ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG MAI XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Đà Nẵng - Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG MAI XUÂN CƢỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN MINH LÝ Đà Nẵng – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Đề tài: “Nghiên cứu định danh tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) thị phân tử SSR” thực Mọi số liệu, hình ảnh, kết hồn tồn lấy từ thí nghiệm sau thực Các tài liệu có tìm sách, bàibáo, tạp chí… nước giới đáng tin cậy xác Tác giả Mai Xuân Cƣờng i LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Sinh học-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng tận tình giúp đỡ chúng em suốt năm học qua Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp Cũng xin gửi lời cảm ơn đến Hội động vật FrankFurt hỗ trợ phần kinh phí để em thực đề tài tập thể lớp Công Nghệ Sinh học khố 2015-2019 ln bên cạnh quan tâm giúp đỡ thời gian qua Một lần em xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tỏi 1.2 Các phương pháp định danh tỏi 1.2.1 Phân tích hình thái 1.2.2 Phân tích sinh hóa 1.2.3 Định danh loài tỏi thị phân tử .5 Chƣơng II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân tích số đặc điểm hình thái 2.4.2 Phương pháp thiết kế mồi SSR hệ gen lục lạp tỏi 2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA 2.4.4 Phương pháp PCR iii 2.4.5 Phương pháp điện di .9 2.4.6 Phương pháp xử lý liệu Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 3.1 Nghiên cứu hình thái loại tỏi 11 3.1.1 Đặc điểm hình thái bên loại củ tỏi 11 3.1.2 Đặc điểm cấu trúc bên loại củ tỏi 12 3.2 Thiết kế thị phân tử SSR nhận biết loại tỏi 16 3.3 Tách chiết DNA tổng số 16 3.4 Tối ưu hóa phản ứng PCR 17 3.4.1 Khảo sát thành phần phản ứng 17 3.4.2 Mẫu DNA đại diên 17 3.5 Sự khác biệt di truyền loài tỏi 18 3.6 Mối quan hệ khoảng cách di truyền mẫu tỏi dựa phân tích 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 1.Kết luận 23 2.Kiến nghị 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 Tài liệu nước 24 Tài liệu Việt Nam 26 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 3.1 Đặc điểm bên loài tỏi 13 Bảng 3.2 Đặc điểm cấu trúc bên loài tỏi 14 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Chỉ thị phân tử SSR Trình tự cặp mồi SSR chọn lọc Hệ số tương đồng mẫu tỏi 16 18 21 v DANH MỤC HÌNH Hình Nội dung Trang Hình 3.1 Màu sắc vỏ lụa bên mẫu tỏi 11 Hình 3.2 Màu sắc vỏ tép hình dạng mặt cắt ngang 15 Hình 3.3 DNA tổng số mẫu 17 Hình 3.4 Sự đồng di truyền mẫu tỏi 19 Hình 3.5 Sự khác biệt lồi tỏi nghiên cứu 20 Hình 3.6 Mối quan hệ di truyền loại tỏi 21 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µL microliter bp base pair Cs cộng CTAB cetyltrimethyl-ammonium bromide DAF DNA amplification fingerprinting DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleoside triphophate EDTA ethylene diamine tetraacetic acid ISSR inter-simple sequence repeats Kb kilobase mg milligram mL millilite mM millimol NCBI National Center for Biotechnology Information PCR polymerase chain reaction RAPD randomly amplified polymorphic DNA SRAP sequence