1 ỌC N N ỌC SƢ P M KHOA SINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Nghiên cứu ni cấy huyền phù tế bào mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hương Giang Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trường Người hướng dẫn : Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, tháng 5/ 2013 MỞ ẦU Tính cấp thiết Từ xa xưa, người sử dụng thực vật làm nguồn thực phẩm mà sử dụng chúng để điều trị bệnh tật (Wyk Wink, 2004) Hàng ngàn năm qua, loài dược liệu nguồn cung cấp dược phẩm quan trọng nhằm cứu lấy sống bệnh nhân toàn giới Theo tổ chức WHO, 80% dân số giới tin cậy vào phương thức chữa bệnh truyền thống dược liệu ¼ loại thuốc có chứa hoạt chất sinh học chiết xuất từ dược liệu [60] Tuy nhiên, nguồn khai thác dược liệu chủ yếu từ tự nhiên, dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên tính đa dạng di truyền lồi thực vật [21] Do đó, việc tìm phương thức thay để tạo nguồn dược liệu ổn định cần thiết Nuôi cấy tế bào huyền phù thực vật lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật Kỹ thuật với ưu điểm vượt trội mở tiềm lớn để tăng thu sinh khối thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết hoạt chất sinh học quy mơ cơng nghiệp, góp phần giải khó khăn nguồn dược liệu tự nhiên [6] Nhiều hoạt chất sinh học dùng làm thuốc sản xuất theo phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật chẳng hạn Berberin Yamada Sato (1981), Imperatorin Tsay cs (1994), Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dược liệu quý biết đến nhiều nước Đông Nam Á Các phận được sử dụng theo truyền thống để chống sốt rét, cải thiện sinh lý nam giới, chống bệnh tiểu đường, chống viêm loét kháng khuẩn [51] Tuy nhiên, loài thân gỗ, sinh trưởng chậm ngồi tự nhiên, phải trồng 5-7 năm thu hoạch để dùng làm thuốc Mặt khác, sản lượng mật nhân Việt Nam suy giảm nhanh chóng nhu cầu khai thác mức, lâm vào tình trạng gần tuyệt chủng Vì việc nghiên cứu tìm phương thức sản xuất sinh khối mật nhân nhanh ổn định nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu bền vững cho phát triển ngành dược liệu vô cấp thiết Xuất phát từ sở tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)” nhằm tạo sở khoa học cho việc nghiên cứu sản xuất hoạt chất sinh học thông qua nuôi cấy tế bào quy mô công nghiệp Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đường cong sinh trưởng nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân - Xác định lượng sinh khối ban đầu thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân bình tam giác 250ml máy lắc - Xác định mơi trường thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào mật nhân bình tam giác 250ml máy lắc Nội dung nghiên cứu - Khảo sát đường cong sinh trưởng nuôi cấy huyền phù tế bào bình tam giác, máy lắc - Khảo sát ảnh hưởng lượng sinh khối tế bào ban đầu đến khả tích luỹ sinh khối tế bào huyền phù - Khảo sát ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) nồng độ khác đến khả sinh trưởng tế bào huyền phù mật nhân Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Phương pháp cho phép tách quan: mô, tế bào đơn, protoplast từ cá thể nuôi cấy môi trường dinh dưỡng nhân tạo có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng điều kiện ni cấy thích hợp để phân hóa thành quan tái sinh thành thể hoàn chỉnh [17] Bên cạnh việc khắc phục nhược điểm biện pháp nhân giống truyền thống, công nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật cịn thể nhiều ưu điểm vượt trội tạo lượng lớn trồng bệnh, đồng mặt di truyền thời gian ngắn, tạo lượng lớn sinh khối tế bào phục vụ cho công nghiệp