B GIÁO D C VÀ ÀO T O TR NG I H C C N TH TÓM T T LU N ÁN TI N S Chuyên ngành: Công ngh th c ph m Mã ngành: 62 54 01 01 HÀ TH TH Y VY S D NG TH T U TỌM TH CHÂN TR NG (Litopenaeus vannamei) CH BI N CH PH M GIẨU PROTEIN C n Th , n m 2019 CỌNG TRỊNH TR NG Ng ih C HOÀN THÀNH T I I H C C N TH ng d n: PGS TS Nguy n V n M i Lu n án đ c b o v tr c h i đ ng ch m lu n án ti n s c p tr ng H p t i: Phòng b o v lu n án ti n s , Tr ng i h c C n Th Vào lúc…… gi , ngày …….tháng……n m…… Ph n bi n 1: ………………………………………… Ph n bi n 2: ………………………………………… Ph n bi n 3: ………………………………………… Có th tìm hi u Lu n án t i - Trung tâm H c li u, Tr ng - Th vi n Qu c gia Vi t Nam i h c C n Th DANH M C CÁC CỌNG TRỊNH ẩ CỌNG B Hà Th Th y Vy, Tr n Thanh Trúc Nguy n V n M i, 2016 nh h ng c a dung môi th i gian k t t a đ n hi u qu tinh s ch s b enzyme protease trích ly t th t đ u tơm T p chí khoa h c Tr ng i h c C n Th , S chuyên đ : Nông nghi p (2016)(1): 9-17 Hà Th Th y Vy, Tr n Thanh Trúc Nguy n V n M i, 2018 Kh o sát đ c m enzyme protease th t đ u tôm th chân tr ng (Litopenaeus vannamei) sau trình tinh s ch s b T p chí khoa h c Tr ng i h c C n Th , S 54(1B) (2018): 28-36 Hà Th Th y Vy, Tr n Thanh Trúc Nguy n V n M i, 2018 Nghiên c u kích ho t enzyme protease n i t i t th t đ u tôm th (Litopenaeus vannamei) T p chí khoa h c Tr ng ih cC n Th , S 54(3B) (2018): 67-74 Ha Thi Thuy Vy, Tran Thanh Truc and Nguyen Van Muoi, 2018 Opitimazation of protein hydrolysis condition from shrimp head meat (Litopenaeus vannamei) using commercial alcalase and flavourzyme enzymes Can Tho University Journal of Science Vol 54, Special issue: 16-25 Nguy n V n M i Hà Th Th y Vy, 2018 Kh o sát u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme alcalase th y phân protein t th t đ u tôm th chân tr ng T p chí khoa h c Tr ng i h c C n Th , S chuyên đ 54(3B): 148-156 M U Tính c p thi t c a lu n án N m 2007, Vi t Nam gia nh p WTO - m t t ch c th ng m i l n nh t th gi i ây c h i t t cho nh ng b c ti n c a kinh t Vi t Nam, nh ng c ng không th tránh đ c nh ng thách th c mà t ch c đ t c ng nh s c nh tranh gay g t c a thành viên khác t ch c làm nh h ng đ n nhi u l nh v c kinh t , đ c bi t đ i v i l nh v c xu t kh u th y s n c a n c ta M t gi i pháp nâng cao n ng l c c nh tranh c a doanh nghi p c i thi n quy trình ch bi n, nâng cao n ng su t, t n d ng tri t đ ngu n ph ph m mà theo quan m s n xu t hi n đ i g i nguyên li u l i đ ch bi n s n ph m có giá tr gia t ng Trong nguyên li u l i ph i k đ n đ u v tơm th i q trình s n xu t tôm đông l nh, th ng chi m 50÷70% nguyên li u ban đ u ( V n Nam ctv., 2005; Shahidi and Synowiecki, 1991) N m 2017, s n l ng tôm th đ t 470,5 nghìn t n (61,41%), tơm sú 230,5 nghìn t n (38,59%) (http://www.vasep.com.vn), v i l ng ph ph m th i trình s n xu t chi m kho ng 45-55% kh i l ng tôm nguyên li u ây ngu n nguyên li u ti m n ng ch bi n có giá tr dinh d ng t t (Murueta et al., 2007) G n đây, vi c thu h i protein t nguyên li u th y s n tr nên ph bi n ngành công nghi p th c ph m ngu n ph ph m r ti n d i Th y phân protein làm gi m kích th c peptit, d ch th y phân ngu n axit amin có s n cho q trình sinh t ng h p protein (Gildberg and Stenberg, 2001), ngu n peptit có ho t tính sinh h c mang đ n ti m n ng đáng k d c ph m nh kh n ng ch ng oxy hóa, kh n ng ki m soát enzyme gây cao huy t áp (Dey and Dora., 2014a; Holanda et al., 2006; Ganugula et al., 2008) hay kh n ng ch ng đ t bi n gen có kh n ng gây ung th (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz et al.,2016) Trong ph ng pháp đ c s d ng đ thu h i protein bi n pháp sinh h c, đ c bi t b sung enzyme th ng m i n hình nh enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme (Chakrabarti, 2002; Gunasekaran et al., 2015; Randriamahatody et al., 2011; 2009; Dey and Dora, 2014a) nh m rút ng n th i gian th y phân nâng cao hi u qu th y phân protein c ng nh ch t l ng c a d ch th y phân thu nh n ngày đ c quan tâm nhi u h n Bên c nh đó, k t qu nghiên c u c a Hà Th Th y Vy ctv (2016) xác đ nh đ u tôm ch a h enzyme protease có kh n ng ho t đ ng m nh Do v y, vi c áp d ng mơ hình k t h p gi a enzyme th ng m i enzyme n i t i giúp s n xu t protein th y phân có hi u su t cao nâng cao tính ch t ch c n ng c a d ch protein thu nh n đ c, s d ng ch ph m th y phân giàu protein ch bi n th c ph m h ng đ y tri n v ng Nghiên c u xây d ng đ c quy trình cho ho t đ ng th y phân protein c a t h p enzyme s m m t h ng m i vi c c i ti n kh n ng thu h i nâng cao ch t l ng s n ph m protein có ho t tính sinh h c, đ ng th i gi m đáng k chi phí s n xu t nh m d n d n c i thi n giá tr th ng m i c a ph ph m tôm M c tiêu nghiên c u M c tiêu c a nghiên c u lu n án xác đ nh ch đ thích h p cho trình th y phân protein t th t đ u tôm th b ng enzyme protease n i t i enzyme th ng m i (enzyme alcalse/flavourzyme) đ thu nh n d ch ch ph m d ch protein th y phân Trên c s đó, enzyme protease n i t i đ c k t h p v i enzyme th ng m i th y phân th t đ u tôm th nh m gia t ng hi u su t trình th y phân nâng cao tính ch t ch c n ng c a d ch protein thu nh n đ c Sau x lý, ch ph m th y phân giàu protein t th t đ u tôm th đ c th nghi m nh ngu n nguyên li u b sung nh m c i thi n ch t l ng cho m t s th c ph m ch bi n tiêu bi u đ ng b ng sông C u Long N i dung - Xác đ nh m t s tính ch t c b n c a enzyme protease thô thu nh n đ c b ng vi c trích ly t