MỤC LỤC I: GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC BÊNH VIÊM GAN B 1) 2) 3) 4) TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LỊCH SỬ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA DỊCH BỆNH DỊCH TỄ HỌC CẤU TRÚC VIRUS VIÊM GAN B II: CƠ CHẾ XÂM NHẬP VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VIÊM GAN B (HBV) 1) MỐI LIÊN QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ SỰ XÂM NHIỄM CỦA HBV VÀO TẾ BÀO GAN 2) CƠ CHẾ XÂM NHIỄM VÀ TÁI BẢN CỦA HBV 3) NGUYÊN NHÂN SINH BỆNH VIÊM GAN DO NHIỄM HBV III/ CÁC TRIỆU CHỨNG BỆNH LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐOÁN 1) CÁC TRIỆU CHỨNG BỆNH LÝ 1.1 VIÊM GAN B CẤP TÍNH 1.2 VIÊM GAN B TỐI CẤP 1.3 CÁC DI CHỨNG VÀ HẬU QUẢ CỦA VIÊM GAN VIRUS B a) Viêm gan B mãn tính b) Xơ gan sau viêm gan c) Ung thư tế bào gan 2) MỘT SỐ XÉT NGHIỆM TRONG VIÊM GAN VIRUS 2.1) CÁC XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH TỔN THƯƠNG GAN 2.2) XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH CÁC DẤU ẤN VIRUS HBV a) PHƯƠNG PHÁP ELISA b) PHƯƠNG PHÁP RIA 2.3)SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHUẨN ĐOÁN VIÊM GAN B a) PHƯƠNG PHÁP PCR b) CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 3) MỘT SỐ LOẠI THUỐC DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN B MẠN IV/ CÁCH PHÒNG TRÁNH VIÊM GAN B KẾT LUẬN MỞ ĐẦU Từ “bệnh viêm gan” có nghĩa “tình trạng sưng viêm gan " Bệnh viêm gan B bệnh viêm gan nghiêm trọng thường gặp thường gặp giới siêu vi viêm gan B (HBV) gây (siêu vi cơng gan) Bệnh viêm gan B cấp tính (ngắn hạn) chuyển thành viêm gan B mãn tính — bệnh đời gây xơ gan, sẹo gan, ung thư gan, suy gan Viêm gan vi-rút B (VGVR B) bệnh có tần suất mắc tỷ lệ tử vong cao Trên giới có khoảng tỷ người bị nhiễm vi-rút viêm gan B (VRVGB), có 360-400 triệu người mang vi-rút mạn Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới (WHO), năm có khoảng triệu người nhiễm HBV mạn tử vong xơ gan ung thư gan nguyên phát Nguy tương đối bị ung thư gan nguyên phát người nhiễm VRVGB cao gấp 100 lần so với người không nhiễm VRVGB.Việt Nam nằm khu vực có tỷ lệ nhiễm VRVGB cao Không phải tất người bị nhiễm viêm gan B phát triển thành viêm gan B mãn tính Thực ra, đa số người lớn khỏe mạnh (90%) bị nhiễm bệnh hồi phục phát triển kháng thể bảo vệ chống lại nhiễm trùng tương lai Nếu siêu vi máu sáu tháng, quý vị chẩn đốn bị viêm gan B mãn tính, thường cần phải điều trị để tránh gây tổn thương thêm cho gan I ) BỆNH VIÊM GAN B 1)Tình hình dịch bệnh : Gan phận quan trọng thể Gan giúp loại bỏ chất độc hại vi khuẩn khỏi máu, nơi dự trữ lượng , enzyme hormone quan trọng thể Viêm gan tượng hủy hoại tế bào gan Viêm gan virut bệnh truyền nhiễm phổ thông giới thách thức quan trọng sức khỏe cộng đồng Hiện có tổng cộng loại viêm gan A, B, C, D, E, F G Viêm gan A, E F lây lan qua đường miệng ;viêm gan B , C , D, G truyền qua máu dịch thể Trong nguy hiểm viêm gan B C mang tính chất phổ biến Theo ước tính tổ chức Y tế giới ( WTO ), có khoảng 35 triệu người mang virut viêm gan B, tập trung chủ yếu Châu Phi, Châu Á, khu vực Đơng Nam Á, chiếm 75 % khu vực Châu Á Tây Thái Bình Dương Viêm gan B đánh giá nguyên nhân gây tử vong Vào năm 1996 1,1 triệu người chết bệnh Việt Nam thuộc vùng dịch tễ lưu hành viêm gan virut đặc biệt viêm gan A B Trong số 250 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính Châu Á – Thái Bình Dương, Việt Nam chiếm tới 10- 14% Hiện Việt Nam nước có tỉ lệ viêm gan B lớn giới ( 8- 12%) Trong 10 -15% nhiễm BHV có diễn biến thành viêm gan mạn tính, sau khoảng 25% thành xơ gan, 80% dẫn đến ung thư gan gây tử vong Ở Việt Nam , theo GS Hà Văn Mạo , chủ tịch hội gan mật Việt Nam , Viêm gan B bệnh truyền nhiễm nguy hiểm , có khả lây nhiễm cao gấp 100 lần so với HIV gây bệnh AIDS Gần nửa số bệnh nhân viêm gan B mạn tính tử vong sớm bệnh 2)Lịch sử hình thành phát triển bệnh : Lần phát bệnh đại dịch gây siêu vi viêm gan B thực Lurman vào năm 1885 Một đợt bùng phát bệnh đậu mùa xảy Bremen vào năm 1883 1289 nhân viên nhà máy đóng tàu chủng ngừa bạch huyết từ người