y dược [1] Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa sở lý luận khoa học tính tồn khả phân hóa, phản phân hóa tế bào thực vật Cuối kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang toàn lượng thơng tin di truyền sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh [23] Tính tồn tế bào khẳng định cơng trình nghiên cứu Stewart cs (1958) nuôi cấy mô rễ cà rốt môi trường đặc có nước dừa thu nhận khối mô sẹo gồm tế bào nhu mô Khi chuyển mơ sẹo sang mơi trường lỏng có thành phần ni lắc nhận huyền phù gồm tế bào riêng lẽ nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy môi trường lỏng, không cấy chuyển thấy hình thành rễ Đến năm 60, đồng thời Stewart (1963), Wetherell Halperin (1963) thông báo tế bào cà rốt tự nuôi cấy môi trường thạch tạo thành hàng ngàn phôi, phôi phát triển qua giai đoạn giống q trình tạo phơi bình thường cà rốt, lúc tính tồn tế bào khẳng định Từ khám phá trên, hàng loạt báo cáo tính tồn tế bào thông báo, tất quan phát triển phôi Phôi soma ghi nhận nhiều giống Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza Ngày kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta nhân giống phục tráng hàng loạt trồng có giá trị khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, lương thực, ăn Việc nhân giống trở thành công nghệ áp dụng nhiều nước giới [16, 17, 23, 32, 44] 1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật Mặc dù phát triển nửa đầu kỉ 20 kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt thành công vượt bậc [6] Điểm ưu việt ni cấy tế bào so với mọc ngồi tự nhiên điều kiện vô trùng, sản xuất chất có hoạt tính sinh học thời gian ngắn quy mô công nghiệp, đồng thời tránh biến động thời tiết điều kiện đất đai [56] 1.2.1 Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy huyền phù tế bào chứa tế bào khối tế bào sinh trưởng phân tán môi trường lỏng Thường khởi đầu cách đặt khối mô callus dễ vỡ vụn môi trường lỏng chuyển động Nuôi cấy huyền phù tiến triển từ thực vật đến mẫu vật đến cuối dịch huyền phù [6] Nuôi cấy huyền phù thường tạo nên phân rã tốt với chu kì ni cấy kéo dài Ni cấy huyền phù trì cách sử dụng phương pháp ni cấy từ bình tam giác đến hệ lên men quy mơ lớn Tế bào tập hợp thành cụm [31] Nuôi cấy huyền phù tế bào phương thức sử dụng nhiều để nghiên cứu sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao r-protein [56], bên cạnh ni cấy huyền phù thích hợp cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật so với nuôi cấy callus nuôi cấy huyền phù trì thao tác tương tự với hệ thống lên men ngập chìm môi trường lỏng [6] 1.2.2 Sự sinh trƣởng tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Sinh trưởng nuôi cấy tế bào thực vật trải qua pha [6]: + Pha tiềm phát: thời kì khởi đầu q trình ni cấy, số lượng tế bào tăng thường không đáng kể Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên kích thước tế bào lại tăng suốt thời kì Thời gian pha tuỳ thuộc vào loại tuổi mơ cấy, đồng thời cịn phụ thuộc vào môi trường lượng sinh khối ban đầu q trình ni cấy + Pha luỹ thừa: tế bào sinh trưởng phát triển theo hàm mũ Khi đạt đến mật độ định, số lượng tế bào không tăng nữa, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần tế bào vào giai đoạn ổn định Thông thường, hợp chất thứ cấp tích luỹ giai đoạn + Pha cân bằng: tế bào trạng thái cân động học, số tế bào sinh số tế bào chết số lượng tế bào không đổi Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ chất + Pha suy vong: số lượng tế bào giảm mạnh, chết xuất suy yếu bảo quản lượng tế bào, tích luỹ sản phẩm độc tố, số trường hợp xảy tượng chết mà kèm theo phân giải tế bào 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào 1.2.