ngu n nguyên li u th t đ u tôm th sau tinh s ch s b - Kh o sát y u t c b n có nh h ng đ n hi u qu th y phân protein c a th t đ u tôm b ng vi c s d ng protease n i t i - Xác đ nh u ki n th y phân protein (pH, nhi t đ th y phân, n ng đ enzyme) t th t đ u tôm b ng enzyme protease ngo i bào (alcalase, flavourzyme) phù h p T đó, đ xu t bi n pháp k t h p enzyme protease th ng m i enzyme n i t i nh m gia t ng hi u qu th y phân protein th t đ u tôm - Xây d ng quy trình ch bi n ch ph m protein th y phân đánh giá kh n ng b o qu n s n ph m - ng d ng ch ph m th y phân giàu protein vào vi c nâng cao ch t l ng c a n c m m c i thi n kh n ng b o qu n khơ cá lóc m t n ng Ý ngh a khoa h c vƠ ý ngh a th c ti n c a lu n án Là cơng trình nghiên c u m i đ c th c hi n m t cách có h th ng, t n d ng đ c ngu n protein enzyme protease n i t i t nhiên đ thu nh n s n ph m an toàn, đóng góp nh ng d n li u khoa h c quan tr ng v kích ho t ho t đ ng c a h enzyme n i t i s d ng ngu n protein giàu dinh d ng c a ph ph m vào ch bi n th c ph m D a u ki n ho t đ ng c a enzyme n i t i, v i u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme th ng m i th t đ u tôm th đ ti n hành kh o sát kh n ng k t h p enzyme protease n i t i enzyme th ng m i Nghiên c u c ng xác đ nh đ c ph ng pháp k t h p thông s t i u cho qu trình t o d ch th y phân đ c v a có giá tr dinh d ng v a có ho t tính sinh h c (ho t tính ch ng oxy hóa); đ xu t ph ng pháp ng d ng d ch giàu đ m s n xu t pepton, h tr tiêu hóa t th t đ u tơm th vào trình s n xu t K t qu nghiên c u gi i pháp thi t th c t th c t s n xu t c a ngành ch bi n tôm đông l nh, t o s n ph m có giá tr gia t ng t ngu n ph ph m tơm, góp ph n phát tri n b n v ng công nghi p tôm c a Vi t Nam i m m i c a lu n án K t qu nghiên c u làm phong phú thêm nh ng hi u bi t v đ c m c ng nh thông s ho t đ ng c a enzyme n i t i hi n di n th t đ u c a tôm th chân tr ng T đó, kích ho t có hi u qu ngu n enzyme n i t i an tồn có s n th t đ u tôm th đ thu nh n d ch th y phân giàu ch t dinh d ng ho t tính ch ng oxy hóa cao ng th i, lu n án đ a ph ng pháp k t h p nh m t n d ng u m c a enzyme th ng m i d a thông s t i u cho ho t đ ng c a enzyme alcalase enzyme flavourzyme c ch t th t đ u tôm th , k t h p hi u qu enzyme n i t i enzyme th ng m i th y phân protein c a th t đ u tôm, xây d ng đ c quy trình cho ho t đ ng th y phân protein c a t h p enzyme S d ng ch ph m cô đ c giàu protein kh n ng ch ng oxy hóa vào m t s quy trình ch bi n th c ph m có hi u qu Qua đó, lu n án góp ph n đ nh h ng cho vi c ng d ng ngu n ph ph m q trình ch bi n tơm đông l nh n c ta nh m gi m thi u ô nhi m môi tr ng, nâng cao s c c nh tranh c ng nh giá tr m t hàng tôm th đông l nh K t c u c a lu n án Lu n án bao g m ph n: Ch ng 1: Gi i thi u (3 trang); Ph n n i dung g m ch ng (1) Ch ng 2: T ng quan tài li u (30 trang), (2) Ch ng 3: Ph ng pháp nghiên c u (27 trang v i 18 thí nghi m), (3) Ch ng 3: K t qu - Th o lu n (81 trang); Ph n K t lu n đ xu t (2 trang) Trong n i dung có 46 b ng 72 hình Bài vi t s d ng 255 tài li u tham kh o, bao g m 209 tài li u ti ng Anh, 46 tài li u ti ng Vi t T NG QUAN TÀI LI U Tôm th chân tr ng ph ph m ch bi n tôm đông l nh Tôm th chân tr ng Tơm th có tên khoa h c Litopenaeus vannamei, tr c Penaeus vannamei (Hernandez et al.,1997) Tên th ng dùng tôm th chân tr ng, tôm tr ng ho c tôm tr ng Thái Bình D ng Vi t Nam, tơm phân b v nh B c b , ven bi n mi n Trung Nam b Hi n nay, tôm đ c nuôi nhi u n c th gi i nh ài Loan, Trung Qu c, Vi t Nam Thành ph n dinh d ng Thành ph n sinh hóa th c đo đ đánh giá ch t l ng dinh d ng c a ngu n th c ph m Tơm th chân tr ng có giá tr dinh d ng cao th t tôm ch a nhi u protein, ch t béo th p v i khoáng ch t thi t y u cho c th nh canxi, natri, kali, phosphor Trong thành ph n protein c a tôm th chân tr ng có t ng s 18 axit amin đ c xác đ nh, axit amin thi t y u bao g m arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine valine Ngồi ra, cịn có axit amin khơng thi t y u nh alanine, asparagine, aspartic axit, cysteine, glutamic axit, glycine, proline, serine tyrosine (Gunalan et al., 2013) Trong đó, valine (23,72%) chi m t l t i đa, ti p theo lysine (13,42%) có vai trị quan tr ng vi c h p thu canxi, t o c b p, ph c h i sau ch n th ng, ph u thu t đ ng th i t ng h p hóc mơn, enzyme kháng th Methionine (13,06%) có g c l u hu nh giúp trung hòa g c t làm gi m m t s b nh t t c a ng i già lão hóa (Hoshi et al., 2001) Ngồi ra, hàm l ng s t tơm th chân tr ng có vai tr̀ quan tr ng đ i v i c th giúp ng n ng a tình tr ng thi u s t ho c m c ch ng b nh thi u máu, m t m i ho c khó th M c dù ch t béo chi m t l th p nh ng ch y u axit béo không no r t t t cho s c kh e nh eicosapentaenoic axit (EPA, 20:5n-3) docosahexaenoic axit (DHA, 22:6n-3) ng n ng a hình thành cholesterol (Pedrazzoli et al., 1998) Nh v y, t peptit axit amin thu đ c thơng qua q trình th y phân protein có th d n đ n s phát tri n c a th c ph m ch c n ng có nh h ng tích c c vi c trì s c kho ng i Ph ph m tôm th chân tr ng trình ch bi n Theo báo cáo t ng k t hàng n m c a T ng c c th y s n s li u c a VASEP, c c u xu t kh u c a m t hàng tôm sú tôm th nh ng n m g n có s thay đ i (B ng 2.1) B ng 2.1 Di n tích ni s n l N m 2013 2014 2015 2016 2017 ng tôm sú th qua n m Di n tích ni (ha) Tơm sú Tôm th 601,0 65,0 602,5 106,0 603,0 89,6 600.4 94,2 595,8 101,1 