LỜI CẢM ƠN Từ lòng biết ơn sâu sắc mình, em xin dành trang khóa luận để bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa Chế Biến toàn thể quý thầy giảng dạy tận tình giúp đỡ em trình học tập trường PGS.TS Lê Văn Hiệp - Viện trưởng Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang, người thầy quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập Viện CN Nguyễn Thị Minh Hiền - trưởng phòng, TS Nguyễn Thị Lan Phương phó phịng Kiểm Định, CN Trần Ngọc Nhơn, TS Đỗ Minh Sĩ trực tiếp hướng dẫn, bảo nhiệt tình, chu đáo ln tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tồn thể cơ, anh chị phịng Kiểm Định, phịng Nghiên cứu phát triển nhiệt tình giúp đỡ, góp ý động viên em thời gian thực tập phòng Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Vắc xin Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập Viện Xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, tất bạn bè, anh chị em quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em suốt thời gian qua Nha Trang, tháng 11 năm Sinh viên CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN  APS : Amonium persulfat CV : Hệ số biến thiên DĐ : Dược điển DĐVN : Dược điển Việt Nam ELISA : Enzyme - linked immuno sorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch gắn men) FCA : Tá chất Freund Complete FIA : Tá chất Freund Incomplete HA : Haemagglutin IgG : Immuno globulin G IU : International Unit (Đơn vị quốc tế) KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LOD : Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of quantification (Giới hạn định lượng) NA : Neuraminidase OD : Optical density (Mật độ quang) PBS : Photphat buffer saline (Dung dịch đệm muối Photphat) SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulphate – Poly acrylamide gel Electrophoresis (Điện di gel Poly acrylamide có Sodium dodecyl sulphate) Streptavidine – PO : Streptavidine – Peroxydase RIA : Radial immuno assay (Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ) RNA : Ribonucleic Acide (Axit Ribonucleic) TMB : 3,3’,5,5’ – TetraMethyl Benzidine TEMED : N,N,N’,N’- TetraMethylethylendiamin WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới -TCYTTG) MỤC LỤC  TRANG BÌA PHỤ LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Rửa bảo quản cột Hệ số phân tán (CV%) mẫu thử với nồng độ khác lần thử nghiệm khác đạt 9,37% Đây hệ số thấp chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại độ ổn định cao lần thử nghiệm Thêm vào đó, tỉ lệ phục hồi đạt 95,42% cho thấy độ lần thử nghiệm cao Điều cho thấy, phương pháp không cho độ lặp lại độ ổn định cao mà cho độ cao 54 3.4.4 So sánh với phương pháp điện di miễn dịch đối lưu 54 3.5 ỨNG DỤNG HỆ ELISA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG  Rửa bảo quản cột Hệ số phân tán (CV%) mẫu thử với nồng độ khác lần thử nghiệm khác đạt 9,37% Đây hệ số thấp chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại độ ổn định cao lần thử nghiệm Thêm vào đó, tỉ lệ phục hồi đạt 95,42% cho thấy độ lần thử nghiệm cao Điều cho thấy, phương pháp không cho độ lặp lại độ ổn định cao mà cho độ cao 54 3.4.4 So sánh với phương pháp điện di miễn dịch đối lưu 54 3.5 ỨNG DỤNG HỆ ELISA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 55 DANH MỤC CÁC HÌNH  Rửa bảo quản cột Hệ số phân tán (CV%) mẫu thử với nồng độ khác lần thử nghiệm khác đạt 9,37% Đây hệ số thấp chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại độ ổn định cao lần thử nghiệm Thêm vào đó, tỉ lệ phục hồi đạt 95,42% cho thấy độ lần thử nghiệm cao Điều cho thấy, phương pháp không cho độ lặp lại độ ổn định cao mà cho độ cao 54 3.4.4 So sánh với phương pháp điện di miễn dịch đối lưu 54 3.5 ỨNG DỤNG HỆ ELISA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 55 -1- LỜI NÓI ĐẦU Bệnh cúm A/H5N1 xem bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm với lây lan nhanh tỷ lệ tử vong cao Mới xuất từ cuối năm 2003 số nước châu Á, đến dịch cúm A/H5N1 lan rộng nhiều quốc gia giới với 229 người nhiễm bệnh, 131 người tử vong chiếm tỷ lệ 58% [6] Các trường hợp nhiễm virus cúm phát xảy lây nhiễm người với loài gia cầm Thế nhưng, chuyên gia giới khẳng định, việc virus cúm A lây nhiễm từ người sang người vấn đề thời gian Trước nguy bùng phát đại dịch, nước, tổ chức giới phải vào để nhanh chóng tìm phương thức phịng bệnh hiệu Vacxin coi phương thức hữu hiệu việc phòng chống, giảm tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết đại dịch gây Công nghệ sản xuất vacxin cúm “thơng thường” có từ 60 năm trước nước châu Âu Bắc Mỹ số lượng mức giá cao [3] nên khơng thể đáp ứng đủ cho giới có đại dịch xảy ra, đặc biệt với nước nghèo, nước phát triển lại khó khăn Tổ chức Y tế giới (TCYTTG) khuyến cáo nước nên tự nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 để chủ động cơng tác phịng chống dịch, bảo vệ sức khoẻ cộng đồng [3] Cùng với việc tạo chủng sản xuất vacxin cúm A/H5N1 thích hợp kỹ thuật di truyền ngược, trung tâm nghiên cứu bệnh cúm quốc tế đưa hướng sản xuất vacxin cúm khác (sản xuất trứng gà có phơi, tế bào động vật…) Trên sở đó, tuỳ thuộc vào điều kiện quốc gia mà lựa chọn đường sản xuất cho phù hợp phải đảm bảo tính an tồn hiệu cao Tại Việt Nam, viện Vắc xin sinh phẩm y tế Nha Trang nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người phương pháp nuôi cấy trứng gà có phơi Viện sản xuất thử loạt vacxin thành công Trước đưa vào sử dụng, vacxin cúm phải đạt tiêu chuẩn an toàn, miễn dịch cần thiết theo quy định -2- Bộ Y tế Việt Nam TCYTTG Một số tiêu chuẩn hàm lượng ovalbumin, protein lịng trắng trứng, thành phần có khả gây dị ứng cao Theo tiêu chuẩn TCYTTG, lượng ovalbumin liều vacxin cúm A/H5N1 sản xuất từ trứng gà có phơi khơng vượt q µg [10] Chính thế, việc tìm phương pháp xác định hàm lượng ovalbumin với độ nhạy độ xác cao điều tiên Có nhiều phương pháp khác để định lượng ovalbumin như: ELISA, điện di miễn dịch…Tuy nhiên, nghiên cứu trước cho thấy, phương pháp ELISA phương pháp cho độ đặc hiệu độ xác cao, có khả phát ovalbumin mức độ nanogam (ng) [10-13] Các kít ELISA dùng để xác định hàm lượng ovalbumin đắt tiền không phù hợp tiến hành kiểm định trình sản xuất Chính vậy, với điều kiện trang thiết bị có, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “ NGHIÊN C ỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” Mục tiêu đề tài: Sản xuất khảng thể thỏ kháng ovalbumin Tinh chế kháng thể (IgG) kháng ovalbumin Ứng dụng kháng thể kháng ovalbumin tinh chế định lượng ovalbumin mẫu vacxin cúm A/H5N1 phương pháp ELISA phương pháp điện di miễn dịch đối lưu -3- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU -4- 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 [3], [6] Cúm gà hay cúm gia cầm virus cúm typ A gây nên Chúng thường gây bệnh loài gia cầm lây nhiễm sang số lồi động