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy Chất dinh dưỡng cung cấp cho tế bào thực vật nuôi cấy in vitro lấy từ môi trường nuôi cấy Thành phần cấu tạo nên môi trường ni cấy chia thành nhóm: nước cất (95%), môi trường bao gồm nguồn cacbon chất khoáng, chất ĐHST chất khác agar, agarose (Phytagel cs) Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho giai đoạn hệ mô nuôi cấy mô quan trọng Sự sinh trưởng phân chia tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ điều chỉnh nguồn cacbon, nồng độ photphat, nguồn cung cấp nitơ chất ĐHST [56] + Nguồn cacbon: tế bào chưa có khả quang hợp để tổng hợp nên chất hữu người ta phải đưa vào môi trường lượng hợp chất cacbon định để cung cấp nượng cho tế bào mô (Debengh, 1991) Thông thường, saccharose (2-5%) sử dụng phổ biến nuôi cấy mô thực vật Saccharose enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo đường đơn glucose fructose q trình ni cấy Các nguồn cacbon sử dụng saccharose, glucose, fructose sorbitol [56] + Nguồn nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào lồi trạng thái phát triển mơ Thơng thường, nguồn nitơ đưa vào môi trường hai dạng NH4+ NO3- (nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- tế bào thực vật tỏ có hiệu so với NH4+ Nhưng NO3- gây tượng “kiềm hóa” mơi trường giải pháp sử dụng phối hợp hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý sử dụng rộng rãi + Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho(P), kali (K), canxi (Ca), magiê (Mg) lưu huỳnh (S), tồn dạng muối khống, thành phần mơi trường dinh dưỡng khác nhau, sử dụng nồng độ 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Mơi trường ni cấy phải chứa 25 mmol/l nitrate potassium Các nguyên tố khác, như: Ca, P, S Mg, nồng độ thường dùng khoảng 1-3 mmol/L [7] Các mơi trường khống khác có hàm lượng thành phần chất khống khác nhau, ví dụ thành phần nồng độ khống mơi trường White Knop nghèo nàn, lại giàu môi trường MS B5 Việc lựa chọn thành phần hàm lượng khống cho đối tượng ni cấy khó địi hỏi người làm cơng tác ni cấy mơ phải có hiểu biết sinh lý thực vật dinh dưỡng khống + Nhóm ngun tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… nguyên tố quan trọng cho phát triển mơ tế bào chúng đóng vai trò quan trọng hoạt động enzym Chúng dùng nồng độ thấp nhiều so với nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng phát triển bình thường [16] + Các vitamin: Mặc dù ni cấy mơ tự tổng hợp vitamin, không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do đó, để sinh trưởng tối ưu số vitamin nhóm B bổ sung vào môi trường với lượng định tuỳ theo hệ mô giai đoạn nuôi cấy Các vitamin inositol, B1 (thiamin) B6 (pyridocin) vitamin thường dùng môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l Linsmaier Skoog khẳng định vitamin B1 cần thiết cho sinh trưởng phát triển tế bào quan trọng nuôi cấy mô sau nghiên cứu kĩ lưỡng có mặt mơi trường MS [16] + Dung dịch hữu cơ: có thành phần khơng xác định nước dừa, dịch chiết nấm men, bổ sung vào mơi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo quan Nước dừa sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994 Trong nước dừa thường chứa acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN ADN Đặc biệt nước dừa cịn có chứa hợp chất quan trọng cho ni cấy mơ như: myoinoxitol, hợp chất có hoạt tính auxine, gluxid cytokinin [16] + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) loại polysacharid tảo có khả ngậm nước cao 6-12g/l Độ thống khí