ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ HỒI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LỒI LAN QUÝ HIẾM HUYẾT NHUNG TRƠN (RENANTHERA IMSCHOOTIANA ROLFE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÀ NẴNG, 2015 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ HỒI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI LAN QUÝ HIẾM HUYẾT NHUNG TRƠN (RENANTHERA IMSCHOOTIANA ROLFE) Ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ThS TRẦN QUANG DẦN NIÊN KHÓA 2011 - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Hoài Phương DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid AC : Active carbon (than hoạt tính) BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) CW : Coconut water (nước dừa) IBA : Indole - butyric acid I&Y : Ichihashi & Yamashita KC : Knudson C (1965) KIN : Kinetin ĐHST : Điều hòa sinh trưởng M : Mitra et al MKC : Modified Knudson ‘C’ MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid PM : Phytamax RE : Robert Ernst (1979) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) THT : Than hoạt tính IUCN : International Union for Conservation of Nature MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược hoa phong lan 1.2 Tình hình sản xuất hoa lan giới Việt Nam 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Trong nước 1.3 Tình hình nghiên cứu hoa lan giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 1.3.2.1 Nghiên cứu thu nhập, chọn tạo đánh giá nguồn gen 1.3.2.2 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro hoa lan 1.4 Một số vấn đề nghiên cứu nhân giống in vitro 1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro hoa lan 1.4.1.1 Môi trường nuôi cấy 1.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy 1.4.1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 1.4.2 Các đường nhân giống in vitro loài lan 1.4.2.1 Nhân giống từ hạt 1.4.2.2 Nhân giống in vitro từ quan lan 13 1.5 Giới thiệu lan Huyết nhung trơn 16 1.5.1 Đặc điểm hình thái 16 1.5.2 Phân bố 16 1.5.3 Thực trạng 16 1.5.4 Một số nghiên cứu liên quan 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nguyên liệu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Nhân nhanh protocorm 18 2.2.2 Nhân nhanh chồi in vitro 19 2.2.3 Kéo dài chồi in vitro 19 2.2.4 Tạo rễ - hình thành in vitro 19 2.2.5 Huấn luyện đưa ngồi trồng vưịn ươm 19 2.2.6 Bố trí thí nghiệm xử lí số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả nhân nhanh protocorm 21 3.2 Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân chồi in vitro 25 3.3 Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả kéo dài chồi in vitro 27 3.4 Đánh giá ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro 29 3.5 Huyến luyện đưa trồng vườm ươm 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 Kết luận 32 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 3.1 Ảnh hưởng chất ĐHST nước dừa đến khả nhân nhanh protocorm sau tuần nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân chồi in vitro lan sau 12 tuần nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả kéo dài chồi in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi cấy 3.5 Đánh giá khả sống sót đưa trồng vườn ươm sau tuần Trang 21 25 27 29 31 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cây lan Huyết nhung trơn ngồi tự nhiên 18 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 18 2.3 Sơ đồ mơ tả bước thí nghiệm 18 3.1 Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân nhanh protocorm sau tuần nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả nhân nhanh protocorm sau tuần nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng KIN, NAA đến khả nhân chồi in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro sau tuần nuôi cấy 3.6 24 26 Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả kéo dài chồi in vitro sau 12 tuần nuôi cấy 3.5 22 Cây vườn ươm trồng giá thể tốt 28 30 31 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cùng với phát triển nhanh chóng xã hội, nhu cầu hoa giới nói chung Việt Nam nói riêng ngày gia tăng Chính hoa tươi trở thành loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao chiếm vị trí đặc biệt thị trường [31] Trong đó, hoa lan loài hoa nhiều người ưa chuộng lẽ mang vẻ đẹp sang trọng, khiết, đa