khác Sau vài tuần, lên đến tám tháng sau đó, 191 cơng nhân chủng ngừa bị bệnh vàng da chẩn đoán bị viêm gan huyết Các nhân viên khác tiêm phòng với lô khác bạch huyết khỏe mạnh Lurman giấy, coi ví dụ cổ điển dịch tễ học nghiên cứu, chứng minh bạch huyết bị ô nhiễm nguồn gốc dịch bệnh bùng phát Sau đó, bùng phát nhiều Viêm gan B bệnh truyền nhiễm viêm gan gây siêu viêm gan B (HBV) có ảnh hưởng đến hominoidea , bao gồm người Ban đầu gọi "viêm gan huyết thanh", bệnh gây dịch bệnh phận châu Á châu Phi , bắt nguồn Trung Quốc Khoảng 1/3 dân số giới bị nhiễm thời điểm sống họ, bao gồm 350 triệu người lây nhiễm mãn tính 3) Dịch tễ học : HBV thường truyền qua máu sản phẩm máu trường hợp định, lây nhiễm qua đường miệng Virut tìm thấy tinh dịch, dịch tiết âm đạo, sữa mẹ, huyết chúng phương tiện hữu hiệu để truyền HBV Các nghiên cứu cho thấy kháng sinh HBV có mặt nước tiểu, phân , mật , mồ hôi nước mắt không lâu dài Tất loại dịch thể người nhiễm HBV có khả mang mầm bệnh Sự nhiễm HBV phổ biến toàn giới tỉ lệ nhiễm bệnh khác lớn nước, liên quan đến khác hình thức truyền bệnh độ tuổi nhiễm bệnh Tỉ lệ người mang mầm bệnh cao tỉ lệ truyền từ mẹ sang số cho thấy tỉ lệ nhiễm BHV cao số nước Ở vùng có tỉ lệ nhiễm HBV cao Trung Quốc, Đơng Nam Á , Châu Phi,Thái Bình Dương khoảng 10-20 % dân số trưởng thành nhiễm HBV Ở quốc gia này, đường truyền HBV, đường từ mẹ sang chủ yếu Sự nhiễm giai đoạn ấu thơ phổ biến, đặc biệt người mang mầm bệnh nhiễm HBV từ mẹ sinh Càng nhiễm sớm mầm bệnh tồn lâu Ở vùng có tỉ lệ nhiễm HBV trung bình Bắc Âu hay Đơng Âu, Vùng Địa Trung Hải, Nhật Bản, Trung Á , Trung Đông, Châu Mĩ la tinh Nam Mỹ , tỉ lệ người mang mầm bệnh thấp khoảng 0.1 -0.5 % dân số Hiếm thấy nhiễm HBV giai đoạn ấu thơ mà hình thức truyền nhiễm qua đường sinh dục tiêm qua da Vương quốc Anh nước nhiễm HBV 4) Cấu trúc virus viêm gan B Virus viêm gan B thuộc họ Hepadnaviridae, loại vi-rút hướng gan (hepatotropic) có cấu trúc nhân DNA Hiện người ta chưa nuôi cấy VRVGB nghiên cứu VRVGB thiết kế dựa mơ hình thực nghiệm vi-rút nhóm Hepadnavirus gây bệnh số động vật có vú marmot, sóc x ám số loài chim vịt Bắc Kinh Trong huyết bệnh nhân giai đoạn nhân dơi vi-rút, người ta tìm thấy ba kiểu cấu trúc: Hạt Dane hay virion hoàn chỉnh có đường kính 42 nm, gồm lớp : - Vỏ dày nm, cấu tạo chuỗi polypeptid Chuỗi có kích thước ngắn KN bề mặt HBsAg - Vỏ capsit cấu thành chuỗi polypeptid: + Chuỗi polypeptid lõi ngắn KN lõi vi-rút, gọi HBcAg + Chuỗi polypeptid dài có trọng lượng phân tử 25 kDa, gọi polypeptid trước lõi Cấu trúc gồm polypeptid ngắn cọng với peptid đơn, gọi HBeAg Cấu trúc hạt Dane virus HBV Các cấu trúc hình cầu hình ống Hầu hết hạt HBs có hình cầu, đường kính khoảng 17-25nm, chiếm số lượng lên đến 1013/ml Ngồi ra, cịn có hạt hình ống, có đường kính 20nm với chiều dài thay đổi, chiếm lượng vào khoảng 1011/ml µg/ml Ngược lại, huyết người có nồng độ virút thấp, chứa khoảng 1012/ml hạt HBs hình cầu vài khơng có hạt hình ống.Hai cấu trúc phần KN bề mặt vi-rút sản xuất dư thừa bào tương tế bào gan, chúng mang đặc tính HBsAg Tuy nhiên chúng khơng chứa HBV DNA nên khơng có tính lây nhiễm Cấu trúc hình cầu hình ống có chứa kháng ngun bề mặt khơng có hạt lõi mang genome nên khơng có tính gây bệnh Cấu trúc gen HBV Cấu trúc genome HBV Bộ gen VRVGB phân tử DNA dạng vịng có khoảng 3.200 nucleotide (3,2 kb) Đây chuỗi xoắn kép khơng hồn tồn gồm hai chuỗi đơn có chiều dài khác (Hình 1.1): - Chuỗi dài nằm ngồi, có cực tính âm (-), tạo nên vịng trịn liên tục với chiều dài cố định 3,2 kb Chuỗi gen mã hóa cho tất thơng tin di truyền vi-rút - Chuỗi ngắn nằm trong, có cực tính dương (+) với chiều dài thay đổi từ 50 – 100% chiều dài gen Bộ gen DNA có cấu trúc kép gồm gen (còn gọi khung đọc mở (open reading frame) S, C, P X Đây vùng mã hoá để tổng hợp protein vi-rút Quá trình đọc mã ba nucleotide AUG gọi codon khởi đầu (start codon) chấm dứt codon kết thúc (stop codon) TAG - Gen S phần protein vỏ, bao gồm vùng S, pre-S1 pre-S2 mã hoá để tổng hợp protein bề mặt hay kháng nguyên bề mặt HBsAg (“s”:surface) Vùng