LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận giúp đỡ tận tình Thầy cô, anh chị, bạn đồng nghiệp người thân gia đình Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng đặc biệt biết ơn sâu sắc tới: PGS TS Phạm Thị Minh Huệ PGS TS Nguyễn Minh Chính Những người Thầy tận tình trang bị cho kiến thức quý báu chuyên môn, nghề nghiệp nghiên cứu khoa học Các Thầy bên tôi, động viên tôi, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, phịng Sau đại học, Thầy Cơ Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lý - Học viện Quân Y tạo điều kiện thuận lợi cho trinh học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội, sở Y tế Hà Nội, anh/chị đồng nghiệp, người thân gia đình bạn bè ln động viên giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận án Ngày tháng năm 2017 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Ký hiệu viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Đại cương doxorubicin 1.1.1 Đặc điểm hóa lý 1.1.2 Độ ổn định 1.1.3 Cơ chế tác dụng 1.1.4 Các dạng bào chế doxorubicin 1.1.5 Dược động học 1.1.6 Chỉ định 1.1.7 Độc tính 10 1.1.8 Liều lượng 11 1.2 Đại cương liposome doxorubcin 12 1.2.1 Khái niệm 12 1.2.2 Phân loại liposome 13 1.2.3 Ưu, nhược điểm liposome 15 1.2.4 Nguyên liệu bào chế liposome 16 1.2.5 Phương pháp bào chế liposome .18 1.2.6 Đánh giá liposome 21 1.3 Các nghiên cứu liposome doxorubicin 25 1.3.1 Nghiên cứu bào chế 25 1.3.2 Đánh giá tác dụng invivo 33 Chương 38 NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ,ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.1 Nguyên vật liệu .38 2.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 39 2.3 Đối tượng nghiên cứu .40 2.4 Phương pháp nghiên cứu .40 2.4.1 Phương pháp bào chế .40 2.4.2 Phương pháp đánh giá đặc tính liposome doxorubicin 45 2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 51 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng liposome doxorubicin khối u động vật 51 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 55 2.6 Điều kiện thí nghiệm .55 2.7 Địa điểm nghiên cứu .55 Chương 56 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin 56 3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 56 3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 59 3.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 63 3.2.1 Bố trí thí nghiệm 63 3.3 Xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin 74 3.3.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất 74 3.4 Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 90 3.5 Đề xuất tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin .93 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn 94 3.5.2 Đánh giá độ ổn định 95 3.6 Đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u động vật thực nghiệm 100 3.6.1 Đánh giá chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180 100 3.6.2 Đánh giá tác dụng khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt tuyến 106 Chương 109 BÀN LUẬN .109 4.1 Phương pháp bào chế liposome 109 4.1.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất .109 4.1.2 Giảm đồng kích thước liposome 110 4.1.3 Đưa dược chất vào liposome 113 4.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 117 4.2.1 Tỷ lệ lipid 117 4.2.2 Tỷ lệ lipid/ doxorubicin 118 4.3 Phương pháp đánh giá liposome 121 4.3.1 Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất 121 4.3.2 Phương pháp đánh giá phân bố kích thước tiểu phân 122 4.3.3 Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc 122 4.3.4 Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome 123 4.3.5 Độ ổn định liposome .124 4.3.6 Về đánh giá tác dụng khối u 125 KẾT LUẬN 129 ĐỀ XUẤT 130 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 PHỤ LỤC 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt ADN Từ/cụm từ đầy đủ Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BP Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh) CHF Congestive heart failure (Suy tim sung huyết ) CHL Cholesterol CS Cộng DC Dược chất TT Viết tắt ĐCSH Từ/cụm từ đầy đủ Đối chứng sinh học ĐCUT Đối chứng ung thư 10 DĐVN Dược điển Việt Nam 11 DOPE Dioleoylphosphatidyl ethanolamin 12 DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid 13 DOX Doxorubicin hydroclorid 14 DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin 15 DPPE 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin 16 DPPS 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin 17 DSPA 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid 18 DSPC Distearoyl phosphatidylcholin 19 DSPE Distearoyl phosphatidylethanolamin 20 