ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM (WALL EX ROXB.) A.DC.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ, NĂM 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM (WALL EX ROXB.) A.DC.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Chun ngành: Hóa học hữu Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Hồi HUẾ, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Các kết thu luận án hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Hồng Thị Như Hạnh LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập, nghiên cứu thực luận án, nhận giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình quý báu nhiều cá nhân tập thể Trước hết, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồi, người tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học, Bộ mơn Hóa hữu Ban Giám Hiệu Trường THPT Đặng Trần Côn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học Tôi xin chân thành cám ơn tập thể cán phòng Dược liệu – Dược cổ truyền – Thực vật dược, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế hỗ trợ tơi q trình thực luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln cổ vũ, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Huế, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Hoàng Thị Như Hạnh MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC x MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược họ Trúc đào (Apocynaceae) 1.2 Giới thiệu chi Anodendron Vị trí phân loại Đặc điểm thực vật phân bố Các nghiên cứu thành phần hóa học Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 18 1.3 Giới thiệu sơ lược loài Tốc thằng cáng 21 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 Phương pháp phân lập, tinh chế hợp chất 24 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 24 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 26 Chương THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29 3.1 Xử lý mẫu chuẩn bị cao chiết 29 3.2 Quá trình phân lập hợp chất 30 3.3 Tính chất vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 33 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư số chất tinh khiết 36 Chương BÀN LUẬN 38 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 38 Hợp chất AP1: Cycloartenol 38 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) 40 Hợp chất AP3: (E)-Phytol 49 Hợp chất AP4: Desmosterol 50 Hợp chất AP5: Ursolic acid 52 Hợp chất AP6: Vanillin 54 Hợp chất AP7: Esculentic acid 55 Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside 57 Hợp chất AP9: Rutin 60 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) 62 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) 71 i Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) 79 Hợp chất AP13: Sargentol 87 Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid 89 Hợp chất AP15: Inugalactolipid A 90 Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A 94 Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B 97 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C 99 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol 101 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6sulfoquinovopyranosyl)glycerol 102 4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất tinh khiết 105 KẾT LUẬN 112 KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry TLC Thin Layer Chromatography Các phương pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy COSY Correlation Spectroscopy DEPT EIMS ESIMS HMBC HRESIMS HSQC HMQC IR J (Hz) NOESY ROESY UV δ (ppm) s d t singlet doublet triplet Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Impact Mass Spectrometry Electrospray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Resolution - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Infrared Spectroscopy J coupling constant Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Rotating frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ultraviolet Spectroscopy δ (ppm = part per million) q quint dd quartet quintet double doublet iii Sắc ký cột Sắc ký khí ghép khối phổ Sắc ký mỏng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ tương tác hai chiều H-1H Phổ DEPT Phổ khối va đập điện tử Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính Hz Phổ NOESY Phổ ROESY Phổ tử ngoại Độ dịch chuyển hóa học tính phần triệu dt double triplet br broad m multiplet Các dòng tế bào A549 H522 LU-1 H460 Bcap-37 MCF-7 BGC MCG MKN-7 Bel-7402 Hep-G2 DU145 LNCaP PC-3 HeLa ME-180 HL-60 P-388 HT-29 SW-480 K562 KB M-14 NBT-T2 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi Human breast adenocarcinoma Ung thư vú Human gastrocarcinoma Ung thư dày Human hepatoma Ung thư gan Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt Human cervical adenocarcinoma Ung thư cổ tử cung Human promyelocytic leukemia Lymphocytic leukemia Ung thư máu cấp tính Ung thư máu lympho Human colon carcinoma Ung