Trầm rục đƣợc lấy từ có màu tối đen xì hay màu cánh dán thƣờng ngƣơi ta lấy Trầm rục từ gốc rễ Giá Trầm sinh cao Trầm rục - lần có Trầm thu đƣợc - 10 kg Trầm Ngoài phần gỗ xung quanh khối Trầm kỳ bị biến đổi nhều với so với xuất rải rác chi Trầm xen ké sợi gỗ thƣờng gọi Tok tiếng Khmer Tok cháy có mùi hƣơng thơm đặc biệt đƣợc dùng làm Nhang Theo Phillipir (1997) dạng Trầm sản phẩm Trầm đƣợc ghi nhận Khi nấm mọc nhiều bề mặt đĩa ta cấy chuyển (truyền) ,các đĩa bị nhiễm bỏ nấu mơi trƣờng cấy lại, cấy giống nấm 2.4.4 Phương pháp cấy chuyển (truyền) Là phƣơng bƣớc trung gian phân lập mẫu làm dòng nấm phân lập đƣợc Giai đoạn giúp ta xác định riêng dòng nấm đƣợc phân lập  Các bƣớc cấy truyền (cấy chuyển ) - Kiểm tra đĩa cấy quan sát phát triển cảu sợi nấm từ miếng mẫu cấy - Xác đinh xem có nhiều loại nấm mọc lên hay không - Cấy chuyển ( truyền ) sợi nấm mọc đƣợc 5mm đến 1cm Cứ cấy lại chuyển nhiều lần sợi nấm giống đặc điểm hình thái thơi cấy đƣa mẫu bảo quản để tiện cho nghiên cứu thí nghiệm sau 2.5 Phƣơng pháp định danh nấm 2.5.1 Phương pháp sơ định danh thơng qua đặc điểm hình thái nấm - Quan sát hình thái sợi màu sắc sợi loại môi trƣờng PG, PT1 N1 phân lập nhân giống - Quan sát hình thành bào tử biến đổi màu sắc bào tử nấm mắt thƣờng - Quan sát hình thái bào tử nấm dƣới kính kiển vi vật kính, 40, 100 sau + Lấy mẫu lên lam kính nhỏ nhuộn xanh metyelen để phút rửa nƣớc + Nhuộn tiếp dung dịch lugol phút rửa lại nƣớc + Rửa mẫu côn 30 giây Soi dƣới kính hiển vi quan sát bắt màu bào tử kính hiển vi, sau dựa vào khóa phân loại để xác định lồi dựa vào khóa phân loại để phân loại sơ chủng phân lập 19 2.5.2 Phương pháp định danh tên loài phân tích phân tử a) Phương pháp tách DNA tổng số Ngiền nhanh 0,2 g mẫu cối chầy sứ nitơ lỏng tạo thành bột thật mịn, sau chuyển vào ống eppendorf 2ml, giữ đá Bổ sung 800 l đệm chiết, lắc ủ 65oC (cứ 15 phút đảo lần) Giữ mẫu nhiệt độ phòng thời gian 10 phút Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc giữ nhiệt độ phòng thời gian 10 phút Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian 15 phút 4oC Dùng pipet hút chuyển dịch sang ống eppendorf 1,5 ml Bổ sung thể tích tƣơng đƣơng Isopropanol tuyệt đối (lạnh) đảo nhẹ, giữ mẫu đá 30 phút Ly tâm 12000 vòng/phút thời gian 15 phút 4oC Loại dịch nổi, rửa DNA cách thêm 500 l cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút thời gian phút 4oC sau nhẹ nhàng loại bỏ ethanol 10 Làm khơ DNA quạt gió, máy hút chân khơng 11 Hồ tan 100 l H2O khử ion 12 Sau DNA đƣợc hoà tan hồn tồn bổ sung l RNase (10mg/ml) Giữ sản phẩm 37oC thời gian 13 Điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0,8% - Cặp mồi dùng để xác định loài nấm phản ứng PCR Trình tự (5’-3’) Tên mồi ITS1 ITS4 16sF 16sR TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT b) Phương pháp PCR 20 Kích thƣớc sản phẩm PCR ~700 bp ~1400 bp Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR STT Tổng Thành phần Nƣớc deion khử trùng Maste mix Template (100ng/µl) Mồi F 10pmol Mồi R 10pmol Thể tích (µl) 10 1 20 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây Gắn mồi 55 30 giây Kéo dài chuỗi 72 30 giây 30 Hoàn tất kéo dài 72 phút