DSPE–PEG Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol 21 DSPG Distearoyl Phosphatidyl glycerol 22 EPC Egg-derived phosphatidylcholin 23 EPG Egg-derived phosphatidylglycerol 24 EurPh European Pharmacopoeia ( Dược điển Châu Âu) 25 FDA Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực Phẩm Dược Phẩm Hoa Kỳ) 26 HEPES N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 27 HER2 /neu Human Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì) 28 HPC Hydrogenated phosphatidylcholin 29 HPI Hydrogenated phosphatidylinositol 30 HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) TT 31 Viết tắt KHV Từ/cụm từ đầy đủ Kính hiển vi 32 KTTP Kích thước tiểu phân 33 LUV Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn) 34 LVEF Left ventricular ejection fraction (Thể tích tống máu thất trái) 35 MLV Multilamellar vesicle (Liposome nhiều lớp đồng trục ) 36 MVV Multivesicular (Liposome kép ) 37 NĐ Nồng độ 38 NST Nhiễm sắc thể 39 PC Phosphatidyl cholin 40 PDI polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) 41 PEG Polyethylenglycol 42 PI Phosphatidyl inositol 43 PTFE Polytetrafluoroethylene Teflon 44 RSD Relative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối) 45 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn ) 46 SPC Soy phospatidyl cholin (Phosphatidyl cholin dầu đậu tương ) 47 SUV Small unilamellar vesicle (Liposome đơn lớp nhỏ) 48 TB Trung bình 49 TBUT Tế bào ung thư 50 TCCS Tiêu chuẩn sở 51 TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) 52 TKHH Tinh khiết hóa học 53 Tf Nhiệt chảy hoàn toàn TT 54 Viết tắt Tm Từ/cụm từ đầy đủ melting temperature (Nhiệt chảy lỏng) 55 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ ) 56 µ Cường độ ion DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số phương pháp định lượng doxorubicin 1.2 Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin thị trường 1.3 Phân loại liposome sở kích thước số lớp 14 1.4 Mốt số đặc tính phospholipid dùng bào chế liposome 17 1.5 Tổng hợp số nghiên cứu liposome tuần hoàn lâu máu hướng đích 29 Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 38 3.1 Mật độ quang mẫu dung dịch doxorubicin bước sóng 482 nm có khơng có tá dược 58 3.2 Mối tương quan mật độ quang bước sóng pH khác với nồng độ doxorubicin 59 3.3 Kết kiểm tra độ lặp lại phương pháp định lượng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 60 3.4 Mối tương quan diện tích pic nồng độ doxorubicin 61 3.5 Độ lặp lại phương pháp định lượng HPLC 62 3.6 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 62 3.7 Kết khảo sát độ 63 3.8 Các công thức bào chế liposome doxorubicin 65 3.9 Hàm lượng hiệu suất liposome hóa mẫu liposome 66 3.10 Tỷ lệ giải phóng dược chất từ mẫu liposome DOX (pH 7,4) 67 3.11 Tỷ lệ giải phóng dược chất mẫu liposome DOX (pH 5,5) 68 3.12 Kết đánh giá kích thước tiểu phân mẫu 69 3.13 Kết đánh giá kích thước tiểu phân mẫu sau tuần bảo quản 72 3.14 Hiệu suất liposome hóa mẫu sau tuần bào chế 73 *Đồ thị phân bố kích thước liposome siêu âm thiết bị Labsonic với thể tích siêu âm 10ml sau gắn doxorubicin Phụ lục 4: Sắc ký đồ doxorubicin * Mẫu chuẩn 100µg/ml *Mẫu định lượng tồn phần liposome doxorubicin Phụ lục 5: Tiêu chuẩn sở phiếu kiểm nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin mg/ml Phụ lục 6: Hình ảnh đại thể khối u ung thư tiền liệt tuyến đùi chuột Nude Sau ghép tế bào khoảng 10 ngày, khối u xuất đùi chuột, với đường kính trung bình khoảng 4-5mm, thể tích tương ứng khoảng 30mm Khối u có mật độ chắc, di động da, khơng có tượng nóng đỏ vị trí khối u Chuột lô chứng Chuột lô thử thuốc nghiên cứu Chuột lơ thử thuốc đối chiếu Hình ảnh khối ung thư TLT đùi chuột thời điểm điều trị Sau điều trị tuần, khối u nhóm chuột có mật độ chắc, di động, ảnh hưởng tới vận động chuột Khơng có tượng nóng đỏ quanh khối u Có thể nhìn thấy hệ thống mạch máu tân tạo bề mặt khối u (hình 3.3) Chuột lơ chứng Chuột thử thuốc nghiên cứu Chuột lơ thử thuốc đối chiếu Hình ảnh khối ung thư TLT đùi chuột sau tuần điều tri ... Đánh giá đặc tính liposome doxorubicin để ti? ?u chuẩn hóa liposome doxorubicin thuốc tiêm liposome doxorubicin Đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml So sánh hi? ?u kháng u thuốc. .. Vì nghiên c? ?u liposome doxorubicin vấn đề cấp thiết nhằm phát triển hệ thuốc cho ngành Dược Việt Nam 2 Với lý trên, đề tài luận án: ? ?Nghiên c? ?u bào chế đánh giá tác dụng khối u thực nghiệm thuốc. .. tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u chuột thực nghiệm Để đạt mục ti? ?u trên, đề tài thực nội dung nghiên c? ?u sau: Nghiên c? ?u xây dựng cơng thức qui trình bào chế liposome doxorubicin