mơi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy + Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohormon chất có tác dụng ĐHST thực vật Các phytohormon chia thành nhóm: Auxine, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ chất ĐHST yếu tố định đến thành cơng q trình ni cấy - Auxine: Nhóm gồm có chất là: IBA, IAA, NAA, 2,4-D nuôi cấy mô thực vật auxine thường sử dụng để kích thích phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo, kìm hãm phát triển chồi tạo rễ phụ [16] Lấy ví dụ cụ thể, 2,4-D bổ sung với nồng độ cao nhằm thúc đẩy tăng sinh callus [56] - Cytokinin: Được bổ sung vào mơi trường chủ yếu để kích thích phân chia tế bào định phân hoá chồi bất định từ mô sẹo quan Các hợp chất thường sử dụng là: KIN, BAP, Zip, Zeatin… Tuỳ vào hệ mơ mục đích ni cấy mà cytokinin sử dụng nồng độ khác Ở nồng độ thấp (10- - 10-6M) chúng có tác dụng kích thích phân bào, nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích phân hố chồi Trong ni cấy mơ để kích thích nhân nhanh người ta thường xử dụng cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [3] - Gibberellin: Nhóm có khoảng 20 loại hormone khác quan trọng GA3 GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm loại hạt khác nhau, kéo dài lóng đốt thân cành Bên cạnh GA3 cịn có tác dụng phá ngủ phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) tạo chồi phụ (Street, 1973) Ngồi ra, cịn có tác dụng ảnh hưởng đến hoa số thực vật có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng - Abscisic acid (ABA): chất ức chế sinh trưởng tự nhiên dùng nuôi cấy tế bào in vitro ABA có ảnh hưởng âm tính đến mơ nuôi cấy, ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao dùng BAP riêng rẽ [3] ABA sử dụng để gây phôi soma hệ thống nuôi cấy mô thực vật nghiên cứu giống tổng hợp Chống thoát nước, tăng thời gian thích ứng với điều kiện khí hậu nuôi cấy mô làm giảm nước [55] - Ethylen: có biểu tác động hai chiều, kìm hãm hình thành chồi giai đoạn sớm lại kích thích phát triển chồi giai đoạn muộn Trong số trường hợp, ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ số trường hợp lại kìm hãm q trình [16] 1.2.3.2 iều kiện nuôi cấy Trong nuôi cấy mô tế bào yếu tố môi trường vật lý quan tâm ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ + Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng ánh sáng Với đa số lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp 8-12 giờ/ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng mơ sẹo cường độ thấp gây nên tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng 10 ánh sáng ảnh hưởng rõ tới phát sinh hình thái mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng xanh ức chế vươn cao chồi lại ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng mơ sẹo Chính mà phịng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux + Nhiệt độ: nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến phân chia tế bào trình trao đổi chất mô nuôi cấy Nhiệt độ cho phép tế bào thực vật sinh trưởng phát triển điều kiện in vitro từ 23°C đến 29°C (Endress 1994; Fowler 1988) + Độ ẩm: Trong bình ni cấy độ ẩm tương đối ln 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm nuôi cấy mô + pH môi trường: Các mô tách rời sinh trưởng tốt môi trường có pH 5,0 – 7,5 Đây phạm vi pH dịch nỗn (6,0) Nói chung pH mơi trường điều chỉnh 0,5 đơn vị cao giá trị mong muốn để bù đắp cho thay đổi điều chỉnh trình khử trùng [7] Trên thực tế pH mơi trường ảnh hưởng rõ nét tới khả hồ tan chất khống môi trường, Sự ổn định môi trường, khả hấp thụ chất dinh dưỡng Nếu pH thấp (7,0) gây ức chế sinh trưởng, phát