Kết thúc phản ∞ ứng c) Phương pháp giải trình tự hiệu chỉnh trình tự: Sản phẩm PCR đƣợc điện di gel agarose 0,8% tinh QiAquick gel extraction kit (Qiagen, Đức) Sản phẩm đƣợc sử dụng làm khn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xuôi mồi ngƣợc) với mồi NL1/NL4, sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 đọc kết hệ thống ABI 3500 XL (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide chủng nấm đƣợc so sánh với trình tự có Genbank, sử dụng phần mền BLAST NCBI (website http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Trình tự DNA sau đọc đƣợc hiệu chỉnh mắt với trợ giúp phần mềm ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại bỏ vùng tín hiệu nhiễu Các trình tự phân tích đƣợc xếp thẳng hàng phần mềm Bioedit v7.0.5.2 (Hall, 1999), Clustal W (Thompson et al., 1997), geneDoc 2.7 (Nicholas et al., 1997) Các vùng khơng có khả xếp bị loại bỏ trƣớc phân tích 21 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ Dó bầu Khi tiến hành phân lập mẫu thân Dó bầu có tạo Trầm hƣơng mơi trƣờng phân lập khác Dựa vào đặc điểm nhận dạng hình thái màu sắc bên ngồi nhận dạng dạng bào tử xác định đƣợc chủng nấm tạo Trầm hƣơng, ký hiệu chủng 1.2a; 3.1 3.4 Chủng 1.2 a Chủng 3.1 Chủng 3.4 Hình 3.1 Ảnh ba chủng nấm phân lập K ế tq u đ ả ịn h da n h têlo icá h ủ n gấ m tạ o T m rầ h n g p h n â p lậ đ ợ c 3.2.1 Kết sơ định danh thông qua đặc điểm hình thái nấm * Đặc điểm hình thái chủng 1.2a - Sau phân lập thành công tiến hành quan sát hình thành bào tử chủng loại, mơ tả đặc điểm hình thái bên ngồi quan sát dƣới kính hiển vi để xem hình thái ( mơi trƣờng P1 ) Hình 3.2 Ảnh hình thái bên ngồi soi kính hiển vi củng 1.2a 22 Hình thái bên ngồi: nấm mọc dạng hình trịn viền ngồi sợi nấm trắng xung quanh vào bào tử màu xanh có vách ngăn bào tử sợi nấm Hình thái soi dƣới kính hiển vi : bào tử hình trịn elip nối tiếp nhƣ sợi xích có màu suốt Theo nhƣ (Jaladaddin) năm 1997 chủng có ký hiệu 1.2a mang tƣơng đối đầy đủ đầy đủ đặc điểm hình thái bào tử, hình thái màu sắc chủng nấm Penecillium Nhƣ vậy, qua hình thái kết luận sơ chủng nấm có ký hiệu 1.2a thuộc chi Penecillium  Đặc điểm hình thái chúng 3.1 Sau phân lập thành cơng tiến hành quan sát hình thành bào tử chủng loại, quan sát đặc điểm hình thái bên ngồi quan sát dƣới kính hiển vi để xem hình thái bào tử Tiến hành định danh lồi Đƣợc phân lập môi trƣờng PT1 đồng thời cấy chuyển mơi trƣờng PT1 Hình 3.3 Ảnh nấm chủng 3.1 sau ngày phân lập Sau phân lập đƣợc qua thời gian theo dõi : nấm mọc thành hình trịn, sợi nấm trắng bắt đầu xuất bào tử đen Sau cấy chuyển quan sát hình thái màu sắc 23 Sau ngày Sau ngày Sau ngày Hình 3.4 Ảnh tốc độ sinh trưởng chủng nấm 3.1 Sau quan sát sợi nấm dƣới kính hiển vi Hình ảnh soi kính hiển vi Hình ảnh soi kính hiển vi nhuộn màu Hình 3.5.