Ngu n: https://tongcucthuysan.gov.vn; http://www.vasep.com.vn S nl Tôm sú 268,0 264,0 268,3 260.0 270,5 ng (ngàn t n) Tôm th 273,0 395,0 327,0 390,0 430,5 S n l ng tôm th chân tr ng t ng v t b c theo t ng n m, s n l ng t ng đ ng ngh a v i s n l ng ph ph m t tôm th ngày gia t ng V i thành ph n đ u tôm chi m kho ng 25-30% kh i l ng nguyên li u nên hàng n m có kho ng 100 ngàn t n đ u tôm th đ c lo i trình ch bi n tôm th đông l nh Trong th t đ u tôm th , hàm l ng protein chi m kho ng 47,4% (Ngơ Th Hồi D ng, 2015), rõ ràng ngu n nguyên li u quan tr ng đ thu h i protein ng d ng ph ph m s n xu t Trong th p k qua, xu h ng t n d ng ph ph m tôm đ thu h i protein làm t ng giá tr c a thành ph n ph ph m đ c nhà khoa h c c ng nh n c quan tâm Ph ph m t tôm đ c s d ng đ phát tri n s n ph m ch t l ng cao có th s d ng làm th c n cho ng i ho c th m chí đ t o th c ph m ch c n ng có giá tr dinh d ng c bi t, ph ph m t tôm đ c nghiên c u kh n ng s n xu t oligopeptit axit amin có ch c n ng ch ng oxy hóa, h n ch t ng huy t áp, kháng khu n, 2.1.4.1 Trong l nh v c th c ph m i v i l nh v c th c ph m, Khan and Nowsad (2012) c ng s d ng b t tôm thu đ c t ph ph m tôm đem s y khô nghi n m n đ b sung vào bánh cracker, phát tri n s n ph m giàu protein t ph ph m Karnataka (2011) s d ng ph ph m đ s n xu t s n ph m giá tr gia t ng giàu protein v i s n ph m súp tơm (prawn soup), bánh quy tôm l t (prawn chilly biscuits) bánh quy tôm m n (prawn salt biscuits) V i ph n th t t đ u tôm sú chi m kho ng 15% kh i l ng đ u tôm nguyên li u (Nguy n V n M i ctv., 2013), t n d ng th t đ u tôm giàu protein đ c tách t đ u tôm, k t h p v i th t tôm th ph m theo t l 30% th t đ u đ u tôm 70% th t tôm th ph m t o đ c kh i paste có c u trúc không khác bi t so v i paste đ c ch bi n t tôm th t th ph m q trình ch bi n xúc xích Nghiên c u m h ng m i vi c nâng cao giá tr th ng ph m c a tôm, đa d ng s n ph m ch bi n t tơm Ngồi ra, Nguy n V n M i ctv (2014) nghiên c u ch bi n b o qu n b t th t đ u tôm sú t o ti n đ s d ng b sung vào s n ph m th c ph m khác D ch ép tách protein t đ u tôm th (Penaeus vannamei) s n xu t chitin đ c, b sung vào ch p lên men s n xu t n c m m (Nguy n Minh Trí ctv (2009) 2.1.4.2 Trong l nh v c th c n ch n nuôi T n d ng ph ph m tơm sau q trình ch bi n làm th c n cho v t nuôi đ c th c hi n t r t lâu, s n ph m c a đ u tơm sau q trình thu h i chitin chitosan Protein thu h i theo hình th c th y phân có th đ c s d ng nh ch t mùi, n hình Randriamahatody et al (2011) th y phân ph ph m tôm t Madagascar Patcharee and Nongnuch (1995) s n xu t s n ph m mùi t đ u tôm, s n ph m thu đ c đ a vào lo i th c ph m có ngu n g c t cá, th c n cho nuôi tr ng thu s n ho c ngu n nit môi tr ng cho s phát tri n c a vi sinh v t (Cavalheiro et al., 2007) th c n gia súc (Coward - Kelly et al., 2006) 2.1.4.3 Trong l nh v c d c S n ph m sau th y phân c a đ u tôm ngu n peptit có ho t tính sinh h c mang đ n ti m n ng đáng k d c ph m (Gildberg and Stenberg, 2001) He et al (2006) nghiên c u kh n ng s n xu t thành ph n th c ph m ch c n ng thông qua ch c n ng c ch ho t đ ng c a enzyme chuy n đ i angiotensin-I (angiotensinI-converting enzyme, ACE) ho t đ ng ch ng oxy hóa d ch th y phân oligopeptit làm giàu t Acetes chinensis D ch thu h i sau th y phân đ c ch ng minh có ho t tính sinh h c r t cao, có kh n ng ch ng oxy hóa, kh n ng ki m sốt enzyme gây cao huy t áp (Dey and Dora, 2014a; Ganugula et al., 2008) G n m t s nhà nghiên c u thu đ c ph c h p carotenoid-protein t đ u tôm s d ng nh ngu n carotenoids s d ng làm môi tr ng nuôi c y vi sinh nh m thu đ c thành ph n antimutagenic, có kh n ng ch ng đ t bi n gen gây ung th (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz et al.,2016) T ng quan v protease Enzyme ch t xúc tác sinh h c có kh n ng đ y nhanh ti n đ ph n ng hóa h c công c h tr giúp nâng cao ch t l ng th c ph m c ng nh hi u su t ch bi n Trong s enzyme đ c s d ng ch bi n th c ph m, enzyme th y phân chi m t l l n nh t (Rao et al., 1998), kho ng 97% doanh s enzyme cơng nghi p tồn c u (Haard and Simpson, 2000) Trong đó, protease enzyme th y phân có giá tr th ng m i r t l n, chi m kho ng 60% t ng giá tr th ng m i enzyme công nghi p đ c cung c p th tr ng th gi i v i nhi u ng d ng r ng rãi nhi u l nh v c nh công nghi p, nông nghi p, m ph m đ c bi t y h c hi n đ i (Joo and Chang, 2006; Tunga et al., 2003) S d ng enzyme th y phân nh m t tác nhân h tr d a m t s u m h n so v i s d ng hóa ch t, có đ đ c hi u cao, hi u qu c a xúc tác nhi t đ v a ph i thân thi n v i môi tr ng H enzyme protease th y s n H enzyme protease đ u tôm bao g m c endoprotease exoprotease nh ng thành ph n u ki n ho t đ ng c a chúng thay đ i theo gi ng loài, đ tu i khu v c sinh s ng Các protease tìm th y tơm bao g m carboxypeptidases A B, trypsin, chymotrypsin, cathepsin, collagenase (Honjo et al., 1990; Liu et al, 1999; Roy et al., 1996; Tsai et al., 1986; Worrnhoudt et al., 1992) H enzyme n i t i c a tôm th n (Penaeus indicus) ho t đ ng kho ng pH thích h p dao đ ng t 7,2 đ n 8,5; trypsin 7,5 - 8,0; chymotrypsin 7,2 - 7,8 elastase 6,8 – 8,5 Protease tơm khơng có d ng pepsin, ch y u d ng trypsine ho c protease serine d ng trypsine có kh n ng ho t đ ng r t cao (Omondi, 2005) H protease đ u tơm th Trachypena curvirostris có ho t l c t ng đ ng m t s protease th ng m i, nhiên chúng r t d b t n th t theo