TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học dùng môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường, phịng bệnh xuất huyết cá rơ phi streptococcus agalactiae NGUYỄN THỊ MẾN Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Đức Lưu PGS TS Trần Liên Hà Viện: Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 2020 LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập nghiên cứu, tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ kĩ thuật chuyên nghành công nghệ sinh học Để đạt thành ngày hơm nay, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Đức Lưu; PGS TS Trần Liên Hà người thầy ln tận tâm học trị Người hết lịng hướng dẫn bảo động viên tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn: Tồn thể q Thầy, cô Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian theo học trường Lãnh đạo công ty TNHH Dược Hanvet tập thể phân xưởng Probiotic tạo điều kiện cho làm nghiên cứu thực đề tài cách tốt Những người thân yêu gia đình bên cạnh, ủng hộ nguồn động viên lớn lao hy sinh nhiều để tơi có ngày hơm Xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Mến LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệụ, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Mến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình chăn ni cá rơ phi giới Việt Nam 1.1.1 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi giới 1.1.2 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi Việt Nam 1.2 Các chất NH3, NO2- sinh môi trƣờng ao nuôi 1.2.1 Ammonia (NH3) 1.2.2 Nitrite (NO2-) 10 1.3 Tình hình dịch bệnh cá rô phi 10 1.3.1 Tình hình dịch bệnh cá rô phi 10 1.3.2 Tình hình dịch bệnh xuất huyết cá rơ phi Streptococcus agalactiae gây Việt Nam 13 1.3.3 Thực trạng việc sử dụng phƣơng pháp phòng điều trị bệnh xuất huyết cá rô phi Streptoccus agalactiae gây 16 1.4 Vai trò chế phẩm sinh học với nuôi trồng thủy sản 17 1.4.1 Các nghiên cứu giới 17 1.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 18 1.5 Vi khuẩn Bacillus 19 1.5.1 Đặc điểm sinh học chủng Bacillus 19 1.5.2 Một số loài Bacillus phổ biến tự nhiên 20 1.5.3 Cơ sở khoa học việc chọn chủng Bacillus dùng cho nuôi trồng thủy sản 22 1.5.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có thành phần Bacillus ni trồng thủy sản 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Nguồn vi sinh vật 25 2.1.2 Dụng cụ 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 27 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus 28 i 2.2.3 Tuyển chọn chủng giống 29 2.2.4 Định danh chủng giống 30 2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣờng B subtilis SHV27 33 2.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.2 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng khác đến sinh trƣởng B subtilis SHV27 33 2.3.4 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào đến sinh trƣởng B subtilis SHV2734 2.3 Khảo sát sinh trƣởng B licheniformis SHV43 B pumilus SHV52 34 2.4 Tạo chế phẩm 34 2.4.1 Thu sinh khối 34 2.4.2 Chọn chất mang tạo chế phẩm 34 2.4.3 Khảo sát độ ổn định chế phẩm 35 2.5 Đánh giá hiệu sản phẩm 36 2.5.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NO 2-, NH4+ tăng trọng cá 36 2.5.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế Streptococcus agalactiae HV-Strep O2 36 2.6 Phƣơng pháp phân tích 37 2.6.1 Đánh giá cảm quan 37 2.6.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu 37 Chƣơng NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập chủng giống 38 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh 41 3.2.1 Tuyển chọn khả sinh enzyme ngoại bào 45 3.2.2 Tuyển chọn khả sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae 46 3.2.3 Tuyển chọn khả khử chất độc hại NO2-, NH4+ 46 3.3 Định danh 46 3.3.1 Định danh phản ứng sinh hóa 46 3.3.2 Phân loại chủng Bacillus tuyển chọn giải trình tự gen 50 3.3.3 Tính đối kháng chủng giống 52 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi sinh vật 53 ii 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển vi sinh vật 53 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đầu vào môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi sinh vật 54 3.4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi sinh vật 55 3.4.4 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào đến sinh trƣởng vi sinh vật 56 3.5 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 B.pumilus SHV5257 3.6 Tạo chế phẩm 58 3.6.1 Thu sinh khối 58 3.6.2 Lựa chọn chất mang 58 3.6.3 Khảo sát độ ổn định chế phẩm 60 3.7 Đánh giá hiệu sản phẩm 61 3.7.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm đến nồng độ NO2-, NH4+ tăng trọng cá 61 3.7.