Ảnh soi chủng 3.1 kính hiển vi Qua quan sát: Sợi nấm sau cấy chuyển có màu trắng sau ngày sợi ăn lan, tên bề mặt thạch sới nấm có màu hồng nhạt sắc ngày thứ sợi nấm biến đổi màu hồng tím, mơi trƣờng bị biến đổi màu tím Quan sát dƣới kính hiển vi: Các bào tử hình, elip, bán sợi nấm thay đổi nhiệt độ phòng Theo nhƣ (Burgess, Sazanne, Blulock, Blackhouse) đặc điểm hình thái bào tử nhƣ hình thái màu sắc Fusarium Nhƣ vậy, thơng qua hình thái kết luận sơ chủng nấm có ký hiệu 3.1 thuộc chi Fusarium 24 3.2.2 Đặc điểm chủng 3.4 Chủng đƣợc phân lập môi trƣờng N2 Quan sát mắt thƣờng thấy Hình 3.6.Hình thái bên ngồi chủng 3.4 Các sợi nấm mọc khơng theo hình dạng định mà mọc môt cách lan trải bề mặt môi trƣờng, sợi nấm trắng Hình thái soi dƣới kính hiển vi : bào tử hình trịn nằm xen sợi nấm, sợi nấm dang ống Hình ảnh 3.7 Ảnh chụp chủng 3.4 kính hiển vi Theo nhƣ (Jaladaddin) năm 1997 chủng có ký hiệu 1.2a mang tƣơng đối đầy đủ đầy đủ đặc điểm hình thái bào tử, hình thái màu sắc chủng nấm Nhƣ vậy, thơng qua hình thái kết luận sơ chủng nấm có ký hiệu 3.4 thuộc chi Neurospor 25 3.2 Kết định danh tên loài phân tích phân tử 3.2.1 Kết tách DNA tổng số Kết PCR Kết thu đƣợc cho thấy DNA tổng số thu đƣợc có nồng độ độ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR Sau thu đƣợc DNA tổng số đảm bảo chất lƣợng, đƣợc dùng làm khuôn để nhân phần vùng gen cặp mồi ITS1/ITS4 Kết nhân gen đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 2% M Hình 3.8: Sản phẩm PCR 1-2: sản phẩm PCR mẫu nấm 3: đối chứng âm mồi ITS 4: đối chứng âm mồi 16s M: Ladder 1kb Kết hình 3.2.1 cho thấy, sản phẩm PCR có kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc lý thuyết Chất lƣợng sản phẩm PCR đƣợc thể điện di có băng nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự Đối chứng âm không xuất băng 3.2.2 Kết giải trình tự gen xây dựng tiến hóa, xác định loài Sản phẩm PCR sau đƣợc tinh sử dụng làm DNA khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự Quá trình xác định trình tự đƣợc thực Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học hệ thống giải trình tự ABI 3500XL (Applied Biosystems) Phản ứng đọc trình tự đƣợc thực theo hai chiều phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp 26 Để xây dựng tiến hóa phƣơng pháp Maximum Likehooddữ liệu DNA đƣợc chuyển vào phần mềm Mega 6.0.6 (Tamura et al., 2013) chúng đƣợc thực với 1.000 lần lặp lại để xác định giá trị ủng hộ (bootstrap) (1) Chủng 1.2a Kết giải trình tự cho: GGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCC ATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCG TCCCCCCGGCGGGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGA GGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAG GGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAAT TCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACC AAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTCGTTATAGGTCTCAG ACTGCAACTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCCGTCGGCGGGCGCGGG GCCCGCCGAGGC Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng 1.2a có quan hệ gần gũi với lồi Penicillium citrinum có tƣơng đồn đến 100% 27 Hình 3.9 Sơ đồ tiến hóa chủng 1.2a Kết luận chủng 1.2a : Penicillium citrinum (2) Chủng 3.1 Kết giải trình tự cho: GCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATTCGAGGTCAACATTC AGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCGCTCTCCAGTTGCGA GGTGTTAGCTACTACGCAATGGAAGCTGCGGCGGGACCGCCACTGTA TTTGGGGGACGGCGTTGTGCCCGCAGGGGGCTTCCGCCGATCCCCAA CGCCAGGCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCA TGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGAT GATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGT TCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATT TATTTGCTTGTTTACTCAGAAGAAACATTATAGAAACAGAGTTAGGG GGTCCTCTGGCGGGGGCGGCCCGTGTTACGGGGCCGTCTGTT 28 Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng 3.1 có quan hệ gần gũi với loài Fusarium solani, Fusarium oxysporum Fusarium falciforme thuộc chi Fusarium tỷ lệ tƣơng đồng 100% Hình 3.10 Sơ đồ tiến hóa chủng Kết luận :chủng 3.1 Fusarium 29 (3) Chủng 3.4 Kết giải trình tự cho: CCCGCCGCACGACCATAGCGATGTAGAGTTACTACGCTCGGTGT GACTAGCGAGCCCGCCACTGATTTTGAGGGACCGCGGGCAGCCGCG GATCCCCAACGCAAGCAGAGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACA GGCATGCTCGCCAGAATACTGGCGAGCGCAATGTGCGTTCAAAGATT CGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCT GCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTT TGACTTATTTAAAAGTTTACTCAGAGAGACATAAAATATCAAGAGTT TAGTTTCGGCACTCCGGCGGGCAGCCTCCCGCGAGCGGGAGACCCGA GGATCCGGGAGGACCCGAGGGCCTTTCCGGACCGCCAGC Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng 3.1 có quan hệ gần gũi với loài Neurospora sitophila; Neurospora crassa, Neurospora tetrasperma; 30 Hình 3.11 Sơ đồ tiến hóa chủng 3.4 tỷ lệ tƣơng đồng 88% kết luận: Neurospora 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Phân lập đƣợc chủng nấm từ thân gỗ Dó bầu chủng từ bột chế phẩm tạo Trầm sử dụng phƣơng phát cấy chuyển làm đƣợc chủng nấm phân lập - Quan sát đƣợc hình thái bào tử mắt thƣờng kính hiển vi điện tử, dựa vào hình thái để bên ngồi để nhận dang nấm mà phân lập - Định danh đƣợc xác chủng nấm tạo Trầm hƣơng Penecilium, Fusarium Neurospora Kiến nghị Tiếp tục phân lập đinh danh thêm chủng nấm khác có khả tạo Trầm để dùng nấm phân lập để sản xuất chế phẩm tạo Trầm sinh học 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO - Boo C 1971 Fusarium nomechan globosum from subtropica Japan and the feffect different light condition on its condigogenisis Mycosciece 40 : - Đặc Đề tài nghiên cứu khả tạo Trầm hƣơng chế phẩm sinh học - Ngân Trần Hƣơng Kiến thức Trầm hƣơng 08/09/2018 - Ngyến Văn Thành , Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Bá giáo trình mơn nấm học - Vietsciences-Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lƣơng 11/07/2006 - Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam, Trung Tâm Nghiên Cứu Lâm - Theo (Jaladaddin) năm1997 đặc điểm hình thái bào tử, hình thái Dó bầu ... thực đề tài khóa luận ‘‘ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ LOẠI NẤM CÓ KHẢ NĂNG TẠO TRẦM HƢƠNG’’ để gậy tạo trầm PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu trầm hƣơng 1.1.1 Phân loại Cây Trầm hƣơng (Dó bầu) thuộc... - Định danh đƣợc tên lồi 02 chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập đƣợc 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ Dó bầu; - Định danh tên loài chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập. .. sau dựa vào khóa phân loại để xác định lồi dựa vào khóa phân loại để phân loại sơ chủng phân lập 19 2.5.2 Phương pháp định danh tên lồi phân tích phân tử a) Phương pháp tách DNA tổng số Ngiền