triển nuôi cấy in vitro Độ pH thường sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - + Lượng sinh khối ban đầu: Theo Helgeson (1979), khối lượng mẫu ban đầu đưa vào ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng phát triển tế bào nuôi cấy in vitro Cần phải có lượng tế bào tối thiểu ban đầu thích hợp 3-5g/dm3 0,5 – 2,5 × 105 tế bào/ml 1.2.4 Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất dƣợc liệu Các dược liệu nghiên cứu tập trung trở lại toàn cầu Việc sản xuất dược liệu đặc trưng an toàn ngược lại với việc sản xuất dược liệu từ hoá chất biết đến khơng an tồn cho người sử dụng cho môi trường Hơn 1/3 dân số giới dùng loài thực vật dịch chiết loài 26 12 Khối lƣợng tƣơi (g) 10 Lượng mẫu 1g/50ml Lượng mẫu 3g/50ml Lương mẫu 5g/50ml 12 15 18 21 a Thời gian (ngày) 0.45 Khối lƣợng khô (g) 0.4 0.35 0.3 0.25 Lượng mẫu 1g/50ml Lượng mẫu 3g/50ml Lượng mẫu 5g/50ml 0.2 0.15 0.1 0.05 12 15 18 21 b Thời gian (ngày) ình 3.5 Ảnh hƣởng lƣợng sinh khối ban đầu đến tích luỹ sinh khối tƣơi (a) sinh khối khô(b) tế bào huyền phù Với lượng mẫu ban đầu 1g sinh khối tế bào tăng khơng có dấu hiệu dừng lại Tuy nhiên, sinh khối thu sau 21 ngày ni cấy q – đạt 27 4,1g tươi sau 21 ngày Với lượng sinh khối ban đầu 3g sinh khối tế bào đạt cực đại vào ngày thứ 15 với 7,53g tươi (0,35 g khô) cao gấp đôi lượng sinh khối ban đầu Với lượng sinh khối tế bào ban đầu 5g, đường cong sinh trưởng đạt đỉnh thời điểm 12 ngày với 11,32g (0,42g khô) cao gấp đơi lượng sinh khối đưa vào ban đầu, sau sinh khối tế bào giảm mạnh 6,98 g tươi (0,34g khô) vào ngày thứ 15 Tuy nhiên, với lượng sinh khối ban đầu 3g cho hình thái tế bào tốt hơn, tế bào có màu vàng sáng Trong với lượng sinh khối tế bào ban đầu 5g, thời điểm đạt đỉnh dịch tế bào có màu nâu nhạt pha chết xảy nhanh.Vậy để thuận tiện cho việc thực nghiên cứu sau này, lượng sinh khối ban đầu phù hợp với nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân nghiên cứu 3g Loc cs (2006) nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng mẫu đưa vào ban đầu đến tích luỹ sinh khối tế bào nghệ đen, kết cho thấy sinh khối tế bào đạt cực đại (9,803g) với lượng sinh khối ban đầu 3g/50ml Jeon M cs (2008) nghiên cứu đối tượng Ginkgo biloba thu kết sinh khối tế bào huyền phù thu nhiều sử dụng mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l NAA với lượng sinh khối ban đầu đưa vào nuôi cấy 3g/50 ml Tuy nhiên thí nghiệm thiết lập ni cấy huyền phù tế bào đối tượng Corydalis saxicola, Cheng H cs khảo sát ảnh hưởng lượng sinh khối ban đầu lên sinh trưởng tế bào huyền phù mẫu – 8g/ 80ml môi trường Kết quả, với lượng mẫu 8g/80 ml cho sinh trưởng tế bào tốt với khối lượng khô tế bào lên đến 13,1g [28] 3.3 Ảnh hƣởng chất ST lên sinh trƣởng tế bào Các chất ĐHST NAA, 2,4-D loại auxine nuôi cấy mơ thực vật thường sử dụng để kích thích sinh trưởng phân chia tế bào, hình thành nên mơ sẹo [16] Chính tơi sử dụng NAA, 2,4–D riêng rẽ nồng độ khác hay phối hợp với KIN để khảo sát ảnh hưởng chúng đến sinh trưởng tế bào 28 3.2.1 Ảnh hƣởng 2,4-D Trên môi trường MS có 30g saccharose bổ sung thêm 2,4-D với nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l với tốc độ lắc 120 vòng/phút Khả sinh trưởng tế bào sau 15 ngày ni cấy huyền phù trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Khả sinh trƣởng tế bào huyền phù môi trƣờng bổ sung 2,4-D Khả sinh trƣởng tế bào huyền phù Khối lƣợng tƣơi (g) Khối lƣợng khô (g) b 0,5 9,16 0,37b 11,39a 0,43a 1,5 8,16c 0,35c 6,35d 0,30d 2,5 4,00e 0,16e Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa 2,4-D (mg/l) thống kê với p