vật có vú Cúm gia cầm lây lan nhanh khó kiểm sốt Chúng thường lây nhiễm nhanh lồi lơng vũ gây chết diện rộng Năm 1996, virus cúm A/H5N1 lần phân lập ngỗng tỉnh Giang Đông, Trung Quốc Sau tiếp tục lan rộng nhiều nước châu Á số nước châu Âu Từ năm 2003, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát mạnh Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản sau lan khắp châu Á Thái Lan Việt Nam hai quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề Không gây bệnh gia cầm, virus cúm A/H5N1 mối đe dọa cho sức khỏe người Theo thống kê TCYTTG, tính đến ngày 04/07/2006 có 229 người bị nhiễm cúm A/H5N1 10 quốc gia có 131 người tử vong chiếm tỷ lệ 58% [6] Việt Nam nước có số người nhiễm cúm A/H5N1 cao Tính đến tháng 6/2007, 32 tỉnh thành nước có 98 người bị mắc bệnh, có 42 người bị chết [3] Từ năm 2003 đến nay, tình hình lây nhiễm virus cúm A/H5N1 diễn biến phức tạp Không gây bệnh gia cầm, cịn gây nhiễm sang số động vật khác hổ (Thái Lan), mèo (Thái Lan, Indonesia, Iraq, Đức), lợn (Indonesia, Việt Nam), chồn (biển Baltic, Đức) Số người nhiễm H5N1 gia tăng không ngừng số lượng lẫn phạm vi ảnh hưởng Mặc dù trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 người suốt mùa dịch vừa qua cho thấy, nhiễm virus xảy có tiếp xúc chặt chẽ người với loài gia cầm bệnh Tuy nhiên, viễn cảnh xuất chủng virus cúm có khả lây từ người sang người điều tiên liệu TCYTTG đưa cảnh báo đại dịch cúm đến gần nhiều khả biến chủng virus cúm gia cầm H5N1 Vì vậy, cơng tác phịng chống dịch diễn nhiều nước giới Hiện nay, giải pháp nhiều nước giới thực sản xuất vacxin phòng cúm cho người -5- 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN CÚM A/H5N1 HIỆN NAY [1], [3], [6] Trước nguy đại dịch cúm đến gần, công tác phòng chống dịch diễn khẩn trương nhiều nước giới Để phòng chống đại dịch việc sử dụng vacxin phương thức hữu hiệu để bảo vệ cộng đồng, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết Tình hình giới: TCYTTG tổ chức Nông lương giới khuyến cáo tất nước, đặc biệt nước phát triển phải tự nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 để chủ động nguồn vacxin phục vụ cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng đại dịch xảy TCYTTG đưa ba loại vacxin cúm sau cho nước lựa chọn sản xuất: Vacxin bất hoạt trứng gà có phơi ni cấy tế bào; vacxin sống trứng gà có phơi ni cấy tế bào; vacxin sống dạng phun mù, hít qua mũi [3] Hiện nay, giới có nhiều nước nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 chưa có nước cấp giấy phép lưu hành Nhiều hãng sản xuất vacxin lớn hãng Sanofi Pasteur (Mỹ, Pháp), hai hãng Nobilon, Sovay Pharmaceutials Hà Lan vv nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 phương pháp nuôi cấy trứng gà có phơi ni cấy dịng tế bào (như tế bào Vero, MDCK v.v ) Tình hình Việt Nam: Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên dễ cho dịch cúm bùng phát lây lan diện rộng Ngoài ra, đàn gia cầm với số lượng lớn yếu tố ảnh hưởng lớn đến việc bùng nổ dịch cúm Trước nguy đại dịch cúm đến gần, vấn đề cân nhắc lựa chọn dây chuyền sản xuất vacxin cúm cho phù hợp với tình hình thực tế đất nước mà đảm bảo chất lượng mối quan tâm hàng đầu nước ta Vấn đề trở nên gấp rút dịch cúm ngày tiến gần Trước tình hình đó, vào ưu nhược - 53 - Độ quy trình phân tích mức độ sát gần giá trị tìm thấy với giá trị thực áp dụng quy trình đề xuất mẫu thử làm đồng điều kiện xác