S pre-S2 có chiều dài cố định vùng pre-S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo phân týp khác - Gen C polypeptid mang kháng nguyên HBcAg HBeAg Nếu trình đọc mã bắt đàu từ codon AUG thứ vị trí 1814 đọc suốt chiều dài đoạn gen pre-C C tổng hợp nên HBeAg - Gen P chiếm 80% chiều dài gen Sản phẩm ADN-polymerase cần thiết cho nhân lên vi-rút tham gia vào trình chép ngược DNA từ RNA tiền gen - Gen X có vai trị chuyển hoạt tính (transactivation) q trình nhân đơi vi-rút II/ CƠ CHẾ XÂM NHẬP VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VIÊM GAN B (HBV) 1) MỐI LIÊN QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ SỰ XÂM NHIỄM CỦA HBV VÀO TẾ BÀO GAN Sau vượt qua hang rào ngăn chặn xâm nhiễm thể, HBV di chuyển tới đích đến cuối tế bào gan Cấu trúc đặc biệt HBV cho phép xâm nhập đưa vật chất di truyền vào tái bên tế bào gan Khả xâm nhập vào tế bào gan phân tử protein bề mặt HBsAg thực HBsAg ( Hepatitis B surface Antigen) protein có tính kháng nguyên, tham gia cấu tạo nên lớp vỏ virus HbsAg gồm ba loại protein protein S ( smal), protein M ( medium), protein L ( large) Cả ba loại protein mã hóa gen S genome virus Gen S bao gồm phân vùng : phân vùng preS1, vùng PreS2 vùng S Trong cấu trúc gen, vùng PreS2 vùng S thường có chiều dài cố định vùng pre S1 có chiều dài thay đổi tùy theo phân typ khác Protein S mã hóa vùng S chiếm đa số lượng protein có bề mặt hạt virus Protein S chuối gồm 226 amino acid nối với tìm thấy hai dạng: dạng khơng glycozit hóa dạng có glycozit hóa.Chính protein S qui định typ virus HBV Protein M chuỗi polypeptide gồm 281 amino acid Trong đó, có 55 acid amin mã hóa vùng PreS2 phần cịn lại mã hóa đoạn S.Protein PreS2 có tính ưa nước, khơng chứa cystein nhạy cảm với proteases Có thể tách có chọn lọc vùng protein PreS2 khỏi kháng nguyên Hbs mà không làm tổn hại cấu trúc protein S.Vùng PreS2 có vai trị giúp cho virus bám dính vào màng xâm nhập vào bên tế bào gan PreS2 có khả bám vào tế bào gan liên kết với loại albumin tổng hợp huyết người thành tế bào gan có có điểm thụ thể Albumin pHSA ( Polymerized Human Serum Albumin) Nếu tế bào gan thiếu điểm thụ thể làm cho tế bào có khả kháng với nhiễm HBV Protein lớn kháng nguyên bề mặt- protein L bao gồm hai phân vùng : vùng S PreS ( tạo thành chuỗi PreS1 PreS2) Vùng hoạt động PreS ( acid amin 21đến 47) dễ bị ảnh hưởng kháng thể, thụ thể proteases Protein L đóng vai trị quan trọng việc gắn vào thụ thể xâm nhập vào tế bào gan có vùng hoạt động nằm chuỗi PreS1 Hình vẽ Protein S với cấu trúc glycozit hóa Vùng glycosyl hướng phía bên ngồi vùng ưa nước hườn vào phía bên lớp vỏ Cấu trúc protein M tạo thành từ doạn S 55 acid amin đoạn PreS2 Cấu trúc có vùng có khả gắn với Albumin huyết giúp cho HBV bám dính vào tế bào gan Protein L với cấu tạo từ ba chuỗi : S, PreS PreS2 Chuỗi PreS1 bao bọc chuỗi S phần chuỗi PreS2 Trình tự cuối PreS1 Methionin-Glycin với vài acid amin lân cận tín hiệu cho việc thay Methionon acid béo 18C Myristic Ngoài ra, chuỗi PreS1 có vùng chức thâm nhập vào tế bào gan thông qua thụ thể màng 2) CƠ CHẾ XÂM NHIỄM VÀ TÁI BẢN CỦA HBV Những tế bào gan tế bào đích virus viêm gan B, để sinh sơi phát triển thể vật chủ HBV phải xâm nhập vào tế bào gan Sự xâm nhập xảy theo bước sau : (1)Tấn công, (2)Thâm nhập, (3) Dịch mã, (4) Phiên mã, (5) Tổng hợp genome, (6) Lắp ráp, (7) Giải phóng 2.1) Tấn cơng Trước hết, để cơng xâm nhiễm vào tế bào gan, virus phải vượt qua hàng rào bảo vệ hệ thống miễn dịch thể Sau vượt qua rào cản, HBV gặp phản ứng ngăn chặn hệ thống miễn dịch Một cách để lẩn trốn khỏi hệ miễn dịch nằm dạng cấu trúc HBV Bằng việc tạo thể có lớp vỏ kháng ngun bề mặt lại khơng có genome đẵ phần đánh lừa hệ thống miễn dịch Trong protein vỏ virus có protein M L hai loại protein có vai trị lớn việc giúp hạt virus cơng vào tế bào gan.Trong thực tế, chưa thể xác định rõ thụ thể màng tế bàogan điểm cơng HBV Theo giả thiết, có hai chế công vào tế bào gan công thông qua đoạn PreS1 đoạn PreS2 10 *Kháng nguyên bề mặt VRVGB ( HBsAg) HBsAg dấu ấn VRVGB xuất huyết bệnh nhân, khoảng 