related amplified polymorphism SSR simple sequence repeats PIC Polymorphic Information Content TAE Tris-Acetic acid-EDTA vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Tỏi (Allium sativum L.) gia vị quan trọng có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược liệu giá trị kinh tế cao Tỏi trồng nhiều tỉnh thành Việt Nam đảo Lý Sơn – tỉnh Quảng Ngãi, Hải Dương, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phan Rang Tỏi người tiêu dùng ưa chuộng chế biến tạo nên loại thực phẩm bổ dưỡng tỏi đen lên men, nước ép tỏi Sản phẩm từ tỏi lên men thành tỏi đen nguồn dược liệu quý việc trị bệnh điều trị huyết áp cao bệnh tim mạch, phòng ngừa hỗ trợ tiểu đường, ngăn ngừa phát triển tế bào ung thư (Joo Hee Kim et al , 2012) Lý Sơn trồng tỏi với diện tích khoảng 250 – 300 ha, đạt suất khoảng 70 – 80 tạ/ha Mỗi năm trồng mùa tỏi, bắt đầu trồng vào khoảng tháng (âm lịch) thu hoạch xong vào khoảng cuối tháng năm sau Tỏi Lý Sơn có giá trị kinh tế cao 120.000 - 130.000 đồng/kg (Hoàng Thị Lệ Hằng cs , 2011) chiếm ¾ giá trị nơng nghiệp huyện đảo Lý Sơn Tại tỉnh Quảng Ngãi, năm 2009 Hồ Huy Cường thực đề tài “ Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn” với mục đích khơi phục giống sản xuất có suất cao, sinh trưởng phát triển tốt điều kiện khắc nghiệt địa phương, giúp nâng cao đời sống người dân trồng tỏi huyện đảo Lý Sơn Tỏi Lý Sơn nhà nước công nhận thương hiểu tỏi quốc gia vào năm 2009 Hiện nay, việc phân biệt củ tỏi Lý Sơn với củ tỏi khác thị tường điều khó khăn chưa có nghiên cứu chuyên sâu Dẫn đến có nhiều loại tỏi thị trường không rõ xuất sứ, nguồn gốc mang thương hiệu tỏi Lý Sơn Điều ảnh hưởng nghiêm trọng đến thương hiệu tỏi Lý Sơn địa niềm tin người tiêu dùng Chính lý nên em thực đề tài : “Nghiên cứu định danh tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) kỹ thuật thị phân tử SSR” Nghiên cứu tiến hành nhằm mô tả, xác định đặc điểm hình thái củ đặc trưng, đặc điểm di truyền phân tích liệu thu thập hỗ trợ cho cơng tác định danh lồi, phục vục cho nghiên cứu chọn lựa giống, nhân giống giúp người tiêu dùng nhận định xác củ tỏi Lý Sơn có giá trị Mục tiêu nghiên cứu Xác định thị phân tử có khả ứng dụng để nhận diện tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) thị trường góp phần vào công tác giám định thương hiệu tỏi Lý Sơn (Hồ Huy Cường cs., 2009) Tỏi Trung Quốc có đường kính củ vùng rễ to (ĐKC: 4,37cm ĐKR: 2,01cm) Các loại tỏi khác có kích thước từ Khánh Hòa (3,33cm 1,33 cm); Hải Dương (3,51cm 1,58 cm), Phan Rang (3,81cm 1,57 cm) Lâm Đồng (4,31cm 1,78 cm) Tỏi Lý Sơn Khánh hịa có nguồn gốc, khác biệt kiểu hình hai loại tỏi điều kiện sống tạo nên Theo thơng tin điều tra q trình thực địa thu mẫu, nguồn nước Lý Sơn dành cho nông nghiệp hạn chế, vấn đề khó khăn lớn việc canh tác trồng tỏi người dân Điều làm cho củ tỏi trồng Lý Sơn trở nên săn chắc, hương vị cay nồng (Hồ Huy Cường cs., 2009) Điều kiện nước tưới Khánh Hòa thuận lợi hơn, củ tỏi phát triển tốt theo đánh giá 10 người nơng dân trồng tỏi Khánh Hịa có quê quán Lý Sơn hương vị tỏi nhạt nhiều nước tỏi trồng Lý Sơn Ngồi ra, yếu tố đất trồng, khí hậu, độ ẩm… tạo nên khác biệt hai loại tỏi Cần có nghiên cứu chuyên sâu để đưa kết luận xác khác biệt Tuy có khác biệt đường kính củ rễ tỷ lệ đường kính củ/đường kính rễ không cho thấy khác biệt loại tỏi Đây xem tính trạng di truyền ổn định lồi tỏi Hình dạng đáy củ chia làm hai nhóm, đáy lồi gồm tỏi Hải Dương Lâm Đồng, đáy gồm loại tỏi lại Kết phân chia tương đồng với phân tích màu sắc từ vỏ lụa bên củ tỏi 3.1.2 Đặc điểm cấu trúc bên loại củ tỏi Số liệu bảng 3.2 cho thấy, tỏi Lý Sơn có số tép tương đối nhiều (19,8 tép/củ) tương đồng với nghiên cứu nước (Hồ Huy Cường cs.,2009; Hoàng Thị Lệ Hằng cs., 2011).Tỏi Phan rang chứa nhiều tép (28,1 tép) tiếp đến tỏi Khánh Hòa (24,63 tép), tỏi Lâm Đồng (19 tép), tỏi Hài Dương (15 tép) tỏi Trung Quốc (10,8 tép).Các loại củ tỏi Phan Rang, Lý Sơn Khánh Hòa bên có lớp tép, lớp bên ngồi gồm tép to bên tép nhỏ, xếp theo trật tự định Màu sắc vỏ lụa tép tỏi cho thấy khác biệt nhóm tỏi Mặt cắt ngang chia loại tỏi thành hai nhóm: Allium sativum var sativum (tỏi mềm – Softneck) Allium sativum var ophioscorodon (tỏi cứng – Hardneck) Việc phân loại dựa vào có mặt thân gỗ cứng nằm trung tâm củ, nên hai loại tỏi Hải Dương Lâm Đồng thuộc nhóm tỏi cứng, loại tỏi cịn lại thuộc nhóm tỏi mềm (Helm J et al 1956) Theo nghiên cứu Jungmin Lee cộng loại tỏi cứng chứa hàm lượng methiin, alliin tổng lượng axit amin tự lớn so với tỏi mềm (Lee J et al 2005) 12 Hình mặt cắt ngang tỏi Lý Sơn Khánh Hịa hình tròn, tỏi Phan Rang Trung Quốc gần tròn, lại tỏi Hải Dương Lâm Đồng hình oval Kết hình dạng mặt cắt xác định dựa vào tỷ lệ hai đường chéo vuông gốc mức độ đối xứng trục củ tỏi (hình 3.2) Bảng 3.1: Đặc điểm bên ngồi loại củ tỏi STT Loại tỏi Hải Dương Lâm Đồng Trung Quốc Lý Sơn Khánh Hòa Phan Rang Số mẫu Màu sắc vỏ lụa Sắc tố anthyno cin Hình dạng đáy củ Đƣờng kính củ (ĐKC) (cm) Đƣờng kính vùng rễ (ĐKR)(cm) Tỷ lệ rễ/củ Nâu tía Có Lồi 3,51a±0,38 1,58f±0,1 2,22ab±0,11 Nâu tía Có Lồi 4,31a±0,69 1,78ef±0,09 2,42ab±0,31 Có Bằng 4,37aed±0,29 2,01d±0,11 2,17b±0,05 Trắng tía 35 Trắng Khơng Bằng 2,79ab±0,2 1,11a±0,09 2,52a±0,16 35 Trắng Không Bằng 3,33ac±0,25 1,33b±0,09 2,51a±0,14 10 Trắng Khơng Bằng 3,81ad±0,15 1,57c±0,13 2,44ab±0,17 Chú thích:Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p=0,05 13 Bảng 3.2: Đặc điểm cấu trúc bên loại củ tỏi STT Loại tỏi Màu vỏ tép Thân gỗ Hình mặt cứng bên cắt ngang củ củ Tỷ lệ hai đƣờng chép vuông gốc Số tép Số lớp Độ chặt tép tép tỏi (cm) Hải Dương Tím Có Hình oval 1,22 15a±2,23 Chặt Lâm Đồng Tím Có Hình oval 1,22 19a±2,34 Chặt Trung Quốc Nâu tím Khơng có Hình trịn 1,03 10,8d±0,83 Hơi chặt Lý Sơn Trắng Khơng có Hình trịn 1,0 19,8a±3,7 Chặt Khánh Hịa Trắng Khơng có Hình trịn 1,02 24,63bc±3,47 Chặt Phan Rang Trắng Khơng có Hình trịn 1,07 28,1c±5,8 Chặt Chú thích:Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thơng kê với p=0,05 14 Hình 3.2: Màu sắc vỏ tép mặt cắt ngang củ loại củ tỏi 15 Nghiên cứu đặc điểm hình thái giúp nhận biết tỏi trồng Lý Sơn với loại tỏi trồng địa phương khác Số lượng mẫu đại diện cho địa phương phù hợp với mục đích nghiên cứu Cần có thêm nghiên cứu phân tích chuyên sâu đa dạng di truyền giống tỏi Các nghiên cứu test hóa sinh, xác định hàm lượng hợp chất thứ cấp có củ tỏi nhầm đưa kết so sánh xác mặt khoa học Kết nghiên cứu đề tài tỏi Lý Sơn có tương đồng cao so với nghiên cứu nước thực 3.2 Thiết kế thị phân tử SSR nhận biết loại tỏi Bằng phần mềm SSRIT, tổng cộng có 18 trình tự lặp lại dinucleotide tìm thấy khơng tìm kiếm trình tự lặp lại trinucleotide với số lần lặp lại tối thiểu Trong số loại SSR dinucleotide, phần lớn trình tự lặp lại nhỏ 10 lần, trình tự lặp lại phổ biến (AT) (TA) Từ trình tự trên, chúng tơi thiết kế thị chọn lọc thị SSR phục vụ cho đề tài nghiên cứu Bằng phần mềm TANDEM REPEATS FINDER, tổng cộng có 38 trình tự lặp lại tìm thấy, độ dài đoạn lặp lại dao động từ 13 đến 30 nucleotide Từ trình tự trên, chúng tơi thiết kế chọn lọc thị STR phục vụ cho đề tài nghiên cứu Trình tự cặp mồi trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3: Chỉ thị phân tử Chi tiết thị SSR Tổng số SSR dinucleotde 56 Tổng số primer thiết kế 13 Primer chọn lọc 3.3 Tách chiết DNA tổng số loại tỏi thu thập gồm: tỏi Lý Sơn, tỏi Phan Rang, tỏi Khánh Hòa, tỏi Hải Dương, tỏi Lâm Đồng, tỏi Trung Quốc trồng thử nghiệm trại thực nghiệm khoa Sinh – Môi Trường trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng Mẫu loại tỏi thu thập vườn để tách chiết DNA tổng số với số lượng mẫu loại tỏi : Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang loại 10 mẫu lá; Hải Dương Lâm Đồng, Trung Quốc 1, Trung Quốc loại mẫu lá; Áo mẫu 16 Mẫu tiến hành tách DNA tổng số dung dịch đệm CTAB 2% (Tris HCl 2M, pH=7.5; EDTA 0.5 M; NaCl 5M; Sarkosy 5%; Sorbitol 0.35M; CTAB 2%) Các mẫu tách chiết có DNA tổng số (hình3.3), chất lượng DNA với độ tinh tương đối, số mẫu chứa thành phần RNA DNA đứt gãy Tất DNA tổng số tách chiết đủ điều kiện để sử dụng Hình 3.3: DNA tổng số mẫu tỏi 3.4 Tối ƣu hóa phản ứng PCR 3.4.1 Khảo sát thành phần phản ứng Dãy nhiệt độ khảo sát từ 56oC đến 62oC Hầu hết cặp mồi biểu thị vạch nhiệt độ 58oC nhiên sản phẩm thu mồi L1, R5 không rõ nét Nhiệt độ bắt cặp mồi trình bày bảng 3.4 Thành phần phản ứng với tổng thể tích 15 µL đó: nồng độ Primer 0,5-1 pmol/µL, nồng độ DNA từ 20 – 100ng, số chu kỳ lặp lại 25 chu kỳ 3.4.2 Mẫu DNA đại diên Các cặp mồi chạy với cá thể để đánh giá đồng mặt di truyền loài tỏi Các mẫu thuộc loài tỏi cho vạch băng có độ dài Chứng tỏ bảo tồn nguồn gen cao hệ gen lục lạp (hình 3.4) Mẫu DNA đại diễn cho quần thể loài tỏi tỉnh bao gồm tất DNA mẫu loài tỏi trộn lại với Tạo nguồn DNA đại diện cho việc phân tích di truyền sau 17 Bảng 3.4 : Trình tự cặp mồi ứng dụng cpSSR Maker GRL1 GRL2 STR1 STR2 STR5 Nhiệt độ bắt Độ Primer sequence (5’-3’) dài Hệ số PIC cặp (Tm) sản phẩm 600C 573-589 0,722 570C 560-587 0,956 CGTTTTGCTCGAACTCCATCA 570C 570-589 0,870 564-583 0,722 272-294 0,833 F: GGATCCCCGCTATTAGCTGT R: CCCTTTTCGAACGAAATCAGAGG F: TTCGTGGATCGGATCATCGG R: TGTTGATTGCCATTGGGAGAGA F: R: TTGGGAAATCCATAGGGCCA F: CATAGGTCGTCGATTCGGCA 580C R: TCGTTTCCTTAGGCCACTGG F: ATAGCGTCTCTGCCCATGAC 580C R: AGTTTCATTAGCTCCCGAGGT 3.5 Sự khác biệt di truyền loài tỏi Kết sau phân tích mẫu tỏi thị phân tử SSR thu thập 15 phân đoạn đa hình khơng có phân đoạn đơn hình Mồi GRL2 biểu tính đa hình cao với phân đoạn (chiếm 33,33%), mồi STR2 GRL1 có tính đa hình thấp với phân đoạn (chiếm 13,33%) Giá trị PIC thể đa di truyền alen locus Giá trị PIC lớn thì đa hình cao ngược Trong thị SSR, mồi GRL2 có giá tị PIC cao mồi GRL1 (0,956>0,722) Trong thị STR, mồi STR1 có giá trị PIC cao (0,870) mồi STR2 có giá trị PIC thấp (0,722) Từ kết phân tích hình ảnh điện di, chúng tơi thông kê băng điện di xử lý số liệu phần mềm NTSYS_PC version 2.1 nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu tỏi nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền biểu đồ tiến hóa (hình 3.6) Thơng qua phản ứng PCR đoạn DNA lục lạp tỏi, nghiên cứu tiến hành phân tích khác biệt dựa vào hình ảnh điện di Qua đó, tất cặp mồi sử dụng cho thấy khác biệt Mồi L2 phân biệt tất mẫu nghiên cứu Các mồi R2 R5 phân biệt nhóm tỏi tỏi mềm (LS, KH, PR, TQ) với tỏi cứng (HD, ĐL) Mồi L1 giúp phân biệt tỏi LS, KH với tỏi PR TQ (hinh 3.5) 18 Primer L2 Primer L1 Primer R1 Primer R2 Primer R5 Hình 3.4: Sự đồng vùng DNA khuếch đại mẫu tỏi 19 Primer L1 Primer L2 Primer R1 Primer R1 Primer R5 Hình 3.5: Sự khác biệt loài tỏi nghiên cứu 20 3.6 Mối quan hệ khoảng cách di truyền mẫu tỏi dựa phân tích Bảng 3.5: Hệ số tương đồng di truyền mẫu tỏi Lý Sơn Khánh Hòa Phan Rang Hải Dương Lâm Đồng Lý Sơn 1,00 Khánh Hòa 1,00 1,00 Phan Rang 0,60 0,60 1,00 Hải Dương 0,466 0,467 0,333 1,00 Lâm Đồng 0,466 0,467 0,333 0,733 1,00 Trung Quốc 0,733 0,733 0,733 0,333 0,333 Trung Quốc 1,00 Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu dao động từ 0,33 đến 1,0 Trong đó, mẫu tỏi Lý Sơn Khánh Hịa có hệ số tương đồng tuyệt đối 1,0, điều kh ng định hai giống tỏi có chung nguồn gốc xuất sứ Ngồi ra, nhận thấy tỏi Phan rang tỏi Trung Quốc có mối quan hệ gần gũi mặt di truyền xếp vào nhóm riêng Tỏi Hải Dương Đà Lạt-Lâm Đồng tách nhóm riêng với hệ số di truyền loại tỏi 0,733 Mặc dù vậy, hệ số tương đồng di truyền nhóm tỏi lớn dao động từ 0,33-0,73 cho thấy đa dạng cao mặt di truyền giống tỏi Hình 3.6: Mối quan hệ di truyền mẫu tỏi Dựa vào phát sinh lồi (hình 3.6) chúng tơi chia mẫu tỏi nghiên cứu thành nhóm chính: 21 Nhóm gồm mẫu tỏi Lý Sơn, Khánh Hòa, Phan Rang Trung Quốc chia làm nhóm phụ: nhóm phụ 1.1 gồm mẫu Lý Sơn Khánh Hịa đánh giá khơng có sai khác di truyền, hệ số tương đồng hai mẫu tuyệt đối (1,00) Nhánh phụ 1.2 gồm mẫu tỏi Phan Rang Trung Quốc có hệ số tương đồng 0,733 Nhóm gồm mẫu tỏi Hải Dương Lâm Đồng, hệ số tương đồng hai mẫu tỏi 0,733 Từ kết trên, mẫu tỏi Lý Sơn Khánh Hòa chứng tỏ có nguồn gốc xuất sứ Tỏi Phan Rang có nguồn gốc từ loại tỏi Trung Quốc Tỏi Lâm Đồng có nguồn gốc du nhập từ loại tỏi phía Bắc nước ta Vì theo kết khỏa sát thực địa, tỏi trồng truyền thống Lâm Đồng dựa vào độ cao nhiệt độ phù hợp trồng giống tỏi chịu lạnh tỏi Hải Dương So sánh kết đánh giá hình thái kết phân tích mối đa dạng di truyền có tương đồng Kết từ phát sinh loài phù hợp với kết phân loại dựa vào mặt cắt ngang mẫu tỏi (Helm et al , 1956) màu sắc vỏ lụa bên Điều chứng tỏ mẫu tỏi khác hình thái dẫn đến khác mặt di truyền 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào đặc điểm hình thái, phân biệt tỏi Lý Sơn cách dễ dàng với tỏi Lâm Đồng tỏi Hải Dương Tỏi Lý Sơn khó khăn so sánh với tỏi Phan Rang Khánh Hịa loại tỏi có nhiều đặc điểm hình thái giống Tuy nhiên, củ tỏi Lý Sơn có đường kính củ (2,79±0,2cm), đường kính vùng rễ (1,11±0,09cm), số lượng tép (19,8±3,7) thấp so với tỏi Khánh Hòa Phan Rang Chỉ thị phân tử SSR có hiệu cao việc phân biệt mẫu tỏi Primer L2 cho phép nhân dạng tỏi có nguồn gốc Lý Sơn so với loại tỏi khác thị trường Các Primer L1, R1 R5 có khả nhận dạng hai nhóm tỏi tỏi cứng tỏi mềm Từ kết nghiên cứu, đề tài xây dựng mối quan hệ loài tỏi Việt Nam Từ xác định nguồn gốc phát sinh loài mẫu tỏi Kiến nghị Tiếp tục tiến hành lựa chọn thêm nhiều thị phân tử giúp phân biệt loài tỏi Việt Nam Phân tích hóa sinh chun sâu giúp phân biệt tỏi vùng Lý Sơn tỏi vùng Khánh Hòa 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Abdur Rahman B.S, Louis K.M, Mation O, Rolfy B 1996 Composition of volatiles in relation to taxonomy of American Allium Amer J Bot 53(5): 477-484 Amer J, Bot 1966 Composition of volatiles in relation to taxonomy of American Allium, 53(5):477-484 Ankri S, Mirelman D 1999 Antimicrobial properties of allicin from garlic Microbes and Infection, 2: 125-129 Eric Block (1985) "The chemistry of garlic and onions" Scientific American 252 (March):114-9 Ashish K P, Roy R.K., Tamta S, Rana T.S (2017) Development of cpSSR markers for analysis of genetic diversity in Gladiolus cultivars Plant Gene 10 (2017) 31–36 Cunha C.P, Hoogerheide E.S.S, Zucchi M.I, Monteiro M, Pinheiro J.B 2012 New microsatellite markers for garlic, Allium sativum (Alliaceae) Am J Bot 99(1):e17– e19 Chen S.X, Chen F.X, Shen X.Q, Yang Y.T, Liu Y, Meng H.W Analysis of the genetic diversity of garlic (Allium sativum L.) by simple sequence repeat and inter simple sequence repeat analysis and agro-morphological traits Biochem Syst and Ecol 2014; 55:260-267 Ding P, Xu J.Y, Chu T.L 2006 “RAPD analysis on germ plasm resources of different farm races of Morinda officinalis”, Zhong Yao,29(1):1-3 Helm J 1956 “Die zu Wiirz- und Speisezwecken kultivierten Arten der Gattung AlIium L.” Kulturpflanze, 4:130-180 Ipek M, Ipek A, Almquist S.G, Simon P.W 2005 Demonstration of linkage and development of the first low-density genetic map of garlic based on AFLP markers Theor Appl Genet 110, 228–236 Ipek M, Ipek A, Simon P.W 2003 Comparison of AFLPs, RAPD markers, and isozymes for diversity assessment of garlic and detection of putative duplicates in germplasm collections J Am Soc Hort Sci 128, 246–252 Ipek M, Ipek A, Simon PW 2008(b) Molecular characterization of Kastamonu garlic: an economically important garlic clone in Turkey Sci Hortic 115(2):203–208 Ipek M, Ipek A, Simon PW 2008(a) Rapid characterization of garlic clones with locusspecific DNA markers Turk J Agric For 32:357–362 24 Ipek M, Sahin N, Ipek At, Cansev A, Philipp W.S 2014 Development and validation of new SSR markers from expressed regions in the garlic genome Sci Agric 72(1): p.41-46 Kim J H, Nam S.H, Catherine W.R, Kang M.Y 2012 A comparative study on the antioxidative and anti-allergic activitié of fresh and aged balck garlic extracts International Journal of Food Science and Technology Lallemand J, Messian C.M, Briand F, Etoh T 1997 “Delimitation of varietal groups in garlic (Allium sativum l.) By morphologigal, physiological and biochemical Characters” ISHS Acta Horticulturae 433 Lee J, James M.H, 2005, “Free Amino Acid and Cysteine Sulfoxide Composition of 11 Garlic (Allium sativum L.) Cultivars by Gas Chromatography with Flame Ionization and Mass Selective Detection”, J Agric FoodChem,53,9100−9104 Ma K.H, Kwag J.G, Zhao W, Dixit A, Lee G.A, Kim H.H, Chung I-.M, Kim N.S, Lee J.S, Ji J.J, Kim T.S, Park Y.J 2009 Isolation and characteristics of eight novel polymorphic microsatellite loci from the genome of garlic (Allium sativum L) Sci Hortic 122(3):355–361 Mikhail A.F, Alexey V.B, Alexander M.M, Elena Z.K 2016 The complete plastid genome sequence of garlic Allium sativum L ISSN: 2380-2359 Naouel Jabbes, Ingrid Arnault , Jacques Auger , Bouthaina Al Mohandes Dridi , Cherif Hannachi (2012) “Agro-morphological markers and organo-sulphur compounds to assess diversity in Tunisian garlic landraces”, Scientia Horticulturae 148 (2012) 47– 54 Rakesh Sharma V, Sunil M., Mukesh K., Anil S 2018 Assessment of genetic diversity in garlic (Allium sativum L.) genotypes based on ISSR markers Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2018; 7(2): 3119-3124 Robert L.J, Rickey Y.Y, Marvin A.T, Alex S.R, 1987 “Anthocyanins As Food Colorants A Review, Food Biochemistry, 11, 201-247 Son J.H, Kim K.H, Shin S, Choi I 2014 “Development of SCAR Markers for Korean Wheat Cultivars Identification”, Plant Breed Biotech 2014 (September) 2(3):224230 Torgils F, Oyvind M.A, 1996, “Malonated anthocyanins of garlic Allium sativum L.”, Food chemistry,58,215-217 25 Tài liệu Việt Nam Bùi Thị Tho, Nguyễn Thị Thanh Hà (2009) Dược liệu học Thú y NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 77-81 Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội Hồ Huy Cường (2009), “Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn” Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam Mã số 05/2009/HĐ-ĐTKHCN Nguyễn Phú Sơn, Nguyễn Thị Thu An (2014) “Nguyên cứu chuỗi giá trị sản phẩm tỏi tinh Ninh Thuân” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ: 35 (2014): 16-23 Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết tỏi E.coli gây bệnh E.coli kháng Ampicillin, Kanamycin Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 6: 804-808 Vũ Xuân Quang (1993) Những thuốc nam chữa số bệnh viêm nhiễm NXB Y học 26 ... tài : ? ?Nghiên cứu định danh tỏi L? ? Sơn (Allium sativum L. ) kỹ thuật thị phân tử SSR? ?? Nghiên cứu tiến hành nhằm mô tả, xác định đặc điểm hình thái củ đặc trưng, đặc điểm di truyền phân tích liệu... CƢỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH TỎI L? ? SƠN (ALLIUM SATIVUM L. ) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN MINH L? ? Đà Nẵng – Năm 2019 L? ??I... 2019 L? ??I CAM ĐOAN Đề tài: ? ?Nghiên cứu định danh tỏi L? ? Sơn (Allium sativum L. ) thị phân tử SSR? ?? thực Mọi số liệu, hình ảnh, kết hồn tồn l? ??y từ thí nghiệm sau thực Các tài liệu có tìm sách, bàibáo,