BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SOFOSBUVIR TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Đức Tuấn Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SOFOSBUVIR TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ………… ) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ Nguyễn Đức Tuấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan viêm gan C 1.2 Tổng quan sofosbuvir 1.3 Một số cơng trình định lượng sofosbuvir phương pháp HPLC CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 10 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 10 2.2.2 Chuẩn bị mẫu 10 2.2.3 Thẩm định quy trình 12 2.2.4 Áp dụng quy trình định lượng sofosbuvir số chế phẩm 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 14 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 14 3.2 Thẩm định quy trình 16 3.3 Dự thảo quy trình định lượng sofosbuvir HPLC 21 3.4 Định lượng sofosbuvir số chế phẩm 23 3.5 Bàn luận 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt As Asymmetry Factor (Hệ số bất đối) CE Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản) DAA Direct Antiviral Agent (Tác nhân kháng virus trực tiếp) HCV Hepatitis C Virus HINT Histidine triad nucleotide-binding protein (Protein gắn kết histidin nucleotid tam bội) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) ICH International Council on Hamonization (Hội đồng hòa hợp quốc tế) IDSA Infectious Diseases Society of America (Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PEG Polyethylen glycone PEG-interferon Interferon polyethylen glycolate (Interferon PEG hóa) Rs Resolution (Độ phân giải) RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S Peak area (Diện tích pic) SFV Sofosbuvir tR Retention time (Thời gian lưu) UV-Vis Ultraviolet – Visible (Tử ngoại - Khả kiến) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) i Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại số thuốc nhóm DAA 04 Bảng 1.2 Phác đồ phối hợp thuốc nhóm DAA theo khuyến cáo 04 IDSA Bảng 1.3 Một số cơng trình định lượng sofosbuvir phương pháp 07 HPLC Bảng 2.1 Một vài chế phẩm chứa sofosbuvir sử dụng nghiên 08 cứu Bảng 2.2 Danh mục chất đối chiếu sử dụng nghiên cứu 08 Bảng 2.3 Danh mục dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu 09 Bảng 2.4 Danh mục trang thiết bị dùng nghiên cứu 09 Bảng 2.5 Thành phần tỷ lệ tá dược chế phẩm nghiên cứu 09 Bảng 2.6 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu phương pháp HPLC 12 Bảng 3.1 Thông số sắc ký sofosbuvir 14 Bảng 3.2 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp HPLC 16 mẫu đối chiếu mẫu thử (n=6) Bảng 3.3 Kết khảo sát tương quan nồng độ sofosbuvir diện 18 tích pic (n=12) Bảng 3.4 Kết xử lý thống kê phụ thuộc nồng độ sofosbuvir 18 diện tích pic Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp HPLC 19 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ xác trung gian phương pháp HPLC 19 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ phương pháp HPLC 20 Bảng 3.8 Kết định lượng sofosbuvir số chế phẩm 23 phương pháp HPLC ii Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo sofosbuvir 04 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu với pha động 1; mẫu đối chiếu, mẫu thử 15 mẫu giả dược với pha động Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử, mẫu giả dược, mẫu trắng mẫu phân hủy iii 17 Báo cáo tổng kết đề tài ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu Tổ chức Y tế giới (World Health Organization, WHO), năm 2016, Việt Nam có 1,1 triệu người bị viêm gan C [1] Viêm gan C nguyên nhân gây xơ gan (27%) hay ung thư gan (25%) Bệnh nhân viêm gan C khơng điều trị có nguy ung thư gan cao gấp 15 - 20 lần, nguy xơ gan tăng - 4% năm [2],[3] Trước đây, việc điều trị viêm gan C liệu pháp interferon tốn kéo dài Sự đời thuốc nhóm kháng virus trực tiếp (Direct Antiviral Agent, DAA) mở kỹ nguyên điều trị viêm gan C với đáp ứng cao, tác dụng phụ thời gian điều trị ngắn Sofosbuvir thuộc nhóm kháng virus trực tiếp hệ hai, Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Society of America, IDSA) WHO đề nghị phác đồ ưu tiên để điều trị viêm gan C, dạng phối hợp thuốc nhóm DAA khác simeprevir hay ledipasvir Phác đồ có sofosbuvir tăng đáp ứng điều trị 95% so với liệu pháp interferon (50%), giảm tác dụng phụ rút ngắn thời gian trị liệu xuống 12 tuần [4],[5] Năm 2013, chi phí cho phác đồ 12 tuần có sofosbuvir 10.000 USD Mỹ [5] Hiện nay, nhờ cam kết công ty thuốc phát minh (Gilead), thành phẩm sofosbuvir dạng nhượng quyền tự nguyện Việt Nam công ty Hetero Labs Limited Ấn Độ cung cấp bán lẻ cho người tiêu dùng với giá 3,5 đến 4,0 triệu đồng/ 28 viên Đây mức giá cao so với thu nhập trung bình người dân Việt Nam Hiện nay, số sở sản xuất thuốc Việt Nam tiến hành nghiên cứu phát triển thành phẩm