l ng protein h̀a tan c bi t, enzyme n i t i đ ng v t ch t h u c không b n, chúng d b bi n tính b tác đ ng c a y u t bên ngoài, d b h h ng b o qu n H n th n a, enzyme protein protein enzyme nh ng lo i protein không ph i enzyme nh ng l i có tính ch t hóa lý r t gi ng protein enzyme Do đó, vi c tách protein enzyme kh i lo i protein không ph i lúc c ng đ t đ c k t qu t t khơng ph i khơng g p nh ng khó kh n nh t đ nh Enzyme th ng m i Hi n nay, nhi u protease th ng m i t đ ng v t, th c v t ngu n vi sinh v t đ c s d ng đ s n xu t peptide ch ng oxy hóa nh alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme Trong lo i enzyme alcalase flavourzyme đ c s d ng có hi u qu t t c ch t protein c a tôm (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a) Vi c xác đ nh lo i enzyme đ c s d ng trình th y phân protein r t quan tr ng chúng quy t đ nh m u phân c t c a liên k t peptit, nh h ng đ n kích th c, s l ng thành ph n axit amin c a peptide, nh h ng đ n ho t tính sinh h c c a ch t th y phân Các nghiên c u có liên quan Nghiên c u ngoƠi n c Xu h ng s d ng ph ph m tôm đ chi t tách enzyme protease hay thu h i protein làm t ng giá tr c a thành ph n ph ph m đ c nhà khoa h c n c quan tâm th c hi n Cavalheiro et al (2007) nghiên c u thu h i protein theo hình th c th y phân có th đ c s d ng làm ch t mùi b sung vào lo i s n ph m th c n có ngu n g c t cá, th c n cho nuôi tr ng thu s n ho c ngu n nit môi tr ng cho s phát tri n c a vi sinh v t; Gildberg and Stenberg (2001) thu h i s n ph m th y phân ngu n peptit có ho t tính sinh h c mang đ n ti m n ng đáng k d c ph m; Synowiecki and Khateeb (2000) ti n hành nghiên c u nh m t o s n ph m giá tr gia t ng t nh ng ph ph m ch bi n tôm, bao g m c vi c chi t xu t chitin; CowardKelly et al (2006) th y phân protein đ s d ng th c ph m th c n gia súc; (He et al., 2006) nghiên c u kh n ng s n xu t thành ph n th c ph m ch c n ng thông qua trình th y phân ph ph m ph li u tôm c ng đ c đ xu t b i báo cáo nghiên c u g n v c ch ho t đ ng c a enzyme chuy n đ i angiotensin-I (angiotensin-I-converting enzyme, ACE) ho t đ ng ch ng oxy hóa th y phân oligopeptit làm giàu t Acetes chinensis, m t lồi tơm s d ng; Karnataka (2011) s d ng ph ph m đ s n xu t s n ph m giá tr gia t ng; Randriamahatody et al (2011) th y phân ph ph m tôm t Madagascar; Patcharee and Nongnuch (1995) s n xu t s n ph m mùi t đ u tôm Nghiên c u g n c a Randriamahatody et al (2011) th y phân tôm b i enzyme protease th ng m i có tính ki m ho c axit thành ph n thu đ c ch y u phân t peptit nh , 80% có kh i l ng phân t d i 1.000 Da, c̀n xác đ nh chi ti t có 14÷15 axit amin; Zhao et al (2011) s d ng enzyme alcalase th y phân tôm thu đ c 18 axit amin, có h u h t các axit amin c n thi t (tr Triptophane) mà c th không t t ng h p đ c Trong u ki n ho t đ ng t i u enzyme alcalase nh : pH 8,2, nhi t đ 45,4°C t l enzyme/c ch t (E/S) 1,8% t o s n ph m có DH, DPPH FRAP (ferric reducing antioxidant power) l n l t 40,31%, 38,93% 8,21 M Fe (II)/g, cho th y ph ph m đ u tôm (Metapenaeus dobsoni) m t ngu n protein cho trình s n xu t peptit axit amin có ho t tính ch ng oxy hóa ti m n ng (Gunasekaran et al., 2015) Latorres et al (2017) nghiên c u th y phân tôm th chân tr ng b ng enzyme alcalase 2,4 L protamex t o axit amin nh axit glutamic, axit aspartic, arginine, glycine, lysine, proline có n ng đ cao nh t ng d ng ho t tính sinh h c đ ch bi n th c ph m ch c n ng c ng nh ch t ch ng oxy hóa t nhiên h th ng th c ph m giàu béo h ng tri n v ng t ng lai Nghiên c u n c Các nghiên c u s d ng enzyme đ thu h i đ m ng d ng vào s n xu t n c m m, n c t ng (Tr n Th Luy n, 2000) đ n nghiên c u th y phân đ m v i m c tiêu x lý ch t th i hay làm công đo n ti n x lý nguyên li u cho trình ch bi n ti p theo Ngơ Th Hồi D ng ctv (2008) nghiên c u đ a gi i pháp ti n x lý b ng axit formic quy trình s n xu t chitosan t đ u tôm nh m gi m thi u l ng hóa ch t ch t th i gây ô nhi m môi tr ng Nguy n V n Thi t Ng c Tú (2007) nghiên c u tách chi t chitin t đ u v tôm b ng ph ng pháp sinh h c (s d ng bromelanin d ch ép v d a); Phan Th Bích Trâm Ph m Thu Cúc (2004) x lý v đ u tôm v i r đ ng enzyme dùng làm th c n cho gia súc, gia c m Tr nh Ng c Vinh (2006) ti n hành chua đ u v tơm có thêm vi khu n Lactobacillus spp giúp trình lên men đ c nhanh h n, t o s n ph m th c n gia súc có ch t l ng cao h n, có tính ph bi n r ng rãi, giá tr kinh t cao gi m thi u vi c gây ô nhi m môi tr ng Bùi Xuân ông Ph m Th M (2017) ti n hành nghiên c u thu nh n d ch đ m th y phân t v đ u tôm b ng enzyme alcalase ng v i nhi t đ môi tr ng, pH môi tr ng, t l enzyme c ch t, th i gian ph n ng enzyme l n l t 55oC; 8; 1,5% th i gian 80 phút thu đ c hi u su t thu h i đ m 61,28±0,5% đ c t n d ng làm th c n ch n nuôi V i ph n th t t đ u tôm sú chi m kho ng 15% kh i l ng đ u tôm nguyên, b sung v i th t tôm th ph m theo t l 30% th t đ u 70% th t tôm th ph m t o đ c kh i paste có c u trúc khơng khác bi t so v i paste đ c ch bi n t tôm th t th ph m (Nguy n V n M i ctv., 2013) T n d ng ngu n protein ch bi n th c ph m m h ng m i vi c nâng cao giá tr th ng ph m c a tôm sú đ ng b ng sông C u Long Nguy n V n M i ctv (2014) nghiên c u ch bi n b o qu n b t th t đ u tôm sú M t nghiên c u t n thu ch ph m enzyme protease ng d ng th y phân hai đ i t ng c ng ph li u ch bi n th y s n h n h p máu, gan cá basa đ u, v tôm (Nguy n L Hà, 2011), Tr n Thanh Trúc ctv (2015) di n c m quan, v i th i gian th y phân gi , d ch th y phân ch a có mùi l nh ng n u ti p t c kéo dài th i gian th y phân m c dù hi u su t th y phân v n t ng nh ng d ch th y phân có mùi xu t hi n b t khí i u ki n th y phân protein t th t đ u tôm b ng enzyme protease ngo i bào (alcalase, flavourzyme) phù h p i u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme alcalase đ n hi u qu th y phân protein 4.4.1.1 nh h ng c a pH nhi t đ D a kh o sát tr c v tác đ ng riêng l c a t ng y u t nhi t đ , pH th i gian đ n kh n ng th y phân c a enzyme alcalase cho th y, nhân t đ u có s chi ph i đáng k đ n ho t đ ng c a enzyme alcalase i u có th ngun nhân có nh h ng đ n vi c thay đ i hi u qu trình th y phân protein t th t đ u tôm th Trong s enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme,…thì alcalase cho hi u qu th y phân protein t t nh t (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a) Các thông s t i u nhi t đ pH đ enzyme alcalase th y phân protein đ u tơm th có giá tr X4 kho ng t ÷ (50 ÷ 70 C) X5 -pH (7,5÷8,5) D a k t qu phân tích ANOVA, ph ng trình h i qui th hi n s t ng quan c a u ki n th y phân đ n hi u su t thu phân đ c thi t l p s d ng đ d đoán hi u qu vi c thu phân protein Hàm m c tiêu Y4 – %DH, Y5 - % DPPH Y6 – IC50 c a trình th y phân b ng enzyme alcalase đ c xác đ nh b ng cách thay bi n v i giá tr th c vào ph ng trình sau: Y4- DH (%) = -552,328 + 8,00772X4 + 90,7747X5 – 0,0595288X4^2 – 0,127144 X4 X5 – 5,41016 X5^2 (4) Y5-DPPH (%) = -511,237 + 5,60728X4 + 97,6543X5 – 0,0458047X4^2 – 0,0339033X4X5 – 6,28411X5^2 (5) Y6 - IC50 (mg/100ml) = 803,496 - 8,28489 X4 - 142,168 X5 + 0,0690832X4^2 + 0,0354187 X4X5 + 9,13448 X5^2 (6) Gi i ph ng trình (4) (5) (6) cho giá tr t i u đ i v i DH (%); DPPH(%) IC50 K t qu đ c trình bày B ng 4.5 Hình 4.3 Hình 4.3 T ng tác c a nhi t đ pH đ n ba hàm m c tiêu Y4, Y5 Y6 15 B ng 4.5 K t qu t i u hóa u ki n th y phân đáp ng m c tiêu Y4, Y5 Y6 Nhân t X4 X5 Th p 6,5 50,0 Ch đ Cao 8,5 70,0 Ch đ t i u 7,67 57,99 Y4 33,27 Giá tr t i u: Y5 Y6 24,14 18,07 Hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa c a trình th y phân protein b ng enzyme alcalase đ t đ c u ki n pH nhi t đ t t nh t 33,33% 24,15% K t qu thu đ c phù h p v i k t qu c a Dey and Dora (2014a) s d ng mơ hình b m t đáp ng RMS đ t i u hóa u ki n th y phân ph ph m tôm th chân tr ng b ng enzyme alcalase th ng m i, hi u su t th y phân đ t 33,13% nhi t đ 59,37 oC pH 8,25 Huang et al (2011) ti n hành th y phân protein t ph ph m tôm b ng enzyme alcalase u ki n pH 8, nhi t đ 50oC đ t giá tr IC50 500 g/mL 4.4.1.2 nh h ng c a n ng đ enzyme alcalase K t qu th ng kê đ c trình bày B ng 4.6 B ng 4.6 nh h ng c a n ng đ enzyme alcalase (UI/g) đ n hi u su t th y phân, ho t tính ch ng oxy hóa IC50 N ng đ enzyme alcalase (UI/g) i ch ng 10 20 30 40 50 Hi u su t th y phân DH (%) 21,67a±0,94 33,59b±0,24 35,05c±0,11 33,46b±0,29 33,33b±0,35 33,23b±1,09 Ho t tính ch ng oxy hóa DPPH (%) (*) 16,32a±0,33 23,81b±0,73 32,72c±0,39 32,66c±0,87 32,06c±0,99 31,61c±1,39 IC50, (mg/100mL) 18,20a±0,57 19,33b±0,60 14,07c±0,17 14,10c±0,39 14,36c±0,44 14,57c±0,65 K t qu cho th y, s d ng n ng đ enzyme alcalase 20 UI/g u ki n thích h p đ đ t hi u su t th y phân cao (37,6%) ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân t t (31,57%) 4.4.1.3 nh h ng c a th i gian th y phân Th i gian th y phân protein t đ u tôm b ng enzyme alcalase c ng đ c th hi n Hình 4.4 Hình 4.4 nh h ng c a th i gian th y phân protein b ng enzyme alcalase 16 th Hình 4.4 th hi n s ph thu c đáng k c a th i gian th y phân đ n hi u su t th y phân protein ho t tính ch ng oxy hóa t d ch th y phân Khi th i gian th y phân t ng t đ n gi , hi u su t th y phân t ng t 19,58% lên 37,60% ho t tính ch ng oxy hóa t ng t 16,54% lên 31,57% Ti p t c kéo dài th i gian th y phân đ n gi , hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa đ u gi m d n Th i gian th y phân c n đ dài đ enzyme phân c t liên k t c ch t t o thành s n ph m c n thi t c a trình th y phân Khi c ch t c n th y phân th y phân h t, trình th y phân k t thúc Tuy nhiên, th i gian th y phân kéo dài c ch t h t s n ph m c a trình th y phân ti p t c phân c t làm gi m hi u su t th y phân (See et al., 2011) Do đó, th i gian th y phân gi thích h p nh t i u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme flavourzyme đ n hi u qu th y phân protein 4.4.2.1 nh h ng t ng tác c a pH nhi t đ Enzyme th ng m i flavourzyme c ng m t enzyme đ c s d ng nhi u ng d ng th y phân protein có ngu n g c th y s n ây enzyme ch a c thu c tính exopeptidase endopeptidase Tuy nhiên, flavourzyme th ng đ c bi t đ n vai trò enzyme mang tính ch t exopeptidase C ng gi ng nh lo i enzyme th ng m i khác, flavourzyme có kho ng pH nhi t đ ho t đ ng nh t đ nh Kh o sát u ki n t i u cho ho t đ ng enzyme flavourzyme bao g m nhi t đ =X6 (40 ÷ 60 C) X7 = pH (6,0÷8,0) Ph ng trình h i qui cho hàm m c tiêu: Hi u su t th y phân (Y7); ho t tính ch ng oxy hóa (Y8) IC50 (Y9) lý thuy t) đ c xác đ nh: Y7 - DH%= - 148,758 + 1,92953X6 + 36,6758X7 – 0,0207833X6^2 + 0,0414167X6X7 – 2,835X7^2, (R2 = 0,9594) (7) Y8 - DPPH%= - 400,987 + 2,46842X6 + 104,281X7 – 0,0311167X6^2+ 0,10675X6X7 – 7,86333X7^2, (R2 = 0,9819) (8) Y9 - IC50 = 481,778 - 113,801X6 - 2,58719X7 + 8,9563X6^2 - 0,21448 X6X7 + 0,0389991X7^2 (9) Gi i ph ng trình h i qui (7); (8) (9), giá tr bi n t ng ng t ng hàm m c tiêu (Y8) IC50 (Y9) K t qu đ c trình bày B ng 4.7 Hình 4.5 T ng tác c a nhi t đ pH đ n ba hàm m c tiêu Y7, Y8 Y9 17 B ng 4.7 K t qu t i u hóa u ki n th y phân đáp ng m c tiêu Y7, Y8 Y9 Nhân t Th p 6,0 40,0 X6 X7 Ch đ Cao 8,0 60,0 Ch đ t i u 6,97 51,04 Giá tr t i u Y8 Y9 Y7 30,18 26,54 16,93 Hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa c a trình th y phân protein b ng enzyme flavourzyme đ t đ c u ki n pH 6,97 nhi t đ 51,04 oC 30,18%; 26,54% IC50 16,93 mg/100 mL 4.4.2.2 nh h ng c a n ng đ enzyme flavourzyme N ng đ enzyme flavourzyme (UI/g) s d ng th y phân protein t đ u tơm đ c th hi n Hình 4.6 Hình 4.6 nh h ng c a n ng đ enzyme alcalase (UI/g) đ n hi u su t th y phân, ho t tính ch ng oxy hóa IC50 T i n ng đ enzyme flavourzyme 30 UI/g giúp trình th y phân protein th t đ u đ t hi u qu t t nh t (32,6%) ng th i, t i n ng đ kh n ng kháng oxy hóa đ t cao nh t ch s IC50 th p nh t, t ng ng: 28,58% 16,13 mg/100 mL 4.4.2.3 nh h ng c a th i gian th y phân K t qu th ng kê đ c trình bày B ng 4.8 B ng 4.8 nh h ng c a th i gian th y phân b ng enzyme flavourzyme đ n hi u su t th y phân, ho t tính ch ng oxy hóa IC50 Th i gian th y phân (gi ) (*) DPPH % đ Hi u su t th y phân DH (%) 17,79a±0,16 23,12b±0,68 32,56c±0,45 35,10d±0,92 35,18d±0,79 35,16d±1,11 35,45d±0,29 Ho t tính ch ng oxy hóa DPPH (%)(*) 16,54a±0,17 21,78b±0,57 25,94c±0,52 29,50d±0,57 29,96d±0,65 30,01d±0,49 30,08d±0,47 c pha loãng 20 l n 18 IC50 (mg/100 mL) 27,82a±0,29 21,14b±0,55 17,74c±0,35 15,60d±0,30 15,36d±0,33 15,33d±0,25 15,30d±0,22 Th i gian th y phân gi cho hi u qu t t nh t, hi u su t th y phân đ t đ n 35,10% ho t tính ch ng oxy hóa t ng 29,54%, t ng ng v i IC50 15,60 mg/100mL K t qu t ng tác gi a th i gian b sung flavourzyme th i gian k t thúc trình th y phân s d ng k t h p enzyme alcalase flavourzyme Rõ ràng r ng vi c l a ch n m t lo i enzyme thích h p r t quan tr ng đ i v i trình thu phân đ đ t k t qu mong mu n Tùy vào m c tiêu nghiên c u s l a ch n enzyme thích h p đ phân c t liên k t peptit Các enzyme th y phân protein đ c nghiên c u r ng rãi (Adler-Nissen, 1986) M t nh ng thông s quan tr ng trình th y phân protein m c đ th y phân (Kunst, 2003) i u hoàn toàn h p lý b i m t enzyme nh t không th th y phân sâu r ng m t th i gian h p lý (Lahl and Braun, 1994) Trong trình s d ng enzyme th ng m i đ th y phân protein đ u nành, s k t h p enzyme alcalase flavourzyme đ c l a ch n b i Vioque et al (1999) D a đ c m c ch ho t đ ng c a enzyme, nghiên c u xác đ nh s d ng h n h p hai enzyme th ng m i c n thi t B t đ u trình th y phân v i enzyme alcalase, có th đ t đ c s l ng N-terminal cho ho t đ ng c a enzyme phân c t ngo i flavourzyme Ph ng trình h i qui v i hai nhân t (X8; X9) đ n hàm m c tiêu: hi u su t th y phân protein (Y10, %), ho t tính ch ng oxy hóa (Y11, %) IC50,-Y12, đ c xác đ nh: Y10 = -233,14 + 1,41554X8 + 138,727X9 – 0,0137436X8^2 – 0,134371X8X9 – 18,3534X9^2 R2= 99,24% (10) Y11= -147,114 + 1,37022X8 + 87,7622X9 - 0,0118737X8^2 - 0,158342X8X910,9683X9^2 R2=97,42% (11) Y12 = 80,2571 - 0,501027X8 - 32,2615X9 + 0,00490069X8^2 + 0,0489167X8X9+ 4,05776X8^2, (12) trình th y phân đáp ng c ba hàm m c tiêu Y10, Y11 Y12, gi i ph ng trình (10), (11) (12) K t qu trình bày B ng 4.9 Hình 4.7 Hình 4.7 T ng tác c a th i m b sung flavourzyme th i gian đ n hi u su t th y phân, ho t tính ch ng oxy hóa IC50 d ch th y phân 19 B ng 4.9 K t qu t i u hóa u ki n đáp ng ba m c tiêu Y10; Y11 Y12 Nhân t X8 X9 Th p 11,72 2,79 Ch đ Cao 68,28 4,21 Ch đ t i u 32,24 3,78 Y10 43,98 Giá tr t i u Y11 Y12 40,45 11,19 Tóm l i, th i gian b sung enzyme flavourzyme 32,24 phút th i gian k t thúc thí nghi m 3,78 gi k t h p c hai enzyme th ng m i, giúp hi u qu th y phân protein t th t đ u tôm đ t cao K t qu t ng tác gi a n ng đ enzyme flavourzyme enzyme alcalase Xác đ nh n ng đ hai enzyme th ng m i alcalase (X10) flavourzyme (X10) đ s n xu t ch t th y phân protein v i m c đ th y phân ho t đ ng ch ng oxy hóa cao H s h i qui b c m t c a X10, X11 c ng nh h s t ng tác c a X10X11 đ u khác bi t có ý ngh a v m t th ng kê v i đ tin c y 95% K t qu cho th y rõ ràng trình th y phân b ng enzyme alcalase (endoprotease) giúp t ng s l ng đ u t N-terminal, t o u ki n cho ho t đ ng c a enzyme flavourzyme (exopeptidase), th y phân liên t c s làm t ng đáng k hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa thu đ c t d ch th y phân protein c a th t đ u tôm Giá tr t i u n ng đ hai enzyme th ng m i t i u cho trình th y phân đ c th hi n qu B ng 4.10 Hình 4.8 B ng 4.10 K t qu n ng đ enzyme đáp ng m c tiêu Y13,Y14 Y15 Nhân t X10 X11 Ch đ Th p Cao 5,86 34,14 15,86 44,14 Ch đ t i u 19,43 32,09 Y13 61,79 Y14 53,08 Giá tr t i u Y15 8,71 Y13; Y14 Y15: Hàm m c tiêu th hi n hi u su t th y phân, ho t tính ch ng oxy hóa IC50 kh o sát k t h p hai n ng đ enzyme alcalase enzyme favourzyme Hình 4.8 T ng tác enzyme alcalase enzymes flavourzyme đ n hi u xu t th y phân protein (DH%), ho t tính ch ng oxy hóa IC50 K t qu nghiên c u th hi n B ng 4.10 cho th y v i n ng đ enzyme alcalase 19,43 UI/g n ng đ enzyme flavourzyme 32,09 UI/g, hi u su t th y phân đ t 61,79%; ho t tính ch ng oxy hóa 53,08% IC50 8,71 (mg/100 mL) 20 N i dung 4: Xây d ng quy trình ch bi n ch ph m th y phân giàu protein vƠ đánh giá kh n ng b o qu n s n ph m 4.5.1.1 K t qu t ng tác gi a nhi t đ , pH th i gian th y phân ph i h p s d ng enzym n i t i enzyme alcalase flavourzyme hi u su t th y phân đ t hi u qu cao, m t h n h p c a exopeptidases endopeptidases th ng đ c s d ng, s d ng enzyme đ n không th đ t hi u qu th y phân cao m t th i gian nh t đ nh Quá trình th y phân đ c t i u hóa theo ph ng pháp b m t đáp ng v i nhân t nhi t đ = X12 (53÷58°C), pH X13 (6,9÷7,2) th i gian th y phân X14 (2÷4 hours) K t qu phân tích cho th y h s h i qui b c m t c a X12, X13, X14 tính theo hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa c ng nh h s t ng tác c a X12X13, X12X13, X13X14 đ u khác bi t ý ngh a v m t th ng kê đ tin c y 95%, đ ng th i h s h i qui b c hai c a X122, X132 X142 c ng khác bi t ý ngh a v m t th ng kê Hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa mơ ph ng (Y16, Y17 Y18 lý thuy t) đ c xác đ nh b ng cách thay bi n v i giá tr th c vào ph ng trình (16); (17) (18) Y16 = -15161,4 + 56,7271X12 + 3737,68X13 + 400,736X14 - 1,33152X12^2 + 14,2967X12X13 - 3,59857X12X14 - 318,284X13^2 - 20,5364X13X14 - 9,98803X14^2, R2=98,02% (16) Y17 = -8325,72 + 3,26072X12 + 2258,86X13 + 307,971X14 – 0,933347X12^2 – 15,3321X10X13 -2,9289X12X14 – 218,724X13^2 – 15,2187 X11X12 – 6,95327X14^2, R2=98,02% (17) Y18 – IC50 = 721,779 - 0,0629663X12 - 193,37 X13 - 29,3533 X14 + 0,0821089 X12^2 - 1,40444 X12 X13 + 0,323 X12X14 + 19,1416 X13^2 + 1,14444X13X14 + 0,629855 X14 (18) B ng 4.11 K t qu t i u hóa u ki n đáp ng m c tiêu Y16, Y17 Y18 Nhân t Th p 51,29 6,80 1,32 X12 X13 X14 Hình 4.9 T Ch đ Cao 59,70 7,30 4,68 Ch đ t i u 54,94 7,01 2,96 Y16 90,19 Giá tr t i u Y17 Y18 86,16 5,26 ng tác c a nhi t đ , pH th i gian đ n Y16, Y17 Y18 Tóm l i, v i hi u su t th y phân ho t tính ch ng oxy hóa cao thu đ c k t h p enzyme protease n i t i enzyme th ng m i ch u s chi ph i r t l n c a 21 u ki n nhi t đ , pH môi tr ng th i gian th y phân i u ki n th y phân thích h p cho ho t đ ng chung c a lo i enzyme n i t i th ng m i c n thi t, k t qu thu đ c, pH 7,01; nhi t đ 54,94 °C th i gian th y phân 2,96 gi v i n ng đ enzyme alcalase n ng đ flavouryme b sung l n l t 19,43 UI/g 32,09 UI/g giúp hi u qu th y phân protein t th t đ u tơm th đ t 90,19%, ho t tính ch ng oxy hóa đ t 86,16% Hình 4.10 K t qu n di gel SDS–PAGE d ch th y phân k t h p enzyme n i t i enzyme th ng m i 0: Thang chu n; 1: nguyên li u; 2, d ch th y phân T k t qu n di gel SDS–PAGE Hình 4.10 có th nh n th y, m u d ch th y phân sau ly tâm (gi ng 2, gi ng gi ng 4) khơng có s hi n di n cao c a protein n m kho ng kh i l ng phân t t 14,4 kDa tr lên, phù h p v i kh o sát tr c c a Zhao et al (2011), nhóm tác gi xác đ nh r ng peptit có kh i l ng phân t nh h n kDa có kh n ng ch ng oxy cao nh t so v i phân đo n (> 10 kDa; 510 kDa; 35 kDa 13 kDa) thu đ c trình th y phân ph ph m tôm b ng enzyme alcalase B ng 4.12 Thành ph n axit amin d ch th y phân th t đ u tôm th phân t i u k t h p enzyme n i t i enzyme th ng m i TT Axit amin T ng Aspartic axit Serine Glutamine Histidine Glycine Threonine Arginine Alanine Tyrosine Hàm l (%) 0,21 0,31 0,12 0,14 0,26 0,20 0,66 0,31 0,09 ng TT Axit amin 10 11 12 13 14 15 16 17 Cysteine Methionine Valine Phenylalanine Isoleucine Leucine Lysine Proline u ki n th y Hàm l ng (%) 0,02 0,18 0,29 0,29 0,25 0,41 0,55 0,26 4,55 22 T k t qu B ng 4.12 cho th y, có t ng c ng 17 axit amin hi n di n d ch th y phân Trong đó, có đ y đ axit amin c n thi t y u bao g m arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, lysine valine (tr tryptophan – khơng có u ki n phân tích) c bi t arginine chi m t l cao nh t (0,66%), m t nh ng axit amin thi t y u đ i v i tr em Ti p đ n, lysine (0,55%) có vai trị quan tr ng vi c h p thu canxi, t o c b p, ph c h i sau ch n th ng, ph u thu t đ ng th i t ng h p hormone, enzyme kháng th , methionine (0,18%) axit amin có g c l u hu nh có vai trị quan tr ng chuy n hoá v t ch t, đ c bi t q trình g n trao đ i nhóm methyl c th , giúp trung hòa g c t gi m m t s b nh t t c a ng i già s lão hóa Ngoài ra, m t s nghiên c u ch ng minh m i t ng quan gi a axit amin ho t đ ng ch ng oxy hoá c a peptit, axit amin th m nh tyrosine, histidine, tryptophan phenylalanine axit amin k n c bao g m valine, leucine alanine, c ng nh methionine glycine đóng vai tr̀ quan tr ng đ i v i ho t đ ng ch ng oxy hoá c a peptit (Chen et al., 1998; Mendis et al., 200a; Rajapakse et al., 2005b) Thành ph n axit amin thu đ c nhi u h n so v i k t qu nghiên c u c a Randriamahatody et al (2011) th y phân protein t tôm sú (Peaneus monodon) b i enzyme protease th ng m i (xác đ nh đ c 14÷15 axit amin d ch th y phân) So v i k t qu phân tích thành ph n axit amin c a b t carotenoprotein thu đ c t đ u tôm sú 16 axit amin (Nguy n L Hà, 2011), d ch th y phân th t đ u tơm th có thêm cysteine, m t axit amin có ch a l u hu nh c n thi t cho da kh e m nh, t t cho tóc móng tay Ngày ng i ta c̀n xem cysteine c ng m t axit amin không th thay th (Lê Ng c Tú ctv., 2004) K t qu cho th y, d ch th y phân t th t đ u tôm th chân tr ng trì s hi n di n c a h u h t thành ph n axit amin có tơm th chân tr ng theo k t qu phân tích c a Gunalan et al (2013) So sánh lo i enzyme th y phơn đ n hi u qu trình th y phân K t qu t ng tr ng h p th y phân thu nh n đ c trình bày B ng 4.13 B ng 4.13 So sánh hi u qu th y phân b ng enzyme khác TH Hi u su t th y phân (DH %) Ho t tính ch ng oxy hóa (%)(*) TH1 TH2 TH3 TH4 TH5 TH6 15,66a ± 0,06 41,69d ± 0,24 37,70c ± 0,21 35,10b ± 0,45 61,36e ± 0,35 90,06f ± 1,06 16,54a ± 0,17 34,47d ± 0,03 31,57c ± 0,31 29,50b ± 0,57 52,68e± 0,42 85,98f ± 1,33 Hàm l ng amin hòa tan (mg N/g) 0,33a ± 0,001 0,87d ± 0,005 0,73c ± 0,004 0,69b ± 0,010 1,02e ± 0,003 1,87f ± 0,001 IC50 (mg/100 mL) 29,39a ± 0,12 11,04d ± 0,06 13,20c ± 0,08 13,95b ± 0,19 7,50e± 0,04 5,11f ± 0,06 TH1: protease n i t i khơng kích ho t; TH2: protease n i t i có kích ho t; TH3: alcalase; TH4: Flavourzyme; TH5: alcalase + flavourzyme; TH6: k t h p enzyme n i t i v i enzyme th ng m i; (*) DPPH % đ c pha loãng 20 l n th K t qu cho th y hi u qu c a vi c s d ng k t h p enzyme n i t i hai enzyme ng m i alcalase flavourzyme giúp t ng hi u qu phân c t liên k t peptit 23 th hi n qua hi u su t th y phân t ng 1,47 l n so v i s d ng k t h p hai enzyme th ng m i t ng 2,1 l n so v i hi u su t th y phân ch t enzyme n i t i T ng t , kh n ng ch ng oxy hóa c a d ch đ m th y phân, cao h n 1,63 l n so v i s d ng hai enzyme th ng m i 2,49 l n so v i th y phân b ng enzyme n i t i Xác l p thơng s thích h p cho q trình đ c t o s n ph m có ho t tính ch ng oxy hóa cao Q trình đ c đ c t i u hóa theo ph ng pháp b m t đáp ng v i th a s nhi t đ X15 (40÷50°C) th i gian X16 (30÷50 phút), bao g m 12 đ n v thí nghi m K t qu th hi n, nhi t đ th i gian t ng làm d ch th y phân d n đ n gia t ng hàm l ng protein t ng s (Y13) ho t tính ch ng oxy hóa t ng (Y14) Tuy nhiên, hi u su t thu h i ho t tính ch ng oxy hóa (Y16) gi m đáng k B ng 4.14 K t qu t i u hóa u ki n cô đ c đáp ng hàm m c tiêu Y19, Y20, Y21 Y22 Ch đ Nhân t Th p Cao X15 X16 40,00 30,00 50,00 50,00 Ch đ t i u 45,58 41,85 Giá tr t i u Y19 20,56 Y20 93,64 Y21 65,21 Y22 59,47 X15: Nhi t đ cô quay( C) X16: th i gian cô quay (phút) Y19: Hàm m c tiêu d a hàm l ng protein; Y20: Hàm m c tiêu d a hi u su t thu h i protein Y21: Hàm m c tiêu d a ho t tính ch ng oxy hóa; Y22: Hàm m c tiêu d a hi u su t thu h i ho t tính ch ng oxy hóa o H s h i qui b c m t c a X15, X16; h s t ng tác c a X15X16; c ng nh h s h i qui b c hai c a X152 X162 c ng khác bi t ý ngh a v m t th ng kê v i đ tin c y 95% T i u hóa thơng s v i m c đích d ch cô đ c thu đ c đáp ng đ c đ ng th i m c tiêu Y13,Y14 ,Y15 Y16 (B ng 4.14) i u ki n cô đ c t i u thu đ c: X15 45,58 °C X16 41,85 phút Hàm l ng protein t ng s 20,56% ho t tính ch ng oxy hóa đ t 65,21% nh h ng c a th i gian b o qu n đ n s thay đ i tính ch t thành ph n d ch th y phân sau cô đ c K t qu hàm l ng protein t ng s , ho t tính ch ng oxy hóa hàm l ng NH3 q trình tr đơng đ c th hi n B ng 4.15 Prortein t ng khơng có s khác bi t tháng b o qu n Hàm l ng NH3 t ng nhanh có s khác bi t sau tháng b o qu n, nguyên nhân ch ph m d ch protein th y phân ch a ch y u đ m amin hòa tan Sau m t th i gian b o qu n, hàm l ng đ m, axit amin t phân thành s n ph m th c p nh h ng đ n màu s c mùi c a s n ph m Hàm l ng NH3 t ng t 62,53 đ n 103,10 mgN/100 g tháng b o qu n, hàm l ng NH3 t i tháng th 103,10 mgN/100 g v t m c cho phép (5 mg/100 g đ n 100 mg/100 g) theo tiêu chu n Vi t Nam TCVN 9215: 2012 v th y h i s n t i s ng B n c nh đó, ho t tính ch ng oxy hóa n đ nh tháng đ u b o qu n (65,38% đ n 64,24%) b t đ u gi m t tháng th đ n tháng th (64,24% gi m xu ng 52,24%) Do đó, đ d ch đ c gi đ c giá tr dinh d ng ho t tính sinh h c t t, khuy n khích s d ng th i gian tháng b o qu n 24 B ng 4.15 S thay đ i thành ph n c a d ch cô đ c theo th i gian b o qu n Th i gian (tháng) (*) Hàm l ng protein t ng s (%) a 20,58 ±0,95 20,50a±0,80 20,45a±0,85 20,42a±0,84 20,34a±0,70 20,26a±0,91 20,20a±0,77 20,13a±0,94 20,04a±0,67 Hàm l ng NH3 (mg N/100 g) 62,53a±0,61 63,50ab±0,47 63,67ab±0,54 63,81b±0,27 66,60c±0,97 74,07d±0,71 82,17e±0,93 89,43f±0,89 103,10g±0,88 Ho t tính ch ng oxy hóa th c a d ch đ Ho t tính ch ng oxy hóa(*), % DPPH 65,38a±0,46 65,20a±0,59 65,00a±0,86 64,30a±0,62 64,24a±0,56 55,76b±0,96 53,72c±1,09 53,01cd±0,89 52,24d±0,32 IC50 (mg/100 mL) 3,31±0,02 2,91±0,01 3,30±0,02 2,91±0,07 2,65±0,09 3,09±0,08 2,91±0,04 2,55±0,05 3,88±0,02 c pha loãng 50 l n Hàm l ng Nitrogen (g/l) ng d ng b sung ch ph m d ch protein th y phân t th t đ u tôm vào s n xu t th c ph m B sung d ch th y phân giƠu protein vƠo n c m m Ch ph m d ch protein th y phân đ c b sung vào n c m m có đ đ m d i 10oN nh m nâng hàm l ng nit toàn ph n lên m c 10oN, 15oN, 25oN 30oN (t ng ng m c ch t l ng n c m m h ng 1, h ng 2, th ng h ng h ng đ c bi t theo TCVN: 5107-2003) K t qu nghiên c u cho th y, m u n c m m đ c b sung d ch đ m: M1 - 10N; M2 - 15N; M3 - 25N M4 - 30N đ u đ m b o tiêu chu n v ch tiêu hàm l ng nit tồn ph n (Hình 4.11), ch tiêu nit amoniac (Hình 4.12) ch tiêu vi sinh (B ng 4.16) 35.0 32.1 31.4 31.1 30.5 29.9 29.6 29.4 30.0 26.6 26.2 25.9 25.5 25.2 25.1 25.1 20.0 15.9 15.5 15.6 15.5 15.0 11.5 10.0 7.4 11.4 7.4 11.4 7.3 11.2 7.3 15.2 11.1 7.2 15.2 11.2 7.2 15.2 11.2 7.2 10 12 25.0 5.0 Th i gian b o qu n (tu n) Hình 4.11 Hàm l M1 DC M2 10N M4 25N M5 30N ng nit toàn ph n m u n 25 M3 15N c m m theo th i gian b o qu n Hình 4.12 Hàm l ng NH3 m u n c m m theo th i gian b o qu n B ng 4.16 K t qu phân tích vi sinh m u n c m m T ng E coli Cl Perfringens Coliform S aureus T ng s bào t VSV (trong (trong 1mL) (trong (trong n m men, n m hi u khí 1mL) 1mL) 1mL) m c tính theo (trong khu n l c 1mL) mL M1-DC 5,5 x 102 KPH