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae gây bệnh xuất huyết cá rô phi 63 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 67 PHỤ LỤC 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số sản phẩm Probiotic dùng thủy sản thị trƣờng Việt Nam 24 Bảng 2.1 Các thiết bị dùng q trình thí nghiệm 25 Bảng 3.1 Phân lập chủng giống 38 Bảng 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng giống 41 Bảng 3.4 Định danh kít API 50CH chủng Bacillus chọn 48 Bảng 3.5 Mối tƣơng quan di truyền dịng vi khuẩn tuyển chọn có ngân hàng gen (NCBI) 50 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy chủng B.subtilis SHV27 53 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đầu vào chủng B.subtilis SHV27 54 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy chủng B subtilis SHV27 55 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng lƣu lƣợng khí vào lên men chủng B.subtilis SHV27 56 Bảng 3.10 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 B.pumilus SHV52 57 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ nguyên liệu khác đến khả ức chế S.agalactiae 58 Bảng 3.12 Thành phần công thức chế phẩm 60 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ ổn định chế phẩm 60 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NO2trong nƣớc 61 Bảng 15 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NH4+ nƣớc 62 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến sinh trƣởng cá 63 Bảng 3.17 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae 63 Bảng 3.18 Hóa nghiệm thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng MT1 71 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sản lƣợng cá rô phi nƣớc giới năm 2017 Hình 1.2 Sản lƣợng cá rô phi đông lạnh Trung Quốc thị trƣờng Mỹ Hình 1.3 Sản lƣợng cá rơ phi toàn giới Hình 1.4 Sản lƣợng cá rơ phi dự kiến đến 2029 Hình 1.5 Khu hồ ni cá rơ phi cơng nghệ lồng Nauy Marvin group Hịa Bình Hình 1.6 Sản lƣợng thủy sản xuất 10 tháng đầu năm 2019 Hình 1.7 Sơ đồ vịng tuần hồn Nitơ 10 Hình 1.8 Dung huyết β khuẩn lạc Streptococcus agalactiae, blood agar 18h 36°C 15 Hình 1.9 Dấu hiệu bệnh lý cá nhiễm bệnh xuất huyết S.aglactiae 15 Hinh 1.10 Trực khuẩn Bacillus 19 Hình 2.1 Hệ thống lên men lít 26 Hình 2.2 Hệ thống bể ni cá thí nghiệm 26 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 27 Hình 3.1 Hình thái chủng chọn (ở độ phóng đại 1000 lần tế bào bào tử) 47 Hình 3.2 Cây phân loại chủng SHV27 51 Hình 3.3 Cây phân loại chủng SHV43 51 Hình 3.4 Cây phân loại chủng SHV52 52 Hình 3.5 Tính đối kháng chủng giống 52 Hình 3.6 Quy trình tổng quát tạo chế phẩm 59 Hình 3.7 Khuẩn lạc Streptococcus agalactiae môi trƣờng BA bổ sung kháng sinh 64 Hình 3.8 Trình tự nucleotid chủng B subtilis SHV27 68 Hình 3.9 Trình tự nucleotid chủng B licheniformis SHV43 69 Hình 3.10 Trình tự nucleotid chủng B pumilus SHV52 70 v BẢNG VIẾT TẮT Viết tắt Giải nghĩa NCNTTS Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm CFU Colony forming unit TNHH Trách nhiệm hữu hạn TQ Trung Quốc NA Nutrient agar NB Nutrient broth TE Tellurium  Trypsin-EDTA Ha Héc ta EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid TAE Tris-acetate Ethylenediaminetetraacetic acid CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide SDS Sodium dodecyl sulfate VK Vi khuẩn CMC Carboxymethyl cellulose PCI phenol: chloroform: isoamyl alcohol SP Sản phẩm KT Kiểm tra HQ Hiệu vi ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam không ngừng phát triển ngày chiếm vị trí quan trọng ngành Thủy sản nói riêng kinh tế nƣớc ta nói chung Theo trung tâm giống Khuyến nơng Quốc gia, năm 2015, diện tích ni cá rơ phi nƣớc 21.000 ha; sản lƣợng đạt 150 nghìn tấn; xuất 60 nƣớc; kim ngạch xuất 36 triệu đô Năm 2017, Xuất sang 68 nƣớc chủ yếu EU Mỹ, tăng 32% so năm 2016 tăng mạnh thời gian tới Với mục tiêu sản lƣợng cá rô phi đạt 400.0000 năm 2030, ngồi việc tăng diện tích ni trồng việc áp dụng khoa học kĩ thuật, giải pháp quản lý dịch bệnh đối tƣợng vật nuôi yếu tố quan trọng [1] Khi ngành nuôi trồng thủy sản theo hƣớng công nghiệp phát triển, mật độ nuôi ngày cao, sử dụng đến thức ăn công nghiệp phát sinh tình trạng nhiễm nguồn nƣớc ao nuôi, việc cải tạo đảm bảo nguồn nƣớc ngày trở nên phức tạp đau đầu cho nhà quản lý chăn nuôi Nguồn nƣớc bị ô nhiễm dẫn tới bệnh dịch xảy nhiều hơn, trầm trọng Để giảm bớt thiệt hại, ngƣời chăn nuôi phải sử dụng đến hóa chất thuốc kháng sinh Tình trạng lạm dụng hóa chất thuốc kháng sinh chăn ni thủy sản, dẫn tới tƣợng chủng vi khuẩn gây bệnh ngày đề kháng thuốc, hàm lƣợng hóa chất chất kháng sinh tồn dƣ thƣơng phẩm ảnh hƣởng lớn tới vấn đề xuất tôm, cá nƣớc mà nƣớc đặc biệt thị trƣờng xuất thủy hải sản lớn Việt Nam nhƣ Nhật Bản, Mỹ EU ngày tăng cƣờng việc kiểm tra kiểm soát mặt hàng thủy sản xuất từ Việt Nam Ở Việt Nam năm nuôi khoảng 695.000.000 cá rô phi xu hƣớng ngày mở rộng diện tích ni tập trung vào nuôi công nghiệp Đối với chăn nuôi cá rô phi thƣơng phẩm, ngồi việc nhiễm nguồn nƣớc ao nuôi, bệnh xuất huyết vi khuẩn Streptococcocus sp cá rô phi bùng phát mạnh từ năm 2009 đến tỉnh nuôi cá rô phi nƣớc Diễn biến dịch bệnh ngày phức tạp, việc trị bệnh ngày khó khăn, Việt Nam có vắc xin phịng bệnh xuất huyết cá rô phi nhiên chƣa đƣợc ứng dụng nhiều Các biện pháp phòng trị bệnh chủ yếu dựa vào loại kháng sