1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ xa xưa, người biết sử dụng cỏ thiên nhiên để làm thuốc Cây cỏ thiên nhiên làm thuốc vơ phong phú đa dạng, lồi có đặc tính tác dụng khác Chẳng hạn cải xoong có tác dụng bảo vệ sức khỏe, chống oxy hóa, chống độc, làm tăng sức đề kháng cho thể, chống tượng lão hóa bệnh lý, giữ gìn nét tươi trẻ, chữa ho lao, chữa sỏi mật, sỏi thận, chữa bệnh đái đường, chữa viêm phế quản mạn tính, chữa bí tiểu… Hay cỏ hôi nhiệt, giải độc, tiêu sưng Thường dùng chữa viêm họng lạnh, chữa rong huyết cho phụ nữ sau sinh, viêm đường tiết niệu … [21] Đặc biệt, cỏ mực có nhiều tác dụng việc chữa bệnh Nó dùng để chữa rắn cắn, cầm máu, làm đen tóc, ngăn ngừa tế bào ung thư… Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc, sống người thêm nhiều áp lực Vì thế, với phát triển xã hội, khuynh hướng trở với cỏ tự nhiên, thân thiện với môi trường ưa chuộng Rất nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học hướng tới thuộc tự nhiên, công nghiệp lượng, nhà khoa học hướng tới lượng mặt trời, lượng nước… Trong nghành y học thể rõ nét khuynh hướng Các nhà khoa học nghiên cứu cỏ thiên nhiên, từ điều chế loại thuốc thực phẩm chức từ loại thảo mộc nước trà xanh, nước me, trà bí đao… Cây cỏ mực nghiên cứu thành công nhiều nước giới Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ… Và người ta thành lập nhà máy sản xuất thuốc làm đẹp tóc Mỹ Ở Việt Nam, cỏ mực mọc từ Bắc tới Nam, sử dụng làm thuốc chưa bệnh dân gian chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học Vì thế, tơi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học cỏ mực huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An” làm đề tài khóa luận tốt nghiệp nhằm cung cấp thêm số thông tin có ý nghĩa khoa học thành phần hóa học cỏ mực Đối tượng mục tiêu nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cây cỏ mực huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An 2.2 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hóa học có cỏ mực Nội dung nghiên cứu - Thu thập, xử lí nguyên liệu - Xác định tiêu hóa lí + Độ ẩm + Hàm lượng tro vô - Chiết mẫu thực vật bằng dung môi khác Dùng dung môi từ không phân cực n-hexane, dung mơi phân cực ethyl acetate, đến dung mơi phân cực methanol - Xác định công thức cấu tạo định danh số hợp chất hóa học dịch chiết bằng phương pháp GC-MS, LC-MS Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp nghiên cứu lí thuyết - Tổng quan hợp chất thiên nhiên - Tổng quan hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng cỏ mực - Cơ sở lý thuyết phương pháp nghiên cứu 4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp phân huỷ mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng hữu - Xác định hàm lượng số kim loại có mẫu tro hố bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để Xử lý mẫu bằng phương pháp tro hố mẫu khơ ướt kết hợp - Chiết bằng phương pháp soxhlet chưng ninh - Đo LC - MS GC – MS để xác định thành phần, CTCT hợp chất Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài cung cấp thêm số thơng tin thành phần hóa học cỏ mực, từ làm sở cho việc nghiên cứu ứng dụng quan trọng y học đời sống người Bố cục luận văn Luận văn gồm 42 trang, có bảng 14 hình Phần mở đầu (3 trang), kết luận kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (2 trang), phụ lục 10 trang Nội dung luận văn chia làm chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu (6 trang ) Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (10 trang) Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận (19 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược cỏ mực 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây cỏ mực có tên khoa học Eclipta prostrata L, có tên đồng nghĩa Eclipta alba, loài thuộc chi Eclipta L, thuộc họ Cúc (Asteraceae) Ở Việt Nam, cỏ mực cịn có số tên gọi khác hạn liên thảo (gọi Đông y), cỏ nhọ nồi (trong dân gian), nhả cha chát (dân tộc Thái), phong trường, mạy mỏ lắc nà (dân tộc Tày)… [1, 3, 5, 18] Cây cỏ mực thuộc loại cỏ, mọc thẳng đứng hay mọc bò, cao 30 - 40cm, có cao tới 80cm Thân màu lục đỏ tía, phình lên mấu, có lơng cứng, sờ nháp Lá mọc đối, gần khơng cuống, mép có khía nhỏ; hai mặt có lơng, phiến hình mũi mác nhỏ Hoa hình đ ầu, màu trắng, mọc kẽ thân, gồm hoa hoa lưỡng tính Quả bế, có cạnh, dẹt Cây vò biến thành màu đen bấm có nước màu đen chảy nên cịn gọi cỏ nhọ nồi Cây thường mọc vào tháng – 10 hàng năm Hình 1.1 Lá hoa cỏ mực 1.1.2 Phân bố thực vật Cây cỏ mực mọc khắp nơi trái đất, tập trung nhiều hầu Nam Đông Nam Á [18] … Ở Việt Nam, cỏ mực mọc khắp miền từ Bắc tới Nam, nguồn ngun liệu dồi cho Đơng y 1.2 Một số ứng dụng của cỏ mực dân gian Trong y học dân gian Ấn Độ, cỏ mực dùng trị sói đầu, nấm lác đồng tiền, thuốc nhuộm tóc trị gan, lách phù trướng; sưng gan - vàng da làm thuốc bổ tổng quát Cây dùng trị ho, chảy máu miệng, ăn khó tiêu, chống váng, chữa đau răng, giúp lành vết thương… Rễ dùng gây nôn mửa, xổ Lá giã nát đắp trị vết cắn bò cạp [19] Ở Pakistan , Eclipta alba Bhangra, bhringaraja, dùng dân gian nhiều dạng Cây tươi dùng làm thuốc bổ chung, giúp giảm sưng gan lách, trị bệnh da, trị suyễn, dùng trị bệnh gan liều nước sắc sử dụng thìa cà phê hai lần ngày; giã nát, trộn với dầu mè dùng để đắp vào nơi hạch sưng, trị bệnh da Lá dùng trị ho, nhức đầu, hói tóc, gan lách sưng phù, vàng da Tại Trung Hoa, Eclipta prostrata , hay Mò hàn lian : Lá cho giúp mọc tóc Tồn làm chất chát cầm máu, trị đau mắt, ho máu, tiểu máu; đau lưng, sưng ruột, sưng gan, vàng da Lá tươi cho bảo vệ chân tay nông gia chống lại sưng nhiễm độc làm việc đồng áng, tác dụng theo Viện Y học Chiang-su có thiophene Tại Việt Nam, cỏ mực dùng trị xuất huyết nội tạng ho máu, xuất huyết ruột, chảy máu răng, nướu, lợi ; trị sưng gan, sưng bàng quang, sưng đường tiểu trị mụn nhọt đầu đinh, bó ngồi giúp liền xương Cách dùng thông thường dùng khô, sắc uống; dùng bên tươi đâm nát đ ắp nơi vết thương Thợ nề dùng cỏ mực vò nát để trị vôi [19, 20] Dựa vào đặc tính dược học trên, dân gian, người ta kết hợp cỏ mực với loài khác để chữa bệnh Một số thuốc từ cỏ mực sau: Bài số 1: Phòng chữa viêm da làm ruộng nước: Lấy cỏ mực tươi nắm khoảng 50gr, rửa sạch, vò nát xátleen chân tay màu da chuyển sang tím đen nhạt Chờ lát cho da khơ, xuống ruộng nước làm việc bình thường Bài số 2: Chữa đái máu: Cỏ nhọ nồi 30g, Cả mã đề 30g Cả thứ tươi rửa sạch, giã, ép lấy nước uống (say máy sinh tố), chữa cảm sốt nóng, ho, viêm họng Bài số 3: Chữa phụ nữ chảy máu tử cung: Cỏ nhọ nồi15g, Lá trắc bá 15g, Sắc uống Dùng da: Cỏ nhọ nồi tươi rửa sạch, giã (xay) ép lấy nước (nếu khơ tán bột), bảo đảm vệ sinh vơ trùng: đắp lên vết thương chảy máu chấn thương Thợ nề dùng cỏ nhọ nồi tươi xoa xát lên chân tay tránh tác hại vôi ăn da [20] Bài số 4: Chữa ho máu: Cỏ mực 25gr, bạch cập 20gr, a giao 10gr Đem cỏ mực bạch cập sắc lấy nước, đổ vào bát, sau cho a giao vào trộn Mỗi ngày bát, chia làm lần ngày, uống liên tục ngày Bài số 5: Chữa sỏi thận, tiểu tiện máu: Cỏ mực 15gr, cỏ mã đề (xạ liên thảo) 15gr, đường trắng vừa đủ Đem cỏ mực mã đề sắc lấy nước , uống rót bát, sau cho thêm đường vào cho đủ Mỗi ngày tễ, chia nhiều lần uống ngày thay cho trà, liên tục 20 ngày Bài số 6: Mũi thường chảy máu: Cỏ mực 25gr, ngó sen 20gr Sắc lấy nước, chia lần vào sáng chiều, uống liên tục 20 ngày Bài số 7: Chữa đao thương chảy máu: Lấy cỏ mực đem giã nát đắp lên chỗ bị thương, đem cỏ mực phơi khơ, tán mịn, rắc lên vết thương.[17] 1.3 Tình hình nghiên cứu cỏ mực thế giới và tại Việt Nam Tại nước châu Á, nhà khoa học nghiên cứu thành cơng tác dụng dược lí cỏ mực Tuy nhiên cơng trình nghiên cứu giới thành phần hóa học cỏ mực chưa nhiều, cịn Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố thành phần hóa học lồi Năm 1956, T.R.Govindachari cộng cô lập nicotin, wedelolacton, dimetyl wedelolacton dẫn xuất glicosid nó.[9] Cấu trúc hợp chất cụ thể sau: O O HO HO O N O CH3 N HO HO O O H3C HO OH Nicotin Dimetyl wedelolacton O OH Wedelolacton - Năm 1964, Bohlmann cộng cô lập từ dịch ete dầu hỏa cỏ mực poli axetilen hai dẫn xuất thiophen mà tác giả không nêu tên.[9] Cấu trúc hợp chất sau: H3C C C (C S H3C (C C)5 H C CH2 C)2 C H CH2 C S - S C C H CH2 Năm 1970, K.K.Bharava cộng cô lập thêm thêm số hợp chất có chứa lưu huỳnh, không nêu tên.[9] - Năm 1981, T.M.Sarg cộng cô lập từ cao ete dầu hỏa hợp chất phytosterol (0,11%),  - amyrin (0,06%) Còn từ cao ancol thu wedelolacton (0,02%), luteolin-7-o-glucosid (0,04%), glucosid phytosterol (0,07%) glucosid acid triterpen (0,03%).[9] - Nghiên cứu Xiong-Hao Lin cộng cho thấy thành phần tinh dầu dễ bay cỏ mực bao gồm: heptadecane (14,78%), 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone (12,80%), n-hexadecanoic acid (8,98%), pentadecane (8,68%), eudesma-4 (14),11-dien (5,86%), axit phytol (3,77%), octadec-9-enoic acid (3,35%), 1,2-benzenedicarboxylic diisooctyl ester (2,74%), (Z, Z) -9,12-octadecadienoic acid (2,36%), (Z) -7,11-dimethyl-3methylene-1 ,6,10-dodecatriene (2.08%) (Z, Z, Z) -1,5,9,9-tetramethyl-1, 4,7-cycloundecatriene (2,07%) Đồng thời, tác giả công bố rằng tinh dầu dịch chiết ethanolic (1 mg / ml đến 100 mg / mL) kích thích gia tăng gia tăng hoạt động ALP nguyên bào xương có ý nghĩa thống kê (p 128 >128 >128 >128 >128 >128 CME >128 >128 >128 >128 >128 >128 CMM >128 >128 >128 >128 >128 >128 Nhận xét: Từ bảng 3.8 thấy rằng dịch chiết khơng thể hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn nấm thử nghiệm 3.7.2 Hoạt tính chống oxi hóa Kết thử hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính chống oxi hóa STT Ký hiệu mẫu EC50 (g/ml) CMH >128 CME >128 CMM >128 Tham khảo Resveratrol 7,3 Nhận xét: Các dịch chiết hoạt tính chủng vi khuẩn vi, nấm thử nghiệm hoạt tính chống oxi hố Đây kết thăm dò bước đầu hoạt tính sinh học dịch chiết Vì thế, để có nghiên cứu mang tính hệ thống cỏ mực cần có định hướng nghiên cứu sâu mặt hoá học nhằm khai thác loại hoạt tính khác chúng 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu, ta rút kết luận sau: - Cây cỏ mực có độ ẩm 78,945%, hàm lượng tro 16,350%, hàm lượng kim loại nặng nhỏ giới hạn cho phép, không gây nguy hiểm sức khỏe người - Hiệu suất chiết mẫu bằng dung môi tương ứng là: n-hexane: 0,93%; ethyl acetate: 2,48%; methanol: 5,53% - Bằng phương pháp GC-MS xác định dịch chiết cỏ mực có số cấu tử là: stigmasterol (8,81%); heptacosane (5,36%); heptadecane,9octyl (4,64%)… Trong hợp chất sterol cơng bố có nhiều hoạt tính tốt - Bằng phương pháp LC-MS xác định dịch chiết cỏ mực có số cấu tử định danh là: 4-(5-Butadiynyl-2-thienyl)-1-chloro-3butyn-2-ol, 8Clo có cơng thức C12 H7ClOS; C10 H18 O9 (3-O D-XylopyranosylL-arabinose) - Bằng phương pháp LC-MS xác định dịch chiết cỏ mực có số cấu tử định danh chất có cơng thức CTPT C10H18 O9 - Các dịch chiết cỏ mực với dung môi n-hexane, ethyl acetate methanol hoạt tính chủng vi khuẩn, nấm thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa Kiến nghị Vì thời gian điều kiện thực đề tài hạn chế nên kết thăm dị bước đầu thành phần hóa học cỏ mực Tôi xin đề nghị số hướng mở rộng đề tài: 43 - Nghiên cứu sâu thành phần dịch chiết từ cỏ mực, phân lập xác định hợp chất hóa học chưa định danh cỏ mực - Tiếp tục nghiên cứu thêm việc tinh chế hoạt chất, thử nghiệm hoạt tính sinh học cỏ mực làm hóa chất cơng nghệ hóa dược 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [2] Bộ Y tế (1992), Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm – phẩm màu, Hà Nội [3] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học [4] Trần Hữu Dũng Đặng Thị Ngọc Hoa, Xây dựng quy trình chiết xuất phương pháp định lượng stigmasterol ráy sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 63, 2010 [5] Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học [6] Lê Thị Mùi (2009), Giáo trình hóa học phân tích định lượng, Đại học Sư Phạm Đà Nẵng [7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Các phương pháp cô lập hợp chất tự nhiên, NXB ĐHQG Tp HCM [8] Hồ Viết Quý (1998), Các phương pháp phân tích đại ứng dụng hóa học, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội [9] Võ Thanh Thúy, Luận văn thạc sĩ hóa học [10] Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội B Tiếng Anh [11] Dictionary of Natural Products, Version 16:1 Copyright  1982 – 2007, Chapman & Hall/CRC [12] Franz Hadacek, Harald Greger (2000), Testing of Antifungal Natural Products: Methodologies, Comparability of Results Phytochemical analysis, pp 137-147 [13] L John Goad, T Akihisa (1997) Analysis of sterol and Assay Choice, 45 [14] G Arunachalam, N Subramanian, G P Pazhani and V Ravichandran (2009), Anti-inflammatory activity of methanolic extract of Eclipta prostrata L (Astearaceae), African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol 3(3) pp 097100 [15] Mi Kyeong Lee, Na Ry Ha, Hyekyung Yang, Sang Hyun Sung, Young Choong Kim (2009), Stimulatory constituents of Eclipta prostrata on mouse osteoblast differentiation, Phytotherapy research PTR, Volume: 23, Issue: 1, Pages: 129-131 [16] Xiong-Hao Lin, Yan-Bin Wu, Shan Lin, Jian-Wei Zeng, Pei-Yuan Zeng and Jin-Zhong Wu (2010), Effects of Volatile Components and Ethanolic Extract from Eclipta prostrata on Proliferation and Differentiation of Primary Osteoblasts, Molecules,15, 241-250 C Internet [17] http://agriviet.com [18] http://my.opera.com/titcuoititmat/blog/?startidx=14 [19] http://vietroselle.com/content/sp/caythuoc_details_view=7.php [20] http://vietbao.vn/Suc-khoe/Chua-cac-benh-thong-dung-voi-cay-nhonoi/30086379/248 [21] http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=1316 [22] http://www.naturalwellbeing.com/learning-center/Phytol 46 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ MS chất CME1……………………………………… 44 Phụ lục Phổ MS chất CME2……………………………………… 45 Phụ lục Phổ MS chất CME3……………………………………… 46 Phụ lục Phổ MS chất CME4……………………………………… 47 Phụ lục Phổ MS chất CMH1 ……………………………………….48 Phụ lục Phổ MS chất CMH2 ……………………………………… 49 Phụ lục Phổ MS chất CMH3 ……………………………………… 50 Phụ lục Phổ MS chất CMH4 ……………………………………… 51 Phụ lục Phổ MS chất CMH6…………………………………………52 47 Phụ lục Phổ MS chất CME1 48 Phụ lục Phổ MS chất CME2 49 Phụ lục Phổ MS chất CME3 50 Phụ lục Phổ MS chất CME4 51 Phụ lục Phổ MS chất CMH1 52 Phụ lục Phổ MS chất CMH2 53 Phụ lục Phổ MS chất CMH3 54 Phụ lục Phổ MS chất CMH4 55 Phụ lục Phổ MS chất CMH6 ... học thành phần hóa học cỏ mực 3 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cây cỏ mực huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An 2.2 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hóa học có cỏ mực. .. thuốc chưa bệnh dân gian chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học Vì thế, tơi chọn đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học cỏ mực huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An? ?? làm đề tài khóa luận tốt nghiệp... hình nghiên cứu cỏ mực thế giới và tại Việt Nam Tại nước châu Á, nhà khoa học nghiên cứu thành công tác dụng dược lí cỏ mực Tuy nhiên cơng trình nghiên cứu giới thành phần hóa học cỏ mực chưa