2-12 tuần sau nhiễm vi-rút khoảng 2-6 tuần trước có triệu chứng lâm sàng Sự diện HBsAg chứng giá trị nhiễm VRVGB dù có hay khơng có triệu chứng lâm sàng Trong viêm gan vi-rút B cấp HBsAg đạt đến nồng độ cao tương ứng với thời kỳ vàng da rõ lâm sàng sau giảm dần Có khoảng 5-10% trường hợp HBsAg biến sớm trước có triệu chứng lâm sàng HBsAg dương tính kéo dài từ 1-3 tháng trở âm tính sau Transaminase trở bình thường Nhiễm VRVGB mạn tính xác định HBsAg tồn tháng sau giai đoạn khởi phát VGVRB cấp.Thăm dò kỹ thuật ELISA hay RIA phát HBsAg nồng độ 0,1-0,5 ng/ml * Kháng thể kháng HBs (Anti-HBs) Anti-HBs kháng thể có khả trung hồ Đây dấu ấn huyết phản ánh tình trạng VG B khỏi bệnh (hay) miễn nhiễm VRVGB Anti-HBs tồn huyết thời gian dài Trong phần lớn trường hợp, Anti-HBs bắt đầu xuất HBsAg biến Thời điểm xuất Anti-HBs thay đổi, từ 1-10 tuần, có đến tháng sau HBsAg biến Phần lớn bệnh nhân có miễn dịch bảo vệ lâu dài VRVGB có Anti-HBs Sau tiêm chủng phòng VRVGB, Anti-HBs dấu ấn huyết diện huyết người tiêm chủng Anti-HBs phát kỹ thuật ELISA hay RIA *Kháng nguyên lõi vi-rút VG B (HBcAg) HBcAg kháng nguyên cấu trúc nhân nucleocapsid, phát nhân tế bào gan bị nhiễm VRVGB khơng có huyết HBcAg khơng có đoạn peptide tín hiệu khơng dược tiết khỏi tế bào gan * Kháng thể kháng HBc (Anti-HBc) Anti-HBc dấu ấn huyết quan trọng để chứng minh bệnh nhân bị nhiễm HBV Có loại Anti HBc : + Anti-HBc IgM: có nồng độ cao huyết bệnh nhân viêm gan B giai đoạn cấp, kéo dài vài tháng, sau nồng độ giảm dần hay biến giai đoạn mạn tính + Anti-HBc IgG: xuất sau tồn thời gian dài bệnh nhân viêm gan B mạn tính * Kháng nguyên HBe (HBeAg) HBeAg dấu ấn diện sớm huyết bệnh nhân 24 VGVRB cấp Nó xuất sau HBsAg vài ngày biến vi-rút ngừng nhân đôi HBeAg tổng hợp vượt trội giai đoạn vi-rút nhân lên, có liên quan đến diện virion hoàn chỉnh chứng tính lây nhiễm cao Điều đặc biệt có ý nghĩa phụ nữ mang thai Nếu họ có HBeAg(+) khả lây cho lên đến 80-90% HBeAg (-) khả lây cho có 10-20% mà Nếu HBeAg tồn kéo dài tuần bắt đầu có triệu chứng lâm sàng điểm sớm khả diễn biến sang giai đoạn mạn tính Người ta nhận thấy viêm gan cấp có HBeAg (+) bệnh thường diễn biến kéo dài nặng Trong trường hợp xảy đột biến tiền lõi (precore mutation), HBeAg không tổng hợp nhân đôi vi-rút diễn Điều chứng minh diện HBV DNA huyết bệnh nhân * Kháng thể kháng HBe (Anti-HBe) Sự chuyển huyết HBeAg (+) sang AntiHBe (+) xảy cách tự nhiên 10-15% năm hay thúc đẩy nhanh chóng nhờ thuốc kháng vi-rút ( Lamivudin, Interferon ) Tuy nhiên số trường hợp AntiHBe (+) HBeAg tái xuất trở lại đợt tái hoạt động VRVGB Ý nghĩa kết xét nghiệm HBsAg AntiIgMAntiHBc antiHBc HBs + + - + + + + + - + - - - + Chưa nhiễm HBV cần tiêm phòng Nhiễm HBv mãn tính Nhiễm HBV cấp Nhiễm HBv hồi phục, khơng cần chích ngừa Đã miễn dịch tự nhiên hay chích ngừa a) PHẢN ỨNG ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm.Để tiến hành ELISA cần phải có KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate) - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN gắn với kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần kiểm tra 25 - Phương pháp ELISA trực tiếp: thực qua số bước sau: (1) cố định kháng nguyên chưa biết vào giếng, (2) rửa để loại bỏ kháng nguyên không bám vào thành, (3) thêm kháng thể đặc hiệu có gắn enzyme thủy phân chất tạo màu, (4) rửa để loại bỏ kháng thể không bắt cặp, (5) thêm chất enzyme thủy phân đọc kết - Phương pháp ELISA gián tiếp: giống phương pháp ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp dùng để xác định kháng nguyên chưa biết kháng thể đặc hiệu với háng nguyên Phản ứng ELISA gián tiếp có bước: (1) gắn kháng nguyên cần xác địn vào giếng, (2) rửa để loại bỏ kháng ngun khơng đính vào thành giếng, (3) thêm kháng thể 1(là kháng thể kháng nguyên cần xác định), (4) rửa để loại bỏ kháng thể không bắt cặp, (5) Thêm kháng thể thứ cấp( kháng thể kháng thể 1) có gắn enzym phân hủy chất tạo màu, (6) rửa để loại bỏ kháng thể thứ cấp, (7) thêm chất en zym thủy phân, (8) rủa chất không bắt cặp đọc kết b) ELISA SANDWIC:độ đặc hiệu