1 Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN Nguyễn Như Hiền Di truyền tế bào NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2005 Từ khoá: Thể nhiểm sắc tế bào, T Morgan, C B Bridges, Kiểu nhân, Băng nhiễm sắc Tài liệu Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên sử dụng cho mục đích học tập nghiên cứu cá nhân Nghiêm cấm hình thức chép, in ấn phục vụ mục đích khác không chấp thuận nhà xuất tác giả Mục lục Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN 2.1 Hình thái thể nhiễm sắc 2.1.1 Kích thước thể nhiễm sắc 2.1.2 Số lượng thể nhiễm sắc 2.2 Cấu trúc hiển vi thể nhiễm sắc 2.2.1 Thể nhiễm sắc thường thể nhiễm sắc giới tính 2.2.2 Trung tiết (Centromere) 10 2.2.3 Thể mút (telomere) 11 2.2.4 Các băng nhiễm sắc (chromosome bands) 12 2.3 Cấu trúc siêu vi thể nhiễm sắc 13 2.4 Học thuyết thể nhiễm sắc Di truyền 14 2.4.1 Thí nghiệm T Morgan 14 2.4.2 Thí nghiệm C B Bridges 16 2.4.3 Cơ sở thể nhiễm sắc quy luật Mendel 17 2.5 Kiểu nhân - Tiến hóa kiểu nhân 18 2.5.1 Kiểu nhân (caryotype) 18 2.5.2 Tiến hóa kiểu nhân tế bào nhân chuẩn (Eukaryota) 23 2.5.3 Nghiên cứu kiểu nhân côn trùng truyền bệnh 28 2.5.4 Phương pháp nhận biết loài 30 Chương Thể nhiễm sắc tế bào - tổ chức chứa ADN Mục tiêu: Sau học xong chương học viên có khả năng: - Trình bày cấu trúc hiển vi, siêu hiển vi phân tử thể nhiễm sắc - Phân biệt đơn bội, lưỡng bội, đa bội thể nhiễm sắc - Phân biệt cặp thể nhiễm sắc thường cặp thể nhiễm sắc giới tính sở thể nhiễm sắc xác định giới tính - Chứng minh sở thể nhiễm sắc di truyền - Nắm kỹ thuật làm kiểu nhân kỹ thuật nhuộm cắt băng 2.1 Hình thái thể nhiễm sắc 2.1.1 Kích thước thể nhiễm sắc Thể nhiễm sắc tế bào nhân chuẩn quan sát trung kỳ nguyên phân thường có dạng hình chấm hình que thường có kích thước vào khoảng 0,2 - 3μm đường kính 0,2 - 50μm chiều dài Ví dụ thể nhiễm sắc người, bé thể nhiễm sắc số 21 22 có kích thước L = 1,5μm; cịn lớn thể nhiễm sắc số có L = 10μm Về kích thước thể nhiễm sắc nói chung mang tính đặc trưng cho tế bào cá thể lồi Tuy nhiên, có trường hợp mô khác thể có biến đổi hình dạng kích thước thể nhiễm sắc để thích nghi với chức giai đoạn phát triển Ví dụ, tế bào mơ tuyến nước bọt ấu trùng lồi hai cánh ruồi (Drosophila) người ta quan sát thấy thể nhiễm sắc khổng lồ (còn gọi thể nhiễm sắc đa sợi) có kích thước đạt tới L = 300μm D = 20μm nghĩa lớn gấp hàng chục lần so với thể nhiễm sắc bình thường có mơ khác thể ruồi (xem hình 2.1) Hình 2.1 Sơ đồ chi tiết thể nhiễm sắc khổng lồ tuyến nước bọt Drosophilla 2.1.2 Số lượng thể nhiễm sắc Về số lượng thể nhiễm sắc tiêu đặc trưng cho loài thể nhiễm sắc Theo quy luật chung, cá thể loài có số lượng thể nhiễm sắc đặc trưng cho lồi Ví dụ: Người (Homo sapiens) 2n = 46 Vượn (Gorilla gorila) 2n = 48 Khỉ (Macaca rhezus) 2n = 42 Bị rừng (Bos taurus) 2n = 60 Chó (Canis familiaris) 2n = 78 Mèo (Felis domesticus) 2n = 38 Ngựa (Equus calibus) 2n = 64 Chuột nhắt (Mus musculus) 2n = 40 Chuột cống (Rattus norvegicus) 2n = 42 Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44 Gà (Gallus domesticus) 2n = 78 Cá sấu (Alligator mississipiensis) 2n = 32 Ếch (Rana pipiens) 2n = 26 Cá chép (Cyprinus carpio) 2n = 104 Tằm dâu (Bombyx mori) 2n = 56 Ruồi nhà (Musca domestica) 2n = 12 Ruồi (Drosophila melanogaster) 2n = Đỉa phiến (Planaria torva) 2n = 16 Thủy tức (Hydra vulgaris) 2n = 32 Giun tròn (Caenorhabditis elegens) 2n = 11(đực), 12(cái) Thuốc (Nicotiana tabacum) 2n = 48 Khoai tây (Solanum tuberosum) 2n = 48 Hành (Allium cepa) 2n = 16 Cà chua (Lycopersicum solanum) 2n = 24 Lúa mì mềm (Triticum vulgare) 2n = 42 Đậu (Pisum sativum) 2n = 14 Ngô (Zea mays) 2n = 20 Tảo lục (Acetabularia mediteranea) 2n = 20 Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 2n = 36 Tuy nhiên, ta khơng thể máy móc dựa vào số lượng thể nhiễm sắc để đánh giá mức độ tiến hóa lồi, lẽ thể mức độ tiến hóa cao lại có số lượng thể nhiễm sắc (ví dụ: người có 46 thể nhiễm sắc, số lượng thể nhiễm sắc vượn 48 gà có đến 78 thể nhiễm sắc) giống hàm lượng ADN, có tính ổn định lồi chưa thể tính logic bậc thang tiến hóa Vấn đề cần phải xem xét mức độ tổ chức hoạt động hệ gen ADN thể nhiễm sắc Số lượng thể nhiễm sắc đặc trưng cho thể nhiễm sắc Người ta phân biệt: + Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu n đặc trưng cho tế bào, thể đơn bội tế bào sinh dục chín (các giao tử) thể sinh sản hữu tính Ví dụ người, tinh trùng tế bào trứng có n = 23 thể nhiễm sắc + Bộ lưỡng bội (diploid) ký hiệu 2n đặc trưng cho tế bào thể lưỡng bội Trong thể sinh sản hữu tính tế bào soma có chứa 2n thể nhiễm sắc Ví dụ người 2n = 46 tập hợp 23 thể nhiễm sắc tinh trùng 23 thể nhiễm sắc tế bào trứng sau thụ tinh tạo thành hợp tử có 2n = 46 Như vậy, thể lưỡng bội, thể nhiễm sắc tồn thành cặp (một từ bố từ mẹ) gọi cặp thể nhiễm sắc tương đồng, cặp hình thành từ lúc thụ tinh (2n) phân ly lúc phân bào giảm nhiễm (n) + Bộ đa bội (polyploid), đặc trưng cho tế bào thể đa bội Số thể nhiễm sắc tăng lên theo bội số n Ví dụ, tam bội 3n (triploid), tứ bội 4n (tetraploid) Nhiều trường hợp lồi giống (genus) có số thể nhiễm sắc tạo thành dãy đa bội người ta phân biệt số đơn bội khởi nguyên x từ hình thành dạng đa bội Ví dụ: lúa mì (Triticum) có dãy đa bội là: Triticum monococum 2n = 14 (n = 7) Triticum dicocum 2n = 28 (n=14) Triticum vulgare 2n = 42 (n = 21) Trong số đơn bội khởi nguyên x = Hiện tượng đa bội thường thấy thực vật, cịn động vật có trường hợp đa bội Ở ếch người ta quan sát thấy có trường hợp bát bội 8n = 104 thể nhiễm sắc Ở động vật có vú trường hợp đa bội quan sát thấy chuột đồng (Cricetus cricetus) Nói chung, động vật bậc cao tế bào mô đa bội thể tính trạng bệnh lý Người ta quan sát thấy chu kỳ xoắn thể nhiễm sắc thay đổi qua chu kỳ tế bào Ở gian kỳ sợi nhiễm sắc trạng thái mở xoắn nhiều mức độ khác tồn dạng chất nhiễm sắc Ở tiền kỳ mitos sợi nhiễm sắc trở nên xoắn hơn, bị đơng đặc co ngắn lại, đến trung kỳ thấy rõ trạng thái xoắn tối đa (so với đầu tiền kỳ độ co ngắn gấp 2,5 lần) đến mạt kỳ giãn xoắn để bước vào gian kỳ tế bào trạng thái sợi chất nhiễm sắc mở xoắn – trạng thái chất nhiễm sắc Sự