sofosbuvir [6] Vì vậy, việc kiểm soát chất lượng thuốc cần ưu tiên Tuy nhiên, USP 40, BP 2017 Dược điển Việt Nam V chưa có chuyên luận nguyên liệu sofosbuvir thành phẩm tương ứng Trên giới, có vài cơng trình cơng bố quy trình định lượng sofosbuvir riêng lẽ phối hợp với thuốc điều trị viêm gan C Báo cáo tổng kết đề tài kỹ thuật quang phổ tử ngoại, sắc ký lỏng điện di mao quản [7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15] Trong nước chưa có tác giả cơng bố quy trình định lượng sofosbuvir Xuất phát từ lý trên, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng sofosbuvir chế phẩm phương pháp HPLC” thực với mong muốn đưa phương pháp định lượng sofosbuvir chế phẩm, tạo điều kiện cho sở sản xuất thuốc nước phát triển nhanh sản phẩm này, góp phần vào công tác điều trị bệnh viêm gan C Mục tiêu đề tài là: - Khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng sofosbuvir phương pháp HPLC - Thẩm định quy trình định lượng theo Hướng dẫn ICH (International Council on Hamonization) [16], Hướng dẫn Asean [17] Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục [18] - Áp dụng quy trình để định lượng sofosbuvir số chế phẩm Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan viêm gan C 1.1.1 Dịch tễ học Viêm gan C bệnh gan gây virus viêm gan C (Hepatitis C Virus, HCV), lây nhiễm chủ yếu qua đường máu dùng chung kim tiêm, vệ sinh y tế hay tiêm truyền máu chưa qua kiểm tra Thời gian ủ bệnh từ tuần đến tháng Một nghiên cứu cho thấy có 60 - 80% người nhiễm virus bị nhiễm HCV mạn tính 80% số khơng biểu triệu chứng [19] Trên giới có khoảng 71 triệu người nhiễm HCV mạn tính với 1,75 triệu trường hợp nhiễm Ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV mạn tính khoảng 1,1 triệu người Tỷ lệ chuyển biến từ viêm gan C sang xơ gan 27% ung thư gan 25% Hàng năm, khoảng 399.000 người chết bệnh lý liên quan đến viêm gan C mà chủ yếu xơ gan ung thư gan [20] Ở Việt Nam, typ HCV, tỷ lệ nhiễm typ cao (lần lượt 30% 54%) [21] 1.1.2 Một số phác đồ điều trị viêm gan C Từ HCV phát vào năm 1989, liệu pháp trị liệu sử dụng interferon-alpha, cytokin ngoại mô phản ứng miễn dịch tế bào gan với virus Khi polyethylenglycol-interferon (PEG-interferon) kết hợp ribavirin làm tăng t1/2 hiệu trị liệu Tuy nhiên, liệu pháp có nhiều tác dụng phụ tỷ lệ đáp ứng thấp (40 - 65%) [20] Năm 2013, việc điều trị viêm gan C cải thiện rõ rệt nhờ phát nhóm thuốc đường uống ức chế trực tiếp nhân virus (Direct Antiviral Agent, DAA) Nhóm DAA chia thành nhóm nhỏ theo vị trí tác động: ức chế protease NS3/4A, protease NS5A RNA polymerase NS5B Phác đồ kết hợp DAA có đáp ứng trị liệu tốt, thời gian điều trị ngắn, dùng đường uống tác dụng phụ phác đồ sử dụng interferon [20] Báo cáo tổng kết đề tài Bảng 1.1 Phân loại số thuốc nhóm DAA [20] Ức chế protease NS3/4A Ức chế Polymerase (NS5B) Cấu trúc tương Cấu trúc không tự nucleotid nucleotid Ức chế NS5A Asunaprevir Daclatasvir Paritaprevir Ledipasvir Sofosbuvir Dasabuvir Simeprevir Ombitasvir Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Society of America, IDSA) đề nghị phác đồ điều trị viêm gan C cho bệnh nhân nhiễm HCV typ trường hợp có khơng có xơ gan sau [4]: Bảng 1.2 Phác đồ phối hợp thuốc nhóm DAA theo khuyến cáo IDSA Thuốc phối hợp Elbasvir (50 mg) grazoprevir (100 mg) Glecaprevir (300 mg) pibrentasvir (120 mg) Sofosbuvir (400 mg) ledipasvir (90 mg) Sofosbuvir (400 mg) velpatasvir (100 mg) Thời gian trị liệu Liều dùng 12 tuần lần/ngày 12 tuần trường hợp có xơ gan tuần không xơ gan lần/ngày 12 tuần lần/ngày 12 tuần lần/ngày 1.2 Tổng quan sofosbuvir 1.2.1 Cấu trúc, danh pháp Công thức cấu tạo Hình 1.1 Công thức cấu tạo sofosbuvir Công thức phân tử: C22H29FN3O9P Trọng lượng phân tử: 529,45 g/mol Báo cáo tổng kết đề tài PL-13 Báo cáo tổng kết đề tài PL-14 Báo cáo tổng kết đề tài - Sắc ký đồ thẩm định độ xác trung gian PL-15 Báo cáo tổng kết đề tài PL-16 Báo cáo tổng kết đề tài PL-17 Báo cáo tổng kết đề tài PL-18 Báo cáo tổng kết đề tài - Sắc ký đồ thẩm định độ PL-19 Báo cáo tổng kết đề tài PL-20 Báo cáo tổng kết đề tài PL-21 Báo cáo tổng kết đề tài PL-22 Báo cáo tổng kết đề tài PL-23 Phụ lục Phụ lục 2: Định lượng số chế phẩm phương pháp HPLC - Sắc ký đồ mẫu đối chiếu mẫu thử PL-24 Phụ lục PL-25 Phụ lục PL-26 Phụ lục PL-27 ... CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SOFOSBUVIR TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU... 2,0% [18] 2.2.4 Áp dụng quy trình định lượng sofosbuvir số chế phẩm Quy trình định lượng sofosbuvir sau thẩm định đạt yêu cầu áp dụng để định lượng sofosbuvir số chế phẩm lưu hành thị trường... sau: - Tiếp tục ứng dụng quy trình để định lượng sofosbuvir nhiều mẫu thành phẩm - Xây dựng quy trình định lượng sofosbuvir chất chuyển hóa huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng, sở để đánh giá