độ nhạy cao Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp khác kháng nguyên virus 26 có gắn Enzym thay kháng thể globlin người gắn enzym Như hình thành Sandwich phức hợp KN_KT_KN_Enzym Sự thay đổi làm tăng độ nhạy đặc hiệu phản ứng, cho cho phép phát tất lớp kháng thể khơng dùng Anti IgG người gắn Enzym (1) Cố định kháng nguyên ( kháng thể) cần xác đinh, (2) Thêm kháng thể (kháng nguyên) vào giếng, (3) Bổ sung Kháng nguyên( kháng thể) có gắn en zyme, (4) Thêm chất cho enzyme thủy phân tạo màu đọc kết 2.3) SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHUẨN ĐOÁN VIÊM GAN VIRUS Vào năm cuối kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử đời có tốc độ phát triển nhanh chóng mở kỷ nguyên chẩn đoán gen nên chẩn đốn vi rút viêm gan B mức độ phân tử (Đó xét nghiệm phân tích phân tử di truyền HBV DNA) Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch kinh điển phân tích DNA vi rút giúp có sở đánh giá tình trạng bệnh, khả diễn tiến bệnh, theo dõi điều trị bệnh lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp Cho đến thực số xét nghiệm sinh học phân tử HBV sau: 1) Xác định tình trạng tăng sinh vi rút trường hợp có đột biến vùng trước lõi (Pre Core) để từ có định điều trị đặc trị khơng Đó xét nghiệm HBVDNA, kỹ thuật thường dùng để xác định HBVDNA kỹ thuật PCR (Là kỹ thuật khuếch đại DNA đích, nhạy đặc hiệu, xử dụng phổ biến không Việt Nam mà giới) 2) Đếm số lượng vi rút B máu để theo dõi điều trị Nhờ xác định số lượng vi rút trước điều trị mà theo dõi số lượng vi 27 rút trình điều trị: Tăng giảm để có thay đổi điều trị kịp thời hiệu Hai kỹ thuật thường dùng để định lượng vi rút viêm gan B Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời gian thật) bDNA (Khuếch đại tín hiệu) 3) Xác định loại vi rút (Định kiểu gen vi rút HBV: HBV Genotype) 4) Phân tích trường hợp đột biến kháng thuốc để từ có sở lựa chọn loại thuốc điều trị thích hợp, đặc biệt đột biến kháng với Lamivudine (Là thuốc uống xử dụng rộng rãi cho điều trị HBV, nhiên có nhược điểm dễ bi đột biến kháng thuốc vi rút) Nhờ mà người bác sĩ tránh trường hợp dùng thuốc không hiệu quả, giảm tốn cho bệnh nhân 2.3.1) CÁC KỸ THUẬT a) Tinh khiết acid nucleic virus DNA RNA trích từ huyết than, huyết tương, bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi mơ Các phương pháp phải đảm bảo DNA có độ tinh cao để phục vụ cho việc phân tích b) Các đoạn dò Sử dụng đoạn mẫu dò đặc hiệu tổng hợp nhân tạo để xác định diện DNA RNA virus tế bào Ngày nay, vơi phát triển đại khoa học phát triển nhiều loại mẫu dò phương pháp tạo mẫu dị Có hai loại mẫu dị phổ biến là: mẫu dị phóng xạ mẫu dò phát huỳnh quang 2.3.2) CÁC XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN NHANH CÁC ĐOẠN ACID NUCLEIC 2.3.2.1) PCR Để thực kỹ thuật giải trình tự chuỗi, phải thực bước sau: (1) Thực PCR; (2) Thực phản ứng cắt; (3) Điện di phân tích kết a) THỰC HIỆN PCR Để khuếch đại gene HBV ta dùng kỹ thuật PCR Mục đích giai đoạn 28 khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có máu bệnh nhân: Từ phân tử ban đầu thành hàng tỷ DNA, từ thực giải trình tự chuỗi HBV Đây giai đoạn quan trọng, định cho thành công thực giải trình tự chuỗi Kỹ thuật gồm có bước chủ yếu sau (Theo thứ tự bước thực hiện): 1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu 2, Ly trích tinh DNA HBV 3, Khuếch đại DNA vi rút phản ứng PCR máy luân nhiệt 4, Kiểm tra & phát sản phẩm khuếch đại (Amplicon) gel Agarose Sau chi tiết ý nghĩa bước thực * Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu Yêu cầu mẫu máu: 1, Serum, plasma (tuyệt đối không dùng Heparin) 2, Tách serum plasma vòng sau lấy máu 3, Nếu chưa thực ly trích DNA mẫu phải lưu –20oC Nếu gửi mẫu phải giữ mẫu đá khô tốt 4, Tránh tượng phải rả đông mẫu máu nhiều lần 5, Máu tĩnh mạch, lấy lúc đói buổi sáng tốt 6, Dụng cụ lấy máu: Vô trùng, loại dùng lần, thao tác ngun tắc vơ trùng, có bao tay * Ly trích tinh DNA HBV Phương pháp ly trích chúng tơi chọn hấp thụ DNA lên hạt silica, rửa Ethenol 70% * Khuếch đại DNA virus phản ứng PCR máy luân nhiệt Áp dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng trùng hợp chuỗi) Đây kỹ thuật khuếch đại đoạn gen mà cần khuếch đại, sau khuếch đại có số lượng nhiều DNA để ứng dụng vào lĩnh vực mà ta quan tâm Một chu kỳ phản ứng PCR gồm có giai đoạn: (1) GIAI ĐOẠN BIẾN TÍNH: 29 Nhiệt độ ống mẫu tăng lên đến 94o C, nhiệt độ làm cho phân tử DNA biến tính tách làm đơi hồn tồn, tất hoạt động men dừng lại (Ví dụ hoạt động kéo dài chu kỳ trước) Mục đích giai đoạn làm cho phân tử DNA tách làm đôi duỗi thẳng hồn tồn, từ dễ dàng cho việc bắt cặp gắn Nu vào mạch đơn theo ngun tắc bổ sung Hình minh họa giai đoạn biến tính: (2) GIAI ĐOẠN BẮT CẶP: Các Primer (Các đoạn mồi) có gắn Biotin đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn ống mẫu bắt cặp vào chuỗi đơn DNA sau biến tính theo nguyên tắc bổ sung Sự bắt cặp có ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại đặc hiệu theo chiều dài đoạn gen khuếch đại Ví dụ ta cần khuếch đại đoạn gene HBV primer cho HBV bắt cặp với gen HBV có ống mẫu, cịn gen lồi khác không bắt cặp (Đồng nghĩa với việc không khuếch đại được) Hình minh họa giai đoạn bắt cặp (3) GIAI ĐOẠN KÉO DÀI: Sau primer bắt cặp đặc hiệu với mạch đơn DNA, nhờ tác dụng men Taq polymerase điều kiện thích hợp gắn Nu có sẵn ống nghiệm vào primer theo nguyên tắc bổ sung, từ làm cho đoạn mồi dài hình thành nên mạch đơn bổ sung với mạch đơn cũ Và DNA hình thành Như vậy, sau giai đoạn ta có hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt phân tử DNA ban đầu Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp kéo dài thuộc chu kỳ khuếch đại DNA Như vậy, sau chu kỳ khuếch đại từ phân tử DNA ban đầu 30 thành phân tử DNA giống hệt nhau, sau 30 chu kỳ khuếch đại có khoảng 230 phân tử DNA giống hệt (Khoảng tỷ DNA) Như số lượng DNA mẫu vài triệu sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian khoảng 2-3 giờ) ta có hàng nghìn tỷ sao, lượng DNA đủ để ta làm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi Hình minh họa giai đoạn kéo dài b) Kiểm tra & phát sản phẩm khuếch đại (Amplicon) gel Agarose Sau thực phản ứng PCR, ta điện di gel agarose 2%, mục đích chủ yếu bước xem có sản phẩm PCR khơng đánh giá kích thước sản phẩm khuếch đại có đoạn dài ta biết (Có nghĩa có bắt cặp primer chiều dài amplicon cho HBV) 2.3.2.2) CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ a) Cơ sở lai phân tử - Nhiệt độ nóng chảy DNA Tm:Phân tử DNA sợi kép đun lên qua điểm Tm tách thành sợi đơn - Cơ sở lai axit nucleic: Hai sợi đơn axit nucleic có trình tự bổ sung trộn với loại dung môi, đặt nhiệt độ thích hợp liên kết đặc hiệu Nhiệt độ lai thường < nhiệt độ nóng chảy mẫu dị 2OC (Tmprobe) - Hai phân tử tương tác đặc hiệu tạo thành phân tử lai nhờ tín hiệu để phát + Lai DNA – DNA + Lai DNA – RNA + Lai RNA – RNA - Lai pha lỏng : Các trình tự bổ sung nằm môi trường lỏng Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ - Lai pha rắn: Nguyên tắc: Lai pha rắn có nguyên tắc với lai 31 pha lỏng Điểm khác biệt trình tự cần tìm cố định giá thể rắn Giá thể rắn dùng để cố định axit nucleic màng lai, có loại màng lai: + Màng lai nitrocellulose (độ bền học nên khó thao tác) + Màng lai nylon (có độ bền học cao, cho phép lai nhiều lần) b) Các phương pháp lai - Lai Southern blot phương pháp lai phân tử đoạn ADN mẫu dị (probe) đánh dấu đồng vị phóng xạ chất phát huỳnh quang với phân tử ADN cần phát theo nguyên tắc liên kết bổ sung A-T/G-C Với công nghệ tiên tiến ngày nay, nhf khoa học tách , tinh chế xác định trình tự DNA HBV Từ thiết kế mẫu dò đặc hiệu phương pháp lai Southern xác định diện DNA HBV nhờ vào bắt cặp bổ sung DNA HBV DNA mẫu dị Q trình lai southern phân tích có mặt DNA HBV đoạn DNA mẫu dò - Phương pháp lai northern: phương pháp lai ARN với ADN mẫu dò ARN tách, làm biến tính trước phân tách gel agarose có chứa chất làm biến tính khơng cho RNA liên kết trở lại cấu trúc bậc ARN 32 chuyển lên màng lai ARN cố định mang lai đem lai với DNA mẫu dị có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quanh Các phân tử lai phát kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay huynh quang Bằng việc xác định có mặt sản phẩm RNA phiên mã từ DNA HBV xác định có mặt virus HBV thể Quá trình lai Northern phát sản phẩm RNA trình phiên mã từ DNA HBV 3) MỘT SỐ LOẠI THUỐC DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN B MẠN 33 Người bị viêm gan B cần thiết nghỉ ngơi hợp lý, uống thuốc chống virus lamivudine, interferon adefovir thuốc chống virus khác Một số người cần nhập viện triệu chứng nơn ói nghiêm trọng khiến khơng ăn uống Nếu điều trị cách, đa số trường hợp viêm gan B khống chế • Liệu pháp kháng virus không khuyến cáo giai đoạn bệnh nhân có triệu chứng • Mục đích trực tiếp liệu pháp kháng virus làm giảm sinh sản (ức chế HBeAg HBV DNA máu) cải thiện chức gan (ALT AST bình thường) Do đó, ngăn ngừa tổn thương sẹo hóa mơ gan, làm ngừng tiến trình đến xơ gan ung thư gan a)Interferon - Interferon alpha chất tự nhiên có thể người, sản xuất số tế bào thể nhiễm virut Chức Interferon α diệt trừ tác nhân gây bệnh Interferon α có tác dụng việc ngăn chặn chép HBV Như vậy, dùng Interferon, siêu vi B bị loại bỏ giống chế đào thải tự nhiên thể - Interferon alpha đóng sẵn bơm tiêm có kèm kim nhỏ, tiêm da bắp thịt Khi bắt đầu điều trị, hầu hết bệnh nhân có cảm giác sốt nhẹ, mệt mỏi vài gọi hội chứng giả cúm Những biểu Interferon khởi động đáp ứng thể chống lại siêu vi Về sau, tác dụng phụ bớt dần Uống Paracetamol nửa tiếng trước tiêm thuốc hạn chế biểu Nên tiêm thuốc vào buổi tối để hơm sau Bạn làm việc bình thường - Trong thời gian điều trị, Bạn nên làm xét nghiệm máu để đánh giá đáp ứng Sau kết thúc điều trị, cần tiếp tục theo dõi thêm tháng nữa, số bệnh nhân bị tái phát sau ngưng thuốc b) Pegylated interferon alfa ( peg IFN-α ) - Từ nhiều năm qua, interferon α cột mốc đáng ý điều trị viêm gan siêu vi B C Tuy nhiên, số vấn đề thân interferon mà lợi ích sử dụng bị giới hạn Những vấn đề bắt nguồn từ chất interferon α Giống nhiều loại protein lạ khác, interferon α nhanh chóng bị giáng hóa sau tiêm vào thể Hậu interferon α tồn hệ tuần hoàn thời gian ngắn, cần tiêm vài lần tuần nhằm trì nồng độ hiệu dụng thuốc Cách dùng thuốc tạo nồng độ interferon α máu cao sau tiêm - gắn liền với tăng tác dụng phụ mức nồng độ thấp khoảng thời gian lần tiêm - gắn liền với hiệu điều trị bị giảm sút 34 - PEG INF α hợp chất tạo cách gắn phân tử PEG(Poly Ethylen Glycol-là polymer trơ, hòa tan nước, khơng gây độc ) với IFNα PEG-hóa có tiềm cải thiện dược động học dược lực học interferon alfa, nhờ tránh vấn đề nồng độ thuốc không ổn định máu, đồng thời tránh phác đồ điều trị bất tiện dùng loại interferon alfa theo thông thường Đặc biệt PEG hóa khơng làm ảnh hưởng tới hoạt tính trị liệu IFN α, hiệu trị liệu PEG IFN α tương tự tot so với IFN α chuẩn c) Lamuvidine ( Epivir-HBV,3TC) - Lamuvidine đồng phân quang học 2’-3’dideoxy-3’thiacytidine Sự kết hợp gốc triphosphat hoạt động (3TC-TP) vào trình nhân lên chuỗi DNA gây ức chế trình tổng hợp DNA HBV Kết dùng lamuvidine làm gián đoạn tạo thành chuỗi DNA kết thúc sớm trình tổng hợp d) Adefovir Dipivoxil - Adefovir Dpivoxil thuốc dạng đường uống Adefovir, chất tương tự nucleoside AMP- Adenosine MonoPhosphate Nó ức chế enzyme transcriptase, ngăn khơng cho DNA pol gắn vào DNA HBV gây gián đoạn trình tổng hợp Các thử nghiệm cho thấy Adefovir có tác dụng ngăn cản HBV tự nhiên chủng kháng lại Lamuvidine e) Entecavir - Entecavir cacbocylic có cấu trúc tương tụ 2’-deoxyguanosine Entecavir có tác dụng ngăn chặn chép HBV giai đoạn khác nhau: (1) trình tạo DNA polymerase HBV, (2) trình ssao chép ngược tạo sợi DNA – từ RNA tiền genome, (3) tổng hợp sợi DNA+ virus IV/ CÁCH PHÒNG TRÁNH VIÊM GAN B 35 1) Các đường lây nhiễm bệnh viêm gan B cách phòng bệnh 1.1) Con đường lây bệnh -Lây truyền qua đường máu: hay gặp truyền máu chế phẩm máu bị nhiễm virus viêm gan B, dùng kim tiêm chun mà chưa khử trùng theo tiêu chuẩn -Lây truyền qua quan hệ tình dục -Lây truyền từ mẹ sang con: bệnh viêm gan B lây truyền từ mẹ sang chủ yếu Khi phụ nữ mang thai bị nhiễm virut viêm gan B truyền sang bào thai Trong giai đoạn tháng đầu thai