giãn xoắn xoắn lại thể nhiễm sắc có liên quan đến chức chúng 2.2 Cấu trúc hiển vi thể nhiễm sắc 2.2.1 Thể nhiễm sắc thường thể nhiễm sắc giới tính Trong lưỡng bội, thể nhiễm sắc tồn thành cặp tương đồng, ví dụ người có 23 cặp tương đồng, cặp thành viên (1 thể nhiễm sắc từ bố, từ mẹ) giống hình dạng, kích thước Những cặp gọi thể nhiễm sắc thường (autosome) Ngồi cịn có cặp thành viên khác hình dạng, kích thước trạng thái hoạt động gọi thể nhiễm sắc giới tính (sex chromosome) Ví dụ, người có 22 cặp thể nhiễm sắc thường cặp (cặp thứ 23) thể nhiễm sắc giới tính Ở nam giới, cặp thể nhiễm sắc giới tính XY, cịn nữ giới XX (xem hình 2.2) Hình 2.2 Kiểu nhân (Caryotip) người Cặp thể nhiễm sắc giới tính sở di truyền để xác định giới tính xác định tính di truyền liên kết giới tính đa số thể sinh sản hữu tính 2.2.1.1 Cơ sở thể nhiễm sắc xác định giới tính Đa số thể đa bào sinh sản phương thức hữu tính phân hóa giới tính đực giới tính Giới tính biểu tính trạng sinh dục ngun sinh (có tuyến sinh dục tinh hồn, buồng trứng) tính trạng sinh dục thứ sinh (các phần phụ sinh dục tính trạng khác thể phân biệt đực cái) Những tính trạng qui định nhân tố di truyền nhân tố môi trường thể mơi trường ngồi Đối với đa số thể giới tính xác định thể nhiễm sắc giới tính (sexchromosome) thể kiểu: + Kiểu đồng giao tử (XX) dị giao tử (XY) đực (ví dụ đa số sâu bọ châu chấu, ruồi v.v., động vật có vú, người, số thực vật có hoa) có cặp thể nhiễm sắc tương đồng giống XX, cịn đực có cặp tương đồng khác nhau: X Y Thể nhiễm sắc X có kích thước dài chứa nhiều gen thể nhiễm sắc Y (ví dụ người thể nhiễm sắc X chứa 163 triệu cặp nucleotit với 1.218 gen, lúc thể nhiễm sắc Y chứa có 51 triệu cặp nucleotit với 128 gen) Như vậy, thể nhiễm sắc X có nhiều gen khơng có alen tương ứng so với Y giới tính xác định có mặt thể nhiễm sắc X, cịn giới tính đực xác định có mặt thể nhiễm sắc Y Nghiên cứu nhiều trường hợp sai lệch giới tính người cho thấy: giới tính xác định có mặt hay khơng nhiễm sắc Y Ví dụ trường hợp hội chứng Turner có kiểu gen X0 (một thể nhiễm sắc X khơng có Y) nữ giới, cịn trường hợp hội chứng Clinfenter có kiểu gen XXY có hai XX có Y nên giới tính nam Rõ ràng thể nhiễm sắc Y có tác động trội định giới tính, thể chỗ qúa trình phát triển sớm phơi thể nhiễm sắc Y điều khiển phát triển mầm tuyến sinh dục ngun thủy thành tinh hồn (tính trạng sinh dục nguyên sinh) tinh hoàn chế tiết testosteron kích thích hình thành tính trạng đực thứ sinh Người ta chứng minh nhân tố xác định tinh hồn mã hóa gen SRY (sex- determining region Y) định vị vế ngắn thể nhiễm sắc Y người Có nhiều trường hợp sai lệch giới tính thể chỗ nam giới có kiểu gen XX ngược lại nữ giới có kiểu gen XY Trong trường hợp nam XX gen SRY chuyển đoạn sang X chúng điều khiển phát triển tinh hồn, cịn trường hợp nữ XY Y khơng có gen SRY thiếu nhân tố phát triển tinh hồn mầm tuyến sinh dục phát triển thành buồng trứng Nhiều nghiên cứu chứng minh gen SRY có thể nhiễm sắc Y chuột phát chế phân tử điều khiển phát triển giới tính từ gen SRY thơng qua hệ hormon testosteron thụ quan testosteron Đối với đực XY bình thường, gen SRY sản sinh nhân tố xác định tinh hồn (TDF- testis determining factor) kích thích vùng tủy mầm tuyến sinh dục phát triển thành tinh hoàn, tinh hồn chế tiết testosteron kích thính phát triển tính trạng sinh dục thứ sinh đực Đối với XX bình thường khơng có Y (khơng có gen SRY) nên khơng có nhân tố TDF, vùng tủy mầm tuyến sinh dục khơng phát triển thành tinh hồn mà vùng vỏ tuyến phát triển buồng trứng, buồng trứng chế tiết hormon estrogen kích thính phát triển tính trạng sinh dục thứ sinh Đối với trường hợp sai lệch giới: XY (có Y cái) có Y phát triển giới tính Y gen SRY nên khơng có nhân tố TDF, vùng tủy mầm tuyến sinh dục khơng phát triển thành tinh hồn, trái lại vùng vỏ mầm sinh dục phát triển thành buồng trứng Thật gen SRY xác định giới tính đực thông qua tương tác với nhiều gen khác định vị thể nhiễm sắc thường thể nhiễm sắc X Ví dụ gen SOX9, gen SF1, gen AMH thể nhiễm sắc thường phối hợp với gen SRY xác định giới tính đực Người ta phát gen DAX1 định vị thể nhiễm sắc X có vai trị phối hợp với gen SRY xác định giới tính đực Gen DAX1 mã hóa cho thụ quan hormon tesotsteron testosteron thu nhận xâm nhập vào tế bào để hoạt hóa gen có vai trị tạo nên tính trạng sinh dục đực thứ sinh Những đực XY có gen DAX1 bị đột biến khơng sản sinh thụ quan testosteron khơng thu nhận vào tế bào thể phát triển theo hướng hóa Đối với XX, gen DAX1 phối hợp với gen WNT4 (định vị thể nhiễm sắc thường) xác định phát triển buồng trứng Ở đực gen WTN4 bị ức chế, gen DAX1 phối hợp với gen SRY xác định phát triển tinh hoàn Đối với ruồi quả, có cặp thể nhiễm sắc giới tính XX (con cái) XY (con đực), chế xác định giới tính xác định giới tính khác với động vật có vú thể nhiễm sắc Y chúng khơng có gen xác định giới tính SRY Sự xác định giới tính ruồi diễn theo chế: tỷ lệ thể nhiễm sắc X với thể nhiễm sắc thường Ruồi nhiễm sắc 2n = có cặp giới tính XX (con cái) XY (con đực) cặp thể nhiễm sắc thường kí hiệu AA Tỷ lệ X/A qui định giới tính ruồi (xem bảng sau) NSTgiới (X) NST thường (A) Tỷ lệ X/A Kiểu hình giới 1X 2A 0.5 Con đực 2X 2A 1.0 Con 3X 2A 1.5 Siêu 4X 3A 1.33 Siêu 4X 4A 1.0 Con tứ bội 3X 3A 1.0 Con tam bội 3X 4A 0.75 Trung giới 2X 3A 0.67 Trung giới 2X 4A 0.5 Con đực tứ bội 1X 3A 0.33 Siêu đực Qua bảng ta thấy rõ ruồi kể đực, thể nhiễm sắc Y không gây ảnh hưởng lên kiểu hình giới tính Tuy nhiên, Y gây ảnh hưởng lên tính hữu thụ đực Ngày người ta biết gen Sxl gọi gen gây chết giới (Sex- lethal) định vị X đóng vai trị chủ yếu xác định giới tính ruồi theo chế sau: - XY/ AA → 0.5 → gen Sxl không hoạt động → đực - XX/ AA → 1.0 → gen Sxl hoạt động → Nếu gen Sxl hoạt động ngược lại (hoạt động phôi đực không hoạt động phơi cái) gây chết cho phơi (nên có tên gọi gen gây chết) Trạng thái hoạt động gen Sxl liên kết với X (định vị X) liên quan chặt chẽ với hoạt động gen khác định vị thể nhiễm sắc thường (AA) Ví dụ thể nhiễm sắc số ruồi có gen lặn tra (transformer gene), trạng thái đồng hợp biến ruồi lưỡng bội thành ruồi đực bất thụ: cá thể XX/ tratra có tính trạng giống đực bình thường bất thụ + Kiểu đồng giao tử đực (ZZ) dị giao tử (ZW) (quan sát thấy loài bướm, chim số lồi bị sát), đực nhiễm sắc tương đồng giống nhau, cịn đực có cặp tương đồng khác nhau, thể nhiễm sắc W bé khơng có đoạn tương đồng với Z + Kiểu xác định giới tính 2n- n (con → 2n, đực → n) quan sát thấy số sâu bọ sống thành xã hội mà điển hình ong mật Con đực phát triển từ trứng đơn bội không thụ tinh, nhiễm sắc n, cịn ong thợ ong chúa ong phát triển từ trứng thụ tinh, nhiễm sắc 2n Sự điều chỉnh tỷ lệ giới quần thể ong chúa Ong chúa thụ tinh ong đực tinh trùng tích trữ túi chứa tinh ong chúa Khi ong chúa đẻ trứng trứng thụ tinh tinh trùng từ túi chứa tinh phát triển thành ong 2n, ong chúa đẻ trứng khơng thụ tinh trứng đơn bội phát triển thành ong đực n Ong chúa điều khiển sinh sản nhiều ong thợ nhiễm sắc 2n bất thụ (không đẻ trứng) làm nhiệm vụ kiếm ăn, xây tổ, chăm sóc ni dưỡng ong chúa ong đực sinh sản ong đực nhiễm sắc đơn bội hữu thụ nghĩa có khả giao cấu cung cấp tinh trùng cho ong chúa Qua qúa trình giảm phân nỗn bào ong chúa phân chia tạo nên trứng đơn bội Đối với ong đực tinh bào không giảm phân mà thông qua qúa trình nguyên phân để tạo nên tinh trùng đơn bội Ong chúa phát triển từ ấu trùng nuôi dưỡng thức ăn đặc biệt (sữa ong chúa) nên có kích thước lớn có khả sinh sản Mỗi quần thể (tổ ong) thường có ong chúa san đàn ong chúa tạo từ ấu trùng 2.2.1.2 Sự bù liều gen liên kết X Các thể sinh sản hữu tính đực cái, gen có (genalen) định vị thể nhiễm sắc tương đồng Nhưng thể nhiễm sắc giới tính, có 2X cịn đực có 1X nghĩa gen X có alen tương ứng, cịn đực gen X khơng có alen tương ứng Để bù đắp cho thiếu hụt có chế bù liều (dosage compensation) thuộc kiểu khác nhau: (1) bất hoạt thể nhiễm sắc X (quan sát thấy động vật có vú), (2) tăng cường hoạt động thể nhiễm sắc X đực (quan sát thấy ruồi quả) - Bất hoạt gen liên kết - X động vật có vú Cơ chế bất hoạt X động vật có vú Mary Lyon đề xuất từ năm 1961 nghiên cứu chuột nhắt Sự bất hoạt X xảy qúa trình phát triển phơi chuột phơi đạt cỡ vài nghìn tế bào Sự lựa chọn bất hoạt X 2X ngẫu nhiên, tùy thuộc vào tế bào kết toàn tế bào thể chứa X bất hoạt (chứa gen không hoạt động) Như vậy, động vật có vú chứa hai dịng tế bào khảm di truyền: dòng chứa X bất hoạt đến từ mẹ dòng chứa X bất hoạt đến từ bố Cá thể dị hợp tử gen liên kết - X có khả cho kiểu hình khác Ví dụ điển hình kiểu hình khảm quan sát thấy màu lông chuột mèo Đối với loài, thể nhiễm sắc X chứa gen qui định màu lông Con dị hợp gen có đặc điểm khảm màu lơng: lơng có đốm sáng (trắng, vàng) xen lẫn đốm đen (ví dụ mèo đốm, chuột đốm, chó đốm) Màu đốm trắng alen qui định, màu đốm đen alen qui định Tuy chế bất hoạt X nhiều 10 vấn đề chưa sáng tỏ, nhiều nghiên cứu di truyền chứng minh bất hoạt xảy vùng vế dài X gọi trung tâm bất hoạt X – XIC (X- inactivation center) Từ vùng XIC bất hoạt lan hai vế X thể methyl hóa ADN xoắn lại đặc sợi nhiễm sắc (dị nhiễm sắc hóa - heterochromatine) Thể nhiễm sắc X bị dị nhiễm sắc hóa thể thể Barr (được Muray Barr phát lần đầu tiên) nhân tế bào soma (thấy rõ tế bào xoang miệng nữ giới) Thể nhiễm sắc X bất hoạt tồn tất tế bào soma thể, dòng tế bào mầm (tế bào sinh dục) X bất hoạt tái hoạt hóa cần thiết cho qúa trình sinh trứng (oogenesis) Ở người trường hợp sai lệch thể nhiễm sắc giới tính, nữ giới có số lượng XXX bình thường X họ bất hoạt - Tăng hoạt tính gen liên kết thể nhiễm sắc X ruồi đực Đối với ruồi bù liều gen xảy theo chế tăng cường hoạt động gen thể nhiễm sắc X đực, có vai trị gen Sxl (gen gây chết) gen có tác động chủ đạo xác định giới tính Ở gen Sxl hoạt động, cịn đực gen Sxl khơng hoạt động Khi khơng có sản phẩm gen Sxl (gen Sxl không hoạt động đực), phức hệ protein tác động kích thích gen X tăng cường hoạt động gấp hai lần Khi gen Sxl hoạt động (ở cái), sản phẩm gen Sxl kìm hãm phức hệ protein tăng cường hoạt động gen X không xảy Bằng chế bù liều hoạt động gen liên kết với X cân 2.2.2 Trung tiết (Centromere) Trung tiết cấu trúc định khu chiều dọc thể nhiễm sắc vùng gọi eo thắt cấp (primary constriction) Ở trung kỳ ta dễ dàng quan sát thấy trung tiết trung tiết nơi hai nhiễm sắc tử đính kết với Ở trung kỳ sớm trung tiết phân hóa thành tâm động (kinetochore) để đính với sợi tâm động thoi phân bào phía đối mặt với cực có chức di chuyển nhiễm sắc tử cực Nghiên cứu sinh học phân tử cho biết vùng trung tiết (của thể nhiễm sắc Nấm men mọc chồi – Saccharomyces cerevisiae) cấu tạo gồm đoạn ADN khơng có cấu trúc nucleoxom, chứa khoảng 125 cặp nucleotit gồm đoạn, đoạn I đoạn III hai đầu cuối đoạn II giữa, đoạn II có khoảng 90 cặp nucleotit giàu A:T (>90%) có khả liên kết với protein sợi tâm động thoi phân bào tạo thành tâm động Trung tiết có vai trò vận chuyển nhiễm sắc tử hai cực tế bào (thơng qua tạo tâm động) Ngồi ra, người ta cho tâm động cịn có chức tham gia vào di truyền ngoại sinh (epigenetic) biến đổi di truyền không biến đổi nucleotit ADN mà thay đổi biểu gen methyl hóa ADN liên kết ADN với protein cấu trúc không gian sợi nhiễm sắc thể nhiễm sắc Đối với Nấm men phân đôi (Schizosaccharomyces pombe), ruồi người, trung tiết có cấu tạo phức tạp nhiều Trung tiết S pombe gồm 110.000 cặp nucleotit, ruồi gồm 420.000 cặp nucleotit người gồm từ 300.000 cặp (trung tiết thể nhiễm sắc Y) triệu cặp nucleotit (trung tiết thể nhiễm sắc số 7), chứa nhiều ADN satellit ADN chứa nhiều nucleotit lặp Trung tiết chia thể nhiễm sắc thành hai vai, chiều dài hai vai phụ thuộc vào vị trí trung tiết Người ta thành lập số trung tiết (centromere index Ic) để xác định vị trí trung tiết phân loại thể nhiễm sắc (xem hình 1.7) Ic = P P+Q 17 Bridges quan sát thấy ruồi XXX mà có Xw+ ruồi mắt đỏ, ruồi với XwXw+Y Xw+Xw+Y ruồi mắt đỏ Ruồi với kiểu gen Xw+O ruồi đực mắt đỏ hữu thụ Còn ruồi có kiểu gen YO ruồi đực khơng có sức sống chết sớm Bridges gọi tượng không phân ly thể nhiễm sắc qua giảm phân có liên quan đến tính trạng gen định khu thể nhiễm sắc tương ứng, ông chưa nghiên cứu nguyên nhân tượng Về sau nhà nghiên cứu di truyền tế bào người chứng minh người xảy tượng không phân ly thể nhiễm sắc qua giảm phân tạo dạng lệch bội (aneuploide) thể nhiễm sắc giới tính (XO XXY) mà cịn thể nhiễm sắc thường (ví dụ thể ba nhiễm sắc 21- gây hội chứng Down xem phần sau) nguyên nhân tuổi đời người mẹ qúa cao (trên 35 tuổi) 2.4.3 Cơ sở thể nhiễm sắc quy luật Mendel Năm 1865, Mendel trình bày thí nghiệm quy luật di truyền phải đến 35 năm sau, năm 1900 thí nghiệm tái phát H.de Vries, C Correns E Tschermak công nhận rộng rãi, sau năm 1880 nhà nghiên cứu phát thể nhiễm sắc tập tính thể nhiễm sắc tạo thành cặp tương đồng bố mẹ (2n) phân ly vào giao tử (n) kết hợp lại hợp tử (2n) thụ tinh Nhân tố di truyền mà Mendel giả định thành cặp bố mẹ, chúng tồn quy định nên tính trạng khơng hịa lẫn vào mà phân ly lại tổ hợp lại hệ sau Các nhân tố di truyền Mendel giả định sau gọi gen (Johannsen 1909) Ví dụ cặp thể nhiễm sắc tương đồng, (bố) mang alen A (mẹ) mang alen a (hoặc ngược lại) Cơ thể bố mẹ 2n AA (đồng hợp trội), aa (đồng hợp lặn) Aa (dị hợp) phân ly cho A a, tổ hợp lại cho AA, aa Aa Đó qui luật phân ly Mendel nghiên cứu với cặp gen - alen Nếu hai cặp gen – alen định khu hai cặp thể nhiễm sắc tương đồng khác chúng phân ly độc lập tổ hợp tự theo qui luật Mendel Ví dụ, cặp gen - alen Aa cặp thể nhiễm sắc tương đồng cặp gen - alen Bb cặp thể nhiễm sắc tương đồng khác chúng phân ly độc lập tổ hợp tự (nghĩa không phụ thuộc vào nhau) tạo giao tử hình thành hợp tử, nghĩa tạo nên bốn loại giao tử khác AB, ab, Ab, aB tổ hợp tự tạo nên 16 loại hợp tử khác 18 Một điều kiện cần cho qui luật hai cặp gen - alen (A-a B-b) phải hai cặp thể nhiễm sắc tương đồng khác Hiện tượng di truyền liên kết nghĩa di truyền tính trạng qui định gen định khu thể nhiễm sắc W Bateson R Punnet nghiên cứu từ đầu kỷ XX đối tượng đậu Họ chứng minh rằng, gen qui định màu hoa gen qui định độ dài hạt phấn di truyền không độc không tuân theo định luật phân ly độc lập Mendel Về sau, T Morgan học trị ơng H Sturtevant chứng minh tượng di truyền liên kết di truyền hốn vị gen có liên quan đến thể nhiễm sắc Di truyền liên kết gen định khu thể nhiễm sắc qua giảm phân phân ly giao tử, cịn di truyền hốn vị gen (hay di truyền liên kết khơng hồn tồn) có hoán vị gen hai thể nhiễm sắc tương đồng tiền kỳ giảm phân I Dựa nghiên cứu di truyền liên kết di truyền hoán vị, người ta chứng minh tế bào số thể nhiễm sắc (ví dụ ruồi 2n=8) lúc số lượng gen nhiều (ví dụ ruồi có khoảng 13.000 gen) Vì vậy, thể nhiễm sắc chứa nhiều gen Các gen định khu thể nhiễm sắc xếp theo dãy dọc liên tiếp tạo thành nhóm liên kết (ví dụ ruồi có n = tức có nhóm liên kết) dựa vào tượng di truyền liên kết di truyền hoán vị, người ta thành lập đồ thể vị trí gen định vị thể nhiễm sắc theo dãy dọc Ngày nay, di truyền học phân tử chứng minh thể nhiễm sắc chứa phân tử ADN dài gen xếp theo dãy dọc liên tục, tức theo trình tự xếp nucleotit phân tử ADN Với kỹ thuật giải trình tự nucleotit hệ gen, người ta xây dựng đồ gen (gen map) nhiều thể sinh vật kể người 2.5 Kiểu nhân - Tiến hóa kiểu nhân 2.5.1 Kiểu nhân (caryotype) Tập hợp tất thể nhiễm sắc trung kỳ phân chia tế bào gọi kiểu nhân Ở hầu hết sinh vật, tế bào có kiểu nhân Tuy nhiên, thể nhiễm sắc mang tính đặc thù cho lồi số lượng, hình dạng kích thước trung kỳ ngun phân Thậm chí sinh vật có quan hệ gần gũi có kiểu nhân khác Ví dụ thể nhiễm sắc lưỡng bội người 46, tinh tinh 48, thỏ 44, chuột nhà 40, đậu vườn 14; thể nhiễm sắc lục tảo 16, nấm men bánh mì 17, nấm mốc xanh bánh mì v.v Kiểu nhân người gồm 46 thể nhiễm sắc, tạo nên 22 cặp thể nhiễm sắc thường (autoxom) cặp thể nhiễm sắc giới tính 22 cặp thể nhiễm sắc thường chia thành bảy nhóm ký hiệu từ A-G, dựa vào kích thước vị trí thể nhiễm sắc Như vậy, cặp thể nhiễm sắc số lớn sau đến cặp số tiếp tục vậy, nhiên cặp thể nhiễm sắc số 21 lại nhỏ cặp thể nhiễm sắc số 22 mang tính lịch sử Cặp thể nhiễm sắc số 23 quy định giới tính, nam gồm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc Y X có kích thước lớn Y nữ XX Những hiểu biết kích thước, hình thái, kiểu nhuộm băng thể nhiễm sắc cho phép xác định số đột biến chúng Ví dụ thể nhiễm sắc thay đổi hình dạng thêm vào phần thể nhiễm sắc thay đổi số đoạn với thể nhiễm sắc không tương đồng khác Mặt khác số lượng thể nhiễm sắc thay đổi 19 kiểu nhân sai sót qúa trình phân chia tế bào, ví dụ thể nhiễm sắc khơng phân chia, đột biến thể nhiễm sắc 2.5.1.1 Nghiên cứu kiểu nhân người Các chất giêm sa, orcein chất nhuộm đồng hình, khó phân biệt thể nhiễm sắc có kích thước hình dạng giống Tuy nhiên, có số phương pháp nhuộm tạo thể nhiễm sắc bắt màu đậm, nhạt khác nhau, cho băng nhuộm đặc trưng Nhờ băng nhuộm người ta dễ dàng phân biệt thể nhiễm sắc có hình dạng kích thước giống Ở tế bào nhân chuẩn, thể nhiễm sắc có phân hóa cao cấu trúc chức Sự phân hóa tổ chức vật chất di truyền tế bào nhân chuẩn thể qua phân hóa thể nhiễm sắc chiều ngang lẫn chiều dọc Bằng phương pháp nhuộm đặc biệt gọi nhuộm cắt băng (banding techniques) thấy rõ vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) phân bố riêng đặc trưng cho thể nhiễm sắc loài Nhiều nghiên cứu sinh hóa tế bào cho thấy miền dị nhiễm sắc chứa số lượng gen nhỏ, sợi nhiễm sắc vùng luôn trạng thái xoắn với hàm lượng ADN cao Chức chất dị nhiễm sắc, tác giả cho thấy, có ý nghĩa qúa trình tiếp hợp phân ly thể nhiễm thể tương đồng, đặc biệt qúa trình tiến hóa, thơng qua tái cấu trúc thể nhiễm sắc điều hòa hoạt động gen Có thể phát vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin region) thể nhiễm sắc phương pháp nhuộm băng Rooney tổng kết 20 phương pháp nhuộm băng điển hình, băng Giêmsa (G - banding), băng Quinacrin (Q - banding), băng C (C - banding) băng huỳnh quang (Hoechest - 33258: H - 33258 banding) nhiều phương pháp nhuộm băng khác Kỹ thuật nhuộm băng giêmsa ứng dụng rộng rãi nghiên cứu thể nhiễm sắc đặc biệt côn trùng Chi tiết phương pháp nhuộm băng trình bày đây: a) Phương pháp nuôi cấy tủy xương Phương pháp nuôi cấy máu tủy xương 24 mơi trường nhân tạo để tìm thể nhiễm sắc bất thường Nguyên lý kỹ thuật dựa phân bào tự nhiên tế bào non máu tủy mà không cần sử dụng chất kích thích phân bào P.H.A (Phytohaemaglutinin) * Tiến hành ni cấy Nuôi cấy tủy xương 24 (dựa theo kỹ thuật B Durtillaux J Coutuier, 1981; C Harison, 1987) + Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ kim chọc tủy, bơm tiêm, lọ nuôi cấy v.v phải sấy vô trùng trước sử dụng, thao tác phải đảm bảo từ khâu lấy bệnh phẩm (lấy tủy lấy máu) kết thúc nuôi cấy + Bước 2: Thao tác lấy bệnh phẩm Đặt bệnh nhân nằm sấp, chân duỗi thẳng, tay để phía đầu Sát trùng vùng mào chậu định chọc tủy cồn iot cồn 70o Gây tê điểm chọc tủy để thông lấy tủy Bơm tiêm vô 20 trùng tráng 0,1ml heparin 5000UI/ml để chống đông máu Hút lấy khoảng 0,5-1ml dịch tủy xương, lắc nhẹ cho tủy hòa với heparin để không bị đông + Bước 3: Đếm bạch cầu Dùng phần nhỏ dịch tủy lấy tiến hành đếm bạch cầu + Bước 4: Nuôi cấy dịch tủy Môi trường nuôi cấy cho lọ: Môi trường Parker 199: 6ml Huyết AB: 2ml Tủy chống đông sử dụng để nuôi cấy tùy thuộc vào số lượng bạch cầu với tỉ lệ thích hợp 5.105 bạch cầu/1ml môi trường, tức lọ cấy khoảng 40 105 bạch cầu Các lọ nuôi cấy đậy nút cao su vô trùng, lắc nhẹ tay cho sau để tủ ấm 37oC 24 b) Nuôi cấy máu ngoại vi Theo kỹ thuật B Dutrillaux J Couturier, 1981 + Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ Giống nuôi cấy tủy xương + Bước 2: Thao tác lấy bệnh phẩm Bơm kim tiêm vô trùng, tráng 0,1 heparin 5000UI/ml Lấy 1-2ml máu tĩnh mạch người bệnh, lắc nhẹ cho máu hòa Heparin để không bị đông + Bước 3: Đếm bạch cầu + Bước 4: Nuôi cấy Môi trường nuôi cấy lọ giống nuôi cấy tủy xương 24 Lọ cấy để tủ ấm 37oC 24 * Thu hoạch dịch cấy làm tiêu Tiến trình thu hoạch dịch cấy tủy máu giống dựa theo nhà nghiên cứu + Bước 5: Ức chế phân bào Colchicine Sau nuôi cấy 37oC 22 30 phút, sử dụng Colchicine làm đứt thoi vô sắc, ức chế phân bào giai đoạn Metaphase, giai đoạn này, nhà nghiên cứu thấy thể nhiễm sắc có kích thước lớn hình dạng rõ Cho vào lọ nuôi cấy 0,05ml Colchicine nồng độ 4mg/ml Lắc nhẹ, giữ tủ ấm 37oC tiếp 30 phút + Bước 6: Nhược trương tế bào Dung dịch nhược trương có nồng độ tương ứng sau: Nước cất để ấm: 5ml Huyết AB: 1ml KCl 0,07M: 3ml EDTA: 0.1ml 21 Chuyển toàn dịch cấy sang ống ly tâm nhọn đáy, đem ly tâm 1000 vòng/phút, hút bỏ phần trên, cho vào ống 7ml dung dịch nhược trương (đã để ấm 37oC), trộn nhẹ pipet Pasteur Để ống tủ ấm 37oC cho tế bào thẩm thấu dung dịch nhược trương 12 phút Sau cho thêm vào ống 0,1ml dung dịch Carnoy II trộn nhẹ, lại ly tâm 1000 vòng/phút Hút bỏ phần + Bước 7: Cố định thể nhiễm sắc Để giữ hình dạng thể nhiễm sắc metaphase cần định hình hai dung dịch Carnoy có thành phần sau: Dung dịch Carnoy I: + Cồn 96o: thể tích + Axit axetic: thể tích Dung dịch Carnoy II: + Cồn 96o: thể tích +Clorofooc: thể tích + Axit axetic: thể tích Bước định hình là: Cho 6ml dung dịch Carnoy I vào ly tâm nhọn đáy, trộn nhẹ, để phút nhiệt độ phòng, ly tâm 1000vòng/phút phút, hút bỏ phần Bước định hình dung dịch Carnoy II, cho vào ống ly tâm nhọn đáy 6ml, trộn nhẹ, để phút nhiệt độ phòng, ly tâm 1000vòng /phút phút, hút bỏ phần trên, lấy dịch đáy ống ly tâm làm tiêu + Bước 8: Làm tiêu Sử dụng lam kính sạch, để vào ngăn đá tủ lạnh cho phủ lớp băng mặt lam Nhỏ giọt dịch tế bào ống ly tâm lên lam kính cho hỗn dịch lan theo mặt băng tan mặt lam Khi thể nhiễm sắc diện lam kính thành cụm c) Các kỹ thuật nhuộm tiêu thể nhiễm sắc 1) Nhuộm Giêm sa nguyên chất Dung dịch Giêm sa: Bột Giêm sa nguyên chất: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Pha loãng dung dịch 4%, nhuộm tiêu 20 phút Rửa tiêu nước thường nước cất, để khơ đưa lên soi kính hiển vi Bằng phương pháp nhuộm này, thể nhiễm sắc bắt màu nên khó quan sát tổn thương cấu trúc thể nhiễm sắc Để khắc phục nhược điểm áp dụng số kỹ thuật nhuộm băng thể nhiễm sắc Nguyên lý kỹ thuật dựa tính chất đặc trưng phân bố đoạn ADN giàu A - T G - C kéo theo phân bố loại gen mã hóa cho protein đặc trưng thể nhiễm sắc Dưới tác dụng nhiệt độ cao, môi trường muối cặp thể nhiễm 22 sắc tính chất bị phân hủy vị trí đặc hiệu, sau nhuộm giêm sa thông thường tạo nên băng ngang đậm, nhạt xen kẽ có tính chất đặc trưng riêng cho thể nhiễm sắc Do vậy, nhận định xác cặp thể nhiễm sắc phần giúp phát khác biệt rối loạn cấu trúc thể nhiễm sắc 2) Nhuộm băng R ( Reverse-banding technique) Theo kỹ thuật B Dutrillaux Lurwune (1971), Sehested (1974), Vowjma Lubs (1975) Phương pháp nhuộm để nhận dạng thể nhiễm sắc Philadelphia bệnh Leukemia mãn tính phát tổn thương cấu trúc thể nhiễm sắc nhóm Leukemia khác Phương pháp tiến hành sau: Tiêu trước nhuộm sấy khô tủ ấm 37oC ngày cho thể nhiễm sắc bám chặt mặt lam Xử lý tiêu dung dịch đệm Earle pH = 6,5 87oC bể men 100ml khoảng 15 - 45 phút Rửa nước, để khô, nhuộm Giêm sa 2% dung dịch đệm Quan sát thể nhiễm sắc với băng sáng tối xen kẽ kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.000 lần 3) Kỹ thuật nhuộm băng Giemsa (G-banding technique): Theo kỹ thuật Sun, N.C; Chu, E.H.Y Chang, C.C (1973) + Bước 1: Chuẩn bị dung dịch Dung dịch Giêm sa chuẩn (đậm đặc) Bột Giêm sa nguyên chất: 1g Methanol: 66ml Glyxerin: 66ml Sau pha dung dịch để hai ngày nhiệt độ phòng lọ màu tối để tủ lạnh trước dùng hai tuần Dung dịch nhuộm băng ( sử dụng ngày) Dung dịch đệm pH 6,8: 26ml Methanol: 7ml Trypsin1/250 ( DIFCO5g/l)+ EDTA: 2g/l Giêm sa chuẩn: 0.8ml + Bước 2: Trình tự nhuộm Ủ tiêu dung dịch đệm phosphat pH 6,8 560C phút Nhuộm tiêu ngập dung dịch nhuộm phút nhiệt độ phòng Rửa tiêu nước cất, để khơ Soi kính khơng cần đậy lamen 23 d) Kỹ thuật nhuộm băng Q Kỹ thuật tiến hành với chất nhuộm đặc biệt Qinacrin với quy trình thực phức tạp, kết chất nhuộm gắn vào vùng giàu A - T ADN ta quan sát kính hiển vi huỳnh quang Màu hồng băng đặc trưng cho cặp thể nhiễm sắc Đây đặc điểm có ích phân tích di truyền thông tin phần chứa gen đặc thù Sắp xếp công thức thể nhiễm sắc Đọc tiêu kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần, quan sát bất thường có xếp thể nhiễm sắc theo công thức quy định danh pháp thể nhiễm sắc thông qua hội nghị Di truyền tế bào học năm 1960 Denver - Mỹ 2.5.2 Tiến hóa kiểu nhân tế bào nhân chuẩn (Eukaryota) Qúa trình phân hóa di truyền biểu mức độ khác qúa trình tiến hóa Đa hình di truyền biểu đa hình thể nhiễm sắc phổ biến quần thể tự nhiên Baimai cho thay đổi di truyền luôn phát mức độ thể nhiễm sắc bao gồm tái cấu trúc thể nhiễm sắc (chromosomal rearrangement) phân hóa vùng dị nhiễm sắc có liên quan đến hàm lượng ADN thơng qua thay đổi trật tự phân bố số lượng khối dị nhiễm sắc nằm thể nhiễm sắc Sự tiến hóa kiểu nhân thể sinh sản hữu tính theo phương thức thu hút ý nhiều chuyên gia lĩnh vực di truyền học tiến hóa Các nghiên cứu cho thấy khác biệt kiểu nhân tìm thấy trùng hai cánh mà đối tượng Drosophila loài muỗi Anopheles Hơn 500 loài phân loài (subspecies) thuộc chi Drosophila nghiên cứu thể nhiễm sắc nguyên phân (mitotic chromosome) thể nhiễm sắc khổng lồ (polytene chromosome) cho thấy tranh thật phong phú đa hình thể nhiễm sắc, dẫn đến việc khám phá nhiều lồi đồng hình tồn quần thể tự nhiên 100 loài muỗi tổng số 200 loài muỗi nghiên cứu kỹ kiểu nhân Các tác giả mơ tả hàng loạt đa hình thể nhiễm sắc bên loài (intraspecific polymorphism) khác biệt kiểu nhân loài (interpecific karyotypic differences) Sở dĩ loài Anopheles đặc biệt ý nhiều nguyên nhân mà nguyên nhân phải kể đến tầm quan trọng chúng y tế cộng đồng tính khả thi vấn đề nghiên cứu tác giả nêu rõ: - Số lượng thể nhiễm sắc lưỡng bội lồi muỗi (2n=6) thuận lợi dễ thâu tóm đặc điểm qúa trình phân loại - Số lượng 2n=6 luôn cố định Trên thực tế nhìn chung người ta chưa phát tượng đa bội thể loài thuộc chi Anopheles, nhiên Belcheva Baimai cho biết có vài trường hợp ngoại lệ tượng thể nhiễm sắc bổ sung tìm thấy lồi An maculipennis An messae hay lồi An indefinitus Đơng Nam Á - Các thể nhiễm sắc thường (autosomal chromosome) lồi Anopheles có nhiều đặc điểm giống thường bắt đôi soma tạo thành cặp thể nhiễm sắc loại tâm (metacentric) tâm cận (submetacentric) Hai thể nhiễm sắc giới tính đồng hình (XX) (homomorphism) dị hình (XY) đực (heteromorphism) - Nét đặc trưng bật kiểu nhân loài muỗi Anopheles khối lượng vị trí phân bố riêng biệt vùng dị nhiễm sắc xác định rõ thể nhiễm sắc 24 nguyên phân băng dị nhiễm sắc đặc thù thể nhiễm sắc khổng lồ dấu hiệu đáng lưu ý để sử dụng cho nghiên cứu di truyền phân loại Việc phát đặc điểm khác kiểu nhân thông qua tái cấu trúc thể nhiễm sắc biến dị số lượng khối dị nhiễm sắc phân bố chúng giúp ích cho việc nghiên cứu phân loại mối quan hệ tiến hóa nhiều nhóm trùng đặc biệt loài thuộc chi Anopheles 2.5.2.1 Sự khác biệt kiểu nhân lồi Khi phân tích khác biệt kiểu nhân (interpecific karyotypic differences) phát nhiều khác lồi có quan hệ gần quần thể tự nhiên Ở loài thuộc chi Drosophila người ta sớm nhận thấy khác kiểu nhân điển hình cặp ruồi nghiên cứu kỹ D pseudobscura (loài A) D persimilis (loài B) hai lồi y hệt hình thái Thể nhiễm sắc Y lồi A có dạng chữ J, lồi B thể nhiễm sắc lại có dạng hình chữ V Việc phát làm tiền đề cho nghiên cứu kiểu nhân loài thuộc chi Anopheles mà số trường hợp điển hình đề cập đến nhiều tài liệu nghiên cứu Nếu thể nhiễm sắc thường lồi Anopheles giống hình thái kích thước thể nhiễm sắc giới tính lại khác nhiều khía cạnh Ba lồi đồng hình thuộc phức hợp lồi An culicifacies trung gian truyền bệnh sốt rét Ấn Độ phân biệt sở khác biệt thể nhiễm sắc Y Thể nhiễm sắc Y loài C tâm cận mút (acrocentric), cịn lồi A B tâm lệch (submetacentric) Một trường hợp đáng lưu ý An leucosphyrus vùng Đơng Nam Á có biểu khác biệt kiểu nhân Baimai cộng mơ tả chi tiết Lồi An leucosphyrus Thái Lan vùng Kalimanta Indonesia (loài A) với loài An leucosphyrus vùng Summatra Indonesia (loài B) thực chất hai loài mà khác biệt biểu thể nhiễm sắc giới tính Lồi A thể nhiễm sắc giới tính tâm mút (telocentric), loài B lại tâm lệch (submetacentric) Theo quan điểm Baimai kiểu nhân lồi B hình thành qúa trình tiến hóa nhờ nhận thêm khối dị nhiễm sắc thể nhiễm sắc giới tính vùng tâm động Phức hợp An dirus trường hợp điển hình khác biệt kiểu nhân mà Baimai dựa vào đặc điểm để nhận biết thành viên thuộc phức hợp An dirus Thái Lan Khi sử dụng phương pháp nhuộm băng Giêm sa (băng G) Baimai mô tả đặc điểm thể nhiễm sắc giới tính (XY) thành viên thuộc phức loài An dirus là: loài A thể nhiễm sắc X Y tâm mút (telocentric) cịn lồi B thể nhiễm sắc thuộc tâm cận mút (acrocentric) Một khác biệt độc đáo thể An dirus loài F mà Baimai cộng phát khối dị nhiễm sắc lớn nằm vị trí tâm động thể nhiễm sắc số III, dấu hiệu đặc biệt tách loài F khỏi tất thành viên khác phức hợp An dirus Việc nhận biết loài F loài riêng biệt có ý nghĩa lớn nghiên cứu dịch tễ nghiên cứu sinh thái tập tính mà Colless đề cập từ trước, mặt khác cịn chứng để bổ sung đầy đủ thành phần loài An dirus (A, B, C, D, F) có mặt Thái Lan Đối với loài khác (loài C An takasagoensis) phức hợp tác giả khác biệt dựa sở bốn mức độ phát sáng phương pháp nhuộm huỳnh quang (H-33258) Với đặc điểm cấu trúc kiểu nhân Baimai rõ mức độ phân hóa 25 chúng qúa trình tiến hóa: Lồi B lồi F có chung nguồn gốc phát sinh Lồi F hình thành nhờ nhận thêm khối dị nhiễm sắc vị trí tâm động thể nhiễm sắc số III Đồng thời tác giả quan hệ loài A loài C gần nhau, loài B loài D cách xa mặt di truyền Rõ ràng phương pháp di truyền tế bào dựa phân tích kiểu nhân phục vụ tốt cho phân loại mà làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa lồi Quan điểm đắn hướng tiến hóa kiểu nhân loài Anopheles bác bỏ quan niệm cho lồi muỗi hình thành qúa trình lai tạo tồn lâu đầu kỷ XIX Các tác giả khác nêu rõ hơn: 90% chí 98% kiện dẫn đến hình thành lồi có liên quan đến kiểu nhân Tiến hóa kiểu nhân lồi Anopheles nêu khơng theo chế tăng số lượng thể nhiễm sắc mà thông qua đường tái cấu trúc thể nhiễm sắc mà sở nhận thêm khối dị nhiễm sắc Sự khác biệt kiểu nhân biểu nhiều loài khác như: An maculatus An balabacensis Ngoài cách nhận thêm khối dị nhiễm sắc, tượng tái cấu trúc thể nhiễm sắc biểu thơng qua đa hình đảo đoạn phổ biến loài thuộc chi Anopheles Kết nghiên cứu thể nhiễm sắc khổng lồ 30 lồi Anopheles tác giả có chung nhận định tính đặc thù trật tự băng thể nhiễm sắc khổng lồ Đối với loài đồng hình đặc điểm băng phần lớn giống nhau, người ta dễ dàng nhận biết dấu hiệu khác biệt có so sánh phân loại Trên thực tế tác giả cho biết việc sử dụng thể nhiễm sắc khổng lồ thông qua đảo đoạn thu nhận kết với độ xác cao, Coluzzi cặp lồi đồng hình khác đảo đoạn, nghiên cứu khác cho biết trung bình có đảo đoạn cá thể Theo White, An gambiae phức hợp loài mà biểu phong phú đa hình đảo đoạn, điển hình hai lồi An gambiae (17 đảo đoạn) An arabiensis (18 đảo đoạn) Các tác giả cho thấy 11 đảo đoạn phân biệt lồi đồng hình phức hợp đảo đoạn thể nhiễm sắc X đóng vai trò chủ đạo phân loại Nếu lấy thể nhiễm sắc X lồi An quadrianulatus làm chuẩn An gambiae phân biệt đảo đoạn An balabacensis phân biết đảo đoạn thể nhiễm sắc X Đối với An melas, An merus lồi cịn lại tác giả phân biệt đảo đoạn cố định thể nhiễm sắc 2R Phức hợp An dirus điển hình Đơng Nam châu Á song đa hình đảo đoạn Baimai mơ tả lại có nhiều đặc điểm khác hẳn Trong bốn lồi An dirus A, B, C, D có mặt Thái Lan ba lồi A, B, C có đặc điểm chung đơn hình thể nhiễm sắc khổng lồ Riêng thể nhiễm sắc 3L bốn lồi có cấu trúc (Baimai cộng sự) Loài D khác biệt với ba loài A, B, C đa hình đảo đoạn Nếu cho thể nhiễm sắc lồi A chuẩn hai lồi A D có tương phản tượng đảo đoạn Sự khác thể rõ thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc thường: Thể nhiễm sắc X thâu tóm tồn đảo đoạn xảy loài A nhiên tần số đảo đoạn thấp (7 18 quần thể nghiên cứu) lồi D tác giả khơng phát trường hợp đảo đoạn thể nhiễm sắc Ngược lại toàn thể nhiễm sắc thường loài D đặc trưng đa hình đảo đoạn chí thể nhiễm sắc 2L mà theo ý kiến Baimai trường hợp gặp, cịn lồi A chúng lại đơn hình trật tự băng dị nhiễm Nếu lồi đồng hình phức hợp An.gambiae tồn đảo đoạn phức hợp An Dirus, Baimai cho thấy tổng số 287 cá thể thuộc loài B thu thập từ 10 địa điểm khác Thái Lan không phát đảo đoạn Tương tự thể nhiễm sắc khổng lồ loài C hoàn toàn đặc trưng băng chuẩn qua phân tích 367 cá thể ni từ gia đình Vì vậy, nhận biết lồi tác giả khơng dựa sở đảo đoạn 26 mà băng dị nhiễm đặc thù riêng biệt thành viên phức hợp Phân tích kiểu nhân tác giả cịn cho biết lồi A C có nhiều điểm giống trật tự băng thể nhiễm sắc khổng lồ, riêng loài D hoàn toàn khác với loài A thành viên khác phức hợp An dirus hình thái hai lồi A C đặc biệt Hiện tượng tái cấu trúc thể nhiễm sắc khổng lồ thơng qua đảo đoạn cịn phổ biến nhiều loài khác thuộc chi Anopheles Ba loài đồng hình phát phức hợp An culicifacies (A, B, C) tách biệt đảo đoạn nằm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc số II trợ bào trứng Phức hợp An maculipennis với lồi đồng hình nhận biết qua đảo đoạn loài thứ (An beklemishevi), phát phương pháp di truyền tế bào mà việc phân tích kiểu nhân làm sở Phức hợp An maculatus đặc trưng đa hình đảo đoạn bật lồi B Nhìn chung, qua phân tích tần số đảo đoạn tác giả cho thấy phần lớn đảo đoạn xa tâm (paracentric) cố định (fixed inversion) chúng tồn trạng thái đồng hợp tử Dạng phổ biến An gambiae, An dirus, An culicifacies An maculatus Dạng đảo đoạn quanh tâm (pericentric inversion) xảy An quadrianulatus với tần số thấp Một dạng đảo đoạn khác xảy số loài Anopheles đảo đoạn mảng (floating inversion) trạng thái đồng hợp tử dị hợp tử Loại thường gặp loài An supictus Grassi An stephensi Colluzzi cho biết thêm thể nhiễm sắc X thể nhiễm sắc 2R nhạy cảm với đảo đoạn, số loại thể nhiễm sắc khác lại bảo thủ việc giữ nguyên trạng thái cấu trúc Mỗi tần số đảo đoạn, tác giả cho thấy, thường có liên quan đến tập tính khả truyền bệnh muỗi Tần số đảo đoạn thể nhiễm sắc 2R An gambiae An.arabiensis có liên quan đến tập tính điều kiện khí hậu đặc điểm hình thái Các đảo đoạn có xu hướng tăng miền Nam Châu Phi mùa ẩm, mẫu thu thập ngồi nhà, cịn miền Tây mùa khô tần số đảo đoạn lại cao mẫu thu thập nhà Tóm lại, khu vực, điều kiện sinh sống tạo sức ép chọn lọc liên tục lên quần thể tất loài buộc chúng phải thích ứng Vì vậy, lồi quần thể tự nhiên khác biệt đặc điểm hình thái mà cịn đặc điểm sinh học khác, hay nhiều chi phối phương diện di truyền Đa hình đảo đoạn chi phối đến tập tính trùng truyền bệnh qúa trình thích nghi tác giả đề cập đến nhiều tài liệu nghiên cứu Qúa trình tăng cường thích nghi lồi với mơi trường sở chọn lọc vấn đề tiến hóa Nghiên cứu đa hình đảo đoạn khơng có ý nghĩa việc nghiên cứu lồi đồng hình, mà cịn làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa lồi Một lần lại tái khẳng định lại quan điểm đắn White cho phân hóa kiểu gen để hình thành loài mới, thay đổi thể nhiễm sắc giữ vai trò chủ đạo, nhiều chuyên gia lĩnh vực tán đồng Ngoài ra, nghiên cứu ứng dụng tái cấu trúc thể nhiễm sắc mà sở đảo đoạn kết hợp với chuyển đoạn lại có ý nghĩa thực tiễn vô to lớn việc sử dụng biện pháp di truyền cho mục đích phịng chống vectơ truyền sốt rét 2.5.2.2 Đa hình thể nhiễm sắc biến dị lồi Tính biến dị lồi thể thay đổi vị trí phân bố số lượng vùng dị nhiễm sắc phổ biến tế bào nhân chuẩn Đặc tính giúp ích nhiều 27 cho việc nghiên cứu lồi có quan hệ gần động vật thực vật Hiện tượng khơng phải gặp lồi thuộc chi Drosophila Rất nhiều cơng trình nghiên cứu biến dị lồi mơ tả đa hình vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin polymorphism) lồi muỗi Anopheles giúp ích nhiều việc nghiên cứu lồi đồng hình Anopheles dirus Peyton Harrison (dirus A) Baimai cộng phát có đa hình thể nhiễm sắc giới tính Ba dạng (X1, X2, X3) hai dạng (Y1, Y2) tác giả phân biệt dựa mức độ khác kích thước phân bố vùng dị nhiễm sắc số lượng chúng thể nhiễm sắc Một trường hợp bật đa hình biến dị thể nhiễm sắc giới tính lồi thể An dirus (loài B), Baimai cộng phát dạng biến dị thể nhiễm sắc giới tính, dạng biến dị thuộc thể nhiễm sắc X (X1-X5) dạng biến dị khác thuộc thể nhiễm sắc Y (Y1-Y4) Phân tích đa hình thể nhiễm sắc X tác giả dấu hiệu khác vị trí tâm động để phân biệt thể nhiễm sắc X1 tâm mút (telocentric), X2, X3, X4 tâm cận mút (acrocentric) X5 tâm lệch (submetacentric) Ba thể nhiễm sắc X2, X3, X4 phân biệt dựa mức độ khác kích thước đặc điểm vùng dị nhiễm sắc Ngồi Baimai cịn cho thấy dạng dị hợp tử X1X2 phổ biến quần thể tự nhiên khác với dạng dị hợp tử X3X4 lại xuất hầu hết gia đình muỗi nghiên cứu Hình 2.6 Sự khác biệt kiểu nhân lồi Anopheles minimus (A & C) đa hình thể nhiễm sắc loài Bốn dạng thể nhiễm sắc Y nhận biết sở đặc tính tương tự thể nhiễm sắc X Dạng dị hợp tử X3Y4, X4Y2 dạng phổ biến dạng X3Y3 X4Y4 lại tác giả phát trường hợp tổng số 126 gia đình phân tích Nhìn chung biến dị thể nhiễm sắc giới tính kiểu nhân hai lồi An dirus A B biểu quy mô rộng Các biến dị theo xu hướng nhận thêm khối dị nhiễm sắc (trường hợp X2, X3, Y2 An dirus A X5, Y3, Y4 An dirus B) khối dị nhiễm (trường hợp X1, X3, Y1 An dirus B) Thực tế cho thấy tiến hóa kiểu nhân thơng qua tái cấu trúc 28 nhận thêm khối dị nhiễm sắc phổ biến cho lồi muỗi Phương Đơng Kiểu biến dị lồi mà biểu đa hình dị nhiễm sắc thấy đối tượng khác tác giả mô tả chi tiết Phức hợp lồi An gambiae lại có đặc trưng đa hình dị nhiễm sắc thể nhiễm sắc giới tính Điểm bật đa hình thể nhiễm sắc X tác giả tìm thấy quần thể tự nhiên cịn phịng thí nghiệm thể nhiễm sắc X lại đơn hình hai loài An gambiae An arabiensis Với phương pháp nhuộm băng huỳnh quang H-33258 tác giả mô tả dạng thể nhiễm sắc X Y khác hai loài An gambiae An arabiensis Hơn Gatti cộng kết định tính huỳnh quang phản ánh phù hợp khác hóa tế bào di truyền tế bào hai loài phức hợp Rõ ràng biến dị loài giữ vai trị quan trọng tiến hóa, nhiên vấn đề sáng tỏ vai trò sinh lý cuả chất dị nhiễm sắc nghiên cứu đầy đủ Mặc dù vậy, giả thiết vai trò dị nhiễm sắc mối quan hệ vectơ ký sinh trùng truyền cho người thông qua vectơ nhiều tác giả đặc biệt quan tâm 2.5.3 Nghiên cứu kiểu nhân côn trùng truyền bệnh Áp dụng phương pháp làm tiêu thể nhiễm sắc trung kỳ (metaphase chromosome) nguyên phân Baimai, tiến hành mổ lấy tế bào não bọ gậy (tuổi IV) Các bước cụ thể tiến hành sau: Xử lý bọ gậy dung dịch Colchicine (catologue number: Colchicine Sigma cat N0 C 9754) với nồng độ 0,1% (trong - giờ) nhiệt độ phòng Sau xử lý, bọ gậy vớt ra, chuyển vào dung dịch Citrat - Natri 1%, qúa trình mổ lấy não thực hai kim nhọn, nhỏ, thao tác thực kính hiển vi 29 Hình 2.7 Thể nhiễm sắc kỳ nguyên phân bọ gậy muỗi Con đực; Con - thuộc Anopheles barbumbrosus; 3,4 đực; Con - thuộc Anopheles umbrosus; 6,7 Con đực; 8,9 Con thuộc Anopheles letifer Chuyển não (bao gồm hai khối nhỏ, màu trắng) sang dung dịch nhược trương (thời gian nhược trương tuỳ thuộc vào đối tượng) Định hình não dung dịch Carnoy (ở lam kính khác nhờ vào động tác chuyển não khéo léo từ dung dịch nhược trương sang dung dịch định hình) Dùng pipet Pasteur bơm hút tế bào não (còn dạng hai khối nhỏ màu trắng) nhiều lần huyền dịch tế bào trở nên đồng Cũng dùng pipet nhỏ huyền dịch tế bào lên lam kính sạch, hơ nóng máy sấy với nhiệt độ 45oC (5 - 10 phút) Với thời gian đủ để tế bào bám dính vào lam kính cịn axít axetic dư thừa tự bay Như vậy, qúa trình làm tiêu thể nhiễm sắc hồn thành Có thể áp dụng phương pháp nhuộm tiêu thể nhiễm sắc muỗi người 30 Hình 2.8 Sơ đồ hóa kiểu nhân số lồi Anopheles 2.5.4 Phương pháp nhận biết loài Việc nhận biết loài đồng hình biện pháp di truyền tế bào mà sở thể nhiễm sắc thể rõ nhiều cơng trình 10 năm nghiên cứu phức hợp An dirus Thái Lan Phân tích đa hình thể nhiễm sắc mà sở đa hình dị nhiễm sắc (heterochromatic polymorphism), tác giả phát nhiều dạng thể nhiễm sắc giới tính khác Dựa vào dạng kết hợp giao tử (các hợp tử) tìm thấy quần thể tự nhiên, tác giả biến dị bên loài khác biệt loài Quan điểm loài sinh học định nghĩa loài Mayr mà chế cách ly sinh sản xem tiêu chuẩn để xác định cá thể thuộc loài hay thuộc hai loài tác giả quán triệt suốt qúa trình phân loại Tuy nhiên, tác giả việc áp dụng tiểu chuẩn cách độc lập hay dạng kết hợp (với tiêu sinh học khác) phải phụ thuộc vào trường hợp cụ thể Trường hợp phổ biến tóm tắt trình bày Các cá thể muỗi (cùng vùng phân bố) có dạng thể nhiễm sắc khác X1 X2 luôn tồn dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) mà không bắt gặp cá thể dạng dị hợp tử (X1X2) (qúa trình giao phối khơng xảy ra) chúng thuộc hai loài khác Về phương diện di truyền học, hai loài tồn tự nhiên giống hình thái cách ly sinh sản với chế tiền giao phối Nhưng, dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) tìm thấy khác vùng phân bố (qúa trình giao phối khơng thể thực được) khơng có nghĩa chúng thuộc hai loài Trong trường hợp phải kết hợp với tiêu khác để kiểm tra kết Mức độ hòa hợp di truyền thể kết phép lai phòng thí nghiệm cho 31 kết tồn chế cách ly hậu giao phối đem lại độ xác cao phân loại Cịn trường hợp ngồi dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) cịn tìm thấy dạng dị hợp tử (X1X2) vùng phân bố chúng thuộc lồi Sự có mặt dị hợp tử chứng tỏ qúa trình giao phối hai lồi xảy Cơ chế giao phối ngẫu nhiên định kết hợp ngẫu nhiên giao tử Vì vậy, tần số hợp tử đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) dị hợp tử (X1X2) phải phù hợp với định luật Castle - Hardy - Weinberg (1908) C H - W: p2X1X1 + 2pq X1X2 + q2X2X2 Ngoài trường hợp tác giả khái quát nêu rõ trên, thực tế trường hợp ngoại lệ cần lưu ý việc tìm thấy dạng dị hợp với tỷ lệ không đáng kể khó khăn kỹ thuật việc thực phép lai phịng thí nghiệm khơng phản ánh mức độ xác kết phân loại Trong trường hợp vậy, phải kết hợp với nhiều tiêu khác Vấn đề thảo luận chương 2: Vẽ sơ đồ trình bày cấu trúc phân tử NST Giải thích mối tương quan đơn bội, lưỡng bội đa bội Phân biệt NST thường NST giới tính Trình bày sở NST xác định giới tính Trình bày đặc điểm vai trị trung tiết tiết mút Nêu giải thích thí nghiệm chứng minh sở NST di truyền Thực hành: làm kiểu nhân muỗi Anopheles người (Homo sapiens) Phân tích tiến hóa loài muỗi thuộc chi Anopheles sở phân tích kiểu nhân ... tính biểu tính trạng sinh dục nguy? ?n sinh (có tuy? ?n sinh dục tinh h? ?n, buồng trứng) tính trạng sinh dục thứ sinh (các ph? ?n phụ sinh dục tính trạng khác thể ph? ?n biệt đực cái) Những tính trạng... có nh? ?n tố TDF, vùng tủy mầm tuy? ?n sinh dục khơng phát tri? ?n thành tinh h? ?n mà vùng vỏ tuy? ?n phát tri? ?n buồng trứng, buồng trứng chế tiết hormon estrogen kích thính phát tri? ?n tính trạng sinh... testosteron kích thích hình thành tính trạng đực thứ sinh Người ta chứng minh nh? ?n tố xác định tinh h? ?n mã hóa gen SRY (sex- determining region Y) định vị vế ng? ?n thể nhiễm sắc Y người Có nhiều trường