dạng màu sắc, hình dáng hương thơm quyến rũ [7] Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) loài phong lan đẹp quý [68, 77, 79] Hoa thường nở vào mùa hạ, có màu đỏ tiếng với đặc điểm trang trí độc đáo Ở Việt Nam, Huyết nhung trơn phân bố chủ yếu số tỉnh Tây Nguyên Nam Trung Bộ Kontum, Lâm Đồng, Khánh Hịa Tuy nhiên, số lượng nhiều lồi lan tự nhiên, có lồi Huyết nhung trơn có xu hướng giảm ảnh hưởng bất lợi điều kiện môi trường nạn khai thác bừa bãi Bên cạnh đó, tự nhiên lan thường nhân giống chủ yếu hình thức sinh sản vơ tính (nhân chồi) hạt với hệ số nhân khả mầm thấp [57] Điều góp phần làm cho nhiều lồi lan đứng trước nguy tuyệt chủng Nhân giống in vitro kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xem phương pháp hữu hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều loài lan quý [4, 68, 78] Đã có nhiều tác giả ngồi nước nhân giống loài lan quý phương pháp nhân giống in vitro (Nguyễn Văn Song cs, (2011); Nguyễn Thị Sơn cs, (2012); Vũ Ngọc Lan cs, (2013); Luan cs, (2006)) [18, 10, 19, 55] Năm 2014, tác giả Phạm Thị Thu cs lần tiến hành nghiên cứu nảy mầm in vitro nhân nhanh protocorm loài lan Huyết nhung trơn với hệ số nhân protocorm tương đối cao [27] Tuy nhiên, nghiên cứu để hồn thiện quy trình nhân giống lồi lan chưa đề cập đến Chính vậy, việc hồn thiện quy trình nhân giống in vitro lồi lan Huyết nhung trơn cần thiết, từ vừa bảo tồn lồi lan khơng bị tuyệt chủng, vừa cung cấp số lượng lớn lan cho thị trường tiêu thụ cảnh Xuất phát từ sở trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống in vitro lồi lan quý Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe)” Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống lan Huyết nhung trơn với hệ số nhân giống cao, chất lượng giống tốt 2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định môi trường nuôi cấy dinh dưỡng phù hợp cho giai đoạn: + Nhân nhanh protocorm + Tái tạo chồi từ protocorm + Kéo dài chồi in vitro + Tạo rễ in vitro hình thành hồn chỉnh - Xác định giá thể để thích hợp Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học nhân giống vơ tính lan Huyết nhung trơn phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú sở liệu kĩ thuật nuôi cấy hoa lan 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài giúp đề xuất quy trình nhân giống lan Huyết nhung trơn kĩ thuật ni cấy mơ tế bào, góp phần sản xuất giống có hiệu cao, chất lượng tốt, khắc phục hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống Ứng dụng vào sản xuất góp phần phục tráng giống, góp phần bảo tồn nâng cao hiệu kinh tế ngành sản xuất hoa lan Huyết nhung trơn lan Dendrobium hybrids Sonia, cho thấy môi trường MS bổ sung 6,97 μM KIN riêng lẻ cho kết cao đạt 90% tỉ lệ phát sinh chồi [56] Nghiên cứu Hong cs đối tượng Paphiopedilum alma Gavaert mơi trường có 4,65 µM KIN thích hợp cho nhân chồi cảm ứng tạo trung bình chồi/protocorm sau 60 ngày nuôi cấy [47] Điều cho thấy, loài lan khác có mơi trường nồng độ riêng để cảm ứng tạo chồi Trong nghiên cứu chúng tôi, lan Huyết nhung trơn mơi trường P có nồng độ 1,5 mg/L KIN mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi 3.3 Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả kéo dài chồi in vitro Lan lồi có tốc độ phát triển chậm in vitro cần phải bổ sung chất ĐHST với nồng độ thích hợp để rút ngắn trình sinh trưởng Nhiều cơng trình nghiên cứu trước đối tượng Hygrochilus parishii (Sopa Choopeng cs), Acampe praemorsa Roxb (N.R Nayak) [40, 59] cho thấy, BA NAA riêng lẻ hay kết hợp có ảnh hưởng tích cực việc kéo dài đoạn thân Trong thí nghiệm này, chất ĐHST bổ sung môi trường nuôi cấy Kết ảnh hưởng BA NAA lên kéo dài chồi sau 12 tuần nuôi cấy thu bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BA, NAA đến khả kéo dài chồi lan Huyết nhung trơn Chất ĐHST Khả kéo dài chồi BA NAA Chiều cao Số lá/chồi Đặc điểm chồi (mg/L) (mg/L) chồi (cm) 5,4f 0,30d Chồi nhỏ, yếu d b 1,0 0,25 6,0 0,44 Chồi to, xanh đậm e c 1,0 0,5 5,6 0,39 Chồi nhỏ, xanh đậm d 1,0 0,75 5,5ef 0,31 Chổi nhỏ, xanh đậm g d 1,0 1,0 5,3 0,29 Chồi nhỏ, xanh đậm a a 2,0 0,25 6,8 0,57 Chồi to, xanh tươi, khỏe b b 2,0 0,5 6,3 0,45 Chồi to, xanh c bc 2,0 0,75 6,2 0,42 Chồi to, xanh d c 2,0 1,0 6,1 0,40 Chồi nhỏ, xanh Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p