định Độ thường biểu thị tỷ lệ phục hồi % giá trị tìm thấy so với giá trị thêm vào mẫu thử phương pháp đề xuất, tính theo cơng thức [16]: M x100% MO Trong đó: M giá trị đo Mo giá trị thực (nồng độ mẫu biết trước nồng độ) Độ phục hồi cao phương pháp có độ cao Để xác định tỷ lệ phục hồi độ lặp lại lần thí nghiệm độc lập, mẫu với nồng độ biết trước lựa chọn ngẫu nhiên (30 µg/ml, 15 µg/ml, 12,5 µg/ml, 10 µg/ml, µg/ml, µg/ml, µg/ml) Tiến hành phản ứng ELISA, độ biến thiên (CV%) tỷ lệ phục hồi tính sau lần thí nghiệm độc lập (bảng 3.7) Bảng 3.7 Độ xác độ phản ứng Nồng độ lý thuyết Kết ELISA mẫu Nồng độ trung “spiked” (μg/ml) bình (μg/ml) 30 27,96 CV (%) (%) SD 1,64 Tỉ lệ phục hồi 5,87 93,21 - 54 - 15 14,74 0,40 2,72 98,24 12,5 13,75 1,18 8,57 110,00 10 9,68 1,22 1,64 96,77 7,45 1,22 1,31 93,13 4,85 0,38 7,85 96,93 0,80 0,09 1,60 79,67 9,37 95,42 Trung bình Hệ số phân tán (CV%) mẫu thử với nồng độ khác lần thử nghiệm khác đạt 9,37% Đây hệ số thấp chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại độ ổn định cao lần thử nghiệm Thêm vào đó, tỉ lệ phục hồi đạt 95,42% cho thấy độ lần thử nghiệm cao Điều cho thấy, phương pháp không cho độ lặp lại độ ổn định cao mà cho độ cao Như vậy, phương pháp ELISA xây dựng nghiên cứu có độ xác cao (độ lặp lại phản ứng đạt 7,88% độ lặp lại sau lần thí nghiệm độc lập đạt 9,37%), độ cao (tỉ lệ phục hồi đạt 95,42%) 3.4.4 So sánh với phương pháp điện di miễn dịch đối lưu Để so sánh đối chiếu với phương pháp miễn dịch khác độ nhạy việc định lượng ovalbumin, phương pháp điện di miễn dịch đối lưu sử dụng Kháng thể sử dụng kháng thể kháng ovalbumin từ huyết thỏ kháng ovalbumin tinh chế theo qui trình miêu tả mẫu ovalbumin chuẩn với nồng độ khác Với nồng độ kháng nguyên ovalbumin 50 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml, µg/ml đặt giếng phía cực âm huyết thỏ kháng ovalbumin tinh chế đặt giếng phía cực dương Kết hình 3.7 cho thấy, xuất cung ngưng kết KN-KT nồng độ ovalbumin từ 10ữ50 àg/ml nng ovalbumin l àg/ml - 55 - không thấy xuất cung ngưng kết Điều cho thấy, phương pháp điện di miễn dịch đối lưu phát ovalbumin với nồng độ thấp 10 μg/ml Hình 3.7 Tiêu nhuộm Coomassie phương pháp điện di đối lưu định lượng ovalbumin Như vậy, với thời gian thực ngắn (1 ngày, đêm), thực lúc lượng mẫu lớn, độ lập lại, độ nhạy 30 ng/ml (bảng 3.4), độ xác cao (CV 95%, bảng 3.7), phương pháp ELISA xây dựng nghiên cứu phương pháp có ưu vượt trội việc định lượng ovalbumin 3.5 ỨNG DỤNG HỆ ELISA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 Sau tối ưu hoá thông số phương pháp ELISA, mẫu ovalbumin (trong vacxin cúm ovalbumin thơ sản xuất từ lịng trắng trứng) sử dụng để thẩm định phương pháp Mỗi mẫu ovalbumin đo lần để xác định độ lập lại (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Kết ELISA định lượng mẫu ovalbumin Mẫu ovalbumin Nồng độ ovalbumin xác định ELISA CV (%) - 56 - Dịch niệu nệm trứng gà có phơi < 30 ng/ml 7,87 < 30 ng/ml 8,12 Dịch virus sau lọc thô < 30 ng/ml 7,69 Vacxin cúm bán thành phẩm lô < 30 ng/ml 6,89 Vacxin cúm bán thành phẩm lô < 30 ng/ml 13,6 Vacxin cúm bán thành phẩm lô < 30 ng/ml 12,5 Lòng trắng trứng μg/ml 9,83 khơng nhiễm virus Dịch niệu nệm trứng gà có phôi không nhiễm virus lô Theo kết bảng 3.8 cho thấy: Nồng độ ovalbumin lòng trắng trứng cao (3 μg/ml) ovalbumin thành phần lịng trắng trứng Tuy nhiên, ovalbumin dịch niệu nệm (niệu nang) (