thư ruột kết Chronic myelogenous leukemic Human epidermoid carcinoma Melanoma Rat bladder epithelial Ung thư bạch cầu tủy Ung thư biểu mô Khối u ác tính Ung thư bàng quang chuột Các ký hiệu viết tắt khác CTPT DBE Double Bond Equivalent ED50 Effective Dose 50% FAME Fatty Acid Methyl Ester FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power IC50 MBC Inhibitory Concentration 50% Minimum Bactericidal Concentration iv Công thức phân tử Số tương đương nối đơi Liều có tác dụng 50% cá thể Dẫn xuất methyl ester acid béo Lực chống oxy hóa đo khả khử ion sắt (III) Nồng độ ức chế 50% Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MFC Minimum Fungicidal Concentration MIC mp OD Minimum Inhibitory Concentration Melting point Optical Density CHCl3 DMSO EtOAc MeOH Chloroform Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Methanol Nồng độ diệt nấm tối thiểu Nồng độ ức chế tối thiểu Điểm chảy Mật độ quang SRB Ac Me TMS Sulforhodamine B Acetyl Methyl Tetramethylsilane Ghi chú: Tên hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học viết theo nguyên Tiếng Anh để đảm bảo tính thống xác v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các tên loài thuộc chi Anodendron chấp nhận Bảng 1.2 Sự phân bố loài thuộc chi Anodendron Việt Nam Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập từ A formicinum 19 Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế phát triển ấu trùng Bombyx mori cardenolide từ A affine 20 Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR hợp chất AP1 hợp chất tham khảo 39 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid hợp chất AP2 41 Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo hợp chất AP2 42 Bảng 4.4 Số liệu phổ NMR hợp chất AP3 hợp chất tham khảo 49 Bảng 4.5 Số liệu phổ NMR hợp chất AP4 hợp chất tham khảo 51 Bảng 4.6 Số liệu phổ NMR hợp chất AP5 hợp chất tham khảo 53 Bảng 4.7 Số liệu phổ NMR hợp chất AP6 hợp chất tham khảo 55 Bảng 4.8 Số liệu phổ NMR hợp chất AP7 hợp chất tham khảo 56 Bảng 4.9 Số liệu phổ NMR hợp chất AP8 hợp chất tham khảo 58 Bảng 4.10 Số liệu phổ NMR hợp chất AP9 hợp chất tham khảo 61 Bảng 4.11 Số liệu phổ NMR phần aglycone hợp chất AP10 70 Bảng 4.12 Số liệu phổ NMR phần đường hợp chất AP10 chất tham khảo 71 Bảng 4.13 Số liệu phổ NMR phần aglycone hợp chất AP11 77 Bảng 4.14 Số liệu phổ NMR phần đường hợp chất AP11 78 Bảng 4.15 Số liệu phổ NMR phần aglycone hợp chất AP12 84 Bảng 4.16 Số liệu phổ NMR phần đường hợp chất AP12 85 Bảng 4.17 Số liệu phổ NMR hợp chất AP13 hợp chất tham khảo 88 Bảng 4.18 Số liệu phổ NMR hợp chất AP14 hợp chất tham khảo 90 Bảng 4.19 Số liệu phổ NMR hợp chất AP15 92 Bảng 4.20 Số liệu phổ NMR hợp chất AP16 hợp chất tham khảo 95 Bảng 4.21 Số liệu phổ NMR hợp chất AP17 hợp chất tham khảo 97 Bảng 4.22 Số liệu phổ NMR hợp chất AP18 hợp chất tham khảo 100 Bảng 4.23 Số liệu phổ NMR hợp chất AP19 hợp chất tham khảo 102 Bảng 4.24 Số liệu phổ NMR hợp chất AP20 hợp chất tham khảo 104 Bảng 4.25 Thống kê hợp chất phân lập từ Tốc thằng cáng 105 vi Phổ 13C-NMR hợp chất AP16 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất AP16 PL57 Phụ lục 17 Các phổ hợp chất AP17 Phổ HRESIMS hợp chất AP17 Phổ 1H-NMR hợp chất AP17 PL58 Phổ 13C-NMR hợp chất AP17 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất AP17 PL59 Phụ lục 18 Các phổ hợp chất AP18 Phổ HRESIMS hợp chất AP18 Phổ 1H-NMR hợp chất AP18 PL60 Phổ 13C-NMR hợp chất AP18 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất AP18 PL61 Phụ lục 19 Các phổ hợp chất AP19 Phổ HRESIMS hợp chất AP19 Phổ 1H-NMR hợp chất AP19 PL62 Phổ 13C-NMR hợp chất AP19 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất AP19 PL63 Phụ lục 20 Các phổ hợp chất AP20 SO3H 6' 5' HO HO O O OH 1' 3' OH O 1'' O 16'' Phổ HRESIMS hợp chất AP20 Phổ 1H-NMR hợp chất AP20 PL64 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AP20 Phổ 13C-NMR hợp chất AP20 PL65 Phổ DEPT hợp chất AP20 Phổ HSQC hợp chất AP20 PL66 Phổ HMBC hợp chất AP20 Phổ COSY hợp chất AP20 PL67 Phổ NOESY hợp chất AP20 Sắc ký đồ GC-MS dẫn xuất methyl ester hợp chất AP20 PL68 Phụ lục 21 Biên giám định tên khoa học Tốc thằng cáng PL69 Phụ lục 22 Biên thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất phân lập từ Tốc thằng cáng PL70 PL71 ... g) ( 5) ( 4) ( 3) AW1.1 (1,05 g) AW4 (4,2 g) AW2.4 (0,55 g) AW3.3 (0,6 g) ( 6) AW4.3 (0,7 g) AW4.4 (75 mg) ( 9) AP8 AP9 ( 7) ( 8) AW3.3.3 (230 mg) AP10 (1 0) AP13 AP11 AW3.3.4 (104 mg) (1 3) (1 2) (1 1). .. 3. 3) AC Phân đoạn CHCl3 (50,7 g) ( 1) AC2 (8,3 g) ( 2) AC2.2 (1,2 g) AC2.3 (0,75 g) ( 3) ( 4) AP2 ( 1) ( 2) ( 3) ( 4) ( 5) ( 6) AP3 Pha tĩnh Silica gel Silica gel Silica gel YMC RP-18 Silica gel Silica... (1 1) AP14 AP20 AP12 AP15 ( 1) ( 2) ( 3) ( 4) ( 5) ( 6) ( 7) ( 8) ( 9) (1 0) (1 1) (1 2) (1 3) Pha tĩnh Diaion HP-20 YMC RP-18 Silica gel Sephadex LH-20 Silica gel Silica gel Sephadex LH-20 YMC RP-18 Silica gel