kỳ tỷ lệ lây nhiễm từ mẹ sang 1%, mẹ bị bệnh tháng thai kỳ tỷ lệ lây nhiễm sang 10% tăng cao tỷ lệ lây nhiễm sang tới 60% -70% mẹ bị mắc bệnh tháng cuối thai kỳ Nguy truyền bệnh cho thai nhi lên tới 90% khơng có biện pháp bảo vệ sau sinh, 50% số trẻ bị viêm gan mạn tính có nguy bị xơ gan lúc trưởng thành 1.2) Các cách phòng bệnh 1.2.1) Những biện pháp phòng bệnh không đặc hiệu Các biện pháp vệ sinh - Tránh tiếp xúc trực tiếp với máu dịch tiết từ người nhiễm bệnh: Không dùng chung chén bát, đũa, ly,…với người bệnh - Áp dụng phương pháp quan hệ tình dục an toàn, sử dụng bao cao su tốt - Không sử dụng chung kim tiêm vật dụng cá nhân khác - Sử dụng găng tay tiếp xúc với máu người bệnh 1.2.2) Những biện pháp phòng bệnh đặc hiệu - Globulin miễn dịch kháng HBV: Tiêm bắp liều 0,08ml/kg cho người có nguy lây nhiễm VRVGB, liều 0,3 ml/kg cho trẻ sơ sinh có mẹ mang HBsAg - Tiêm vắc-xin phịng viêm gan: Có thể nói cách phịng tránh viêm gan B có hiệu Tuy nhiên, sau tiêm vaccin, để đánh giá hiệu bảo vệ chúng cần làm xét nghiệm anti-HBsAg để phát kháng thể chống virus hình thành * Những cần chích ngừa vaccine viêm gan siêu vi B + Tất trẻ sơ sinh, trẻ em + Các nhân viên y tế 36 + Những người có quan hệ tình dục khơng an tồn + Những người nghiện chích ma túy + Những người sống chung nhà với người bị nhiễm siêu vi B + Những người du lịch tới vùng có tỷ lệ nhiễm siêu vi B cao + Bệnh nhân chạy thận nhân tạo + Bệnh nhân bị rối loạn đông máu, cần truyền yếu tố đông máu Hiện ché tạo nhiều lọai vaccine có khẳ kháng virus viêm gan B có hiệu cao như: + Vắc-xin chế tạo từ huyết tương người nhiễm vi-rút: Các vắc– xin có chứa 10-20µg HBsAg bất hoạt với chất bảo quản tá chất phèn nhôm thiomerosal Loại vắc-xin chứng minh gây miễn dịch bảo vệ an toàn hiệu Tuy nhiên, vào cuối thập niên 90 vắc-xin có nguồn gốc huyết tương khơng cịn ưa chuộng người ta sợ lây truyền HIV qua vắc-xin Các vắc –xin thay vắc-xin làm từ chất liệu tái tổ hợp khác + Vắc-xin viêm gan B tái tổ hợp ADN Vắc-xin viêm gan B tổng hợp chuỗi polypeptide: Gen mã hoá HBsAg đặt vào plasmid mang loài nấm Saccharomyces Protein sản xuất sau làm tinh khiết, hấp phụ vào tá chất phèn nhôm cho vào dung dịch bảo quản thimerosal Pritein có kích thước chừng 24 kDa, nhỏ HBsAg tự nhiên thiếu chuỗi đường cạnh bên Vắc-xin tái tổ hợp chứng minh hiệu bảo vệ chống lại nhiễm VRVGB Hai vắc-xin có nguồn gốc từ nấm sử dụng nhiều Engerix-B Recombivax HB Vắc-xin tiêm lần, cách tháng mũi cách mũi năm tháng tiêm nhắc lại sau năm Các thử nghiệm hiệu bảo vệ nhóm nguy cao chứng minh giá trị tính an tồn vắc-xin phịng VGB Các phản ứng chổ báo cáo sau tiêm chủng Chỉ có 20% trường hợp tiêm vắc-xin có ghi nhận sưng nhẹ đỏ chổ tiêm chủng sốt nhẹ sau tiêm KẾT LUẬN 37 1.Đã phát chủng virus gây bệnh, tìm cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng virus gây bệnh viêm gan B 2.Qua nhiều năm nghiên cứu tìm cấu trúc, cấu tạo, tính chất, chức năng, chế hoạt động độc tố virus gây bệnh vật chủ 3.Nhận biết triệu chứng bệnh lý bản, dấu hiệu nhận biết bên mắt qua xét nghiệm phát bệnh xác 4.Có phương pháp tách chiết để làm thí nghiệm phát bệnh cách nhanh chóng giúp ích cho việc chữa bệnh nhanh chóng 5.Sau hiểu rõ nguyên gây bênh, hướng gây bệnh virus, tìm hướng điều trị bệnh hiệu đồng thời tìm cách phịng tránh bệnh để đảm bảo sức khỏe tốt khả người 6.Đang tiếp tục nghiên cứu để tìm thuốc đặc hiệu chữa trị bệnh cho bênh nhân bước vào gai đoạn cuối 38 ...Từ ? ?b? ??nh viêm gan? ?? có nghĩa “tình trạng sưng viêm gan " B? ??nh viêm gan B bệnh viêm gan nghiêm trọng thường gặp thường gặp giới siêu vi viêm gan B (HBV) gây (siêu vi cơng gan) B? ??nh viêm gan B cấp... chứng hậu viêm gan virus B a) Viêm gan mạn Viêm gan mạn hậu di chứng b? ??nh nhân b? ?? mắc viêm gan virus cấp Có tỷ lệ định b? ??nh nhân nhiễm viêm gan virus cấp chuyển thành dạng viêm gan B mãn tính... Sau đó, b? ?ng phát nhiều Viêm gan B bệnh truyền nhiễm viêm gan gây siêu viêm gan B (HBV) có ảnh hưởng đến hominoidea , bao gồm người Ban đầu gọi "viêm gan huyết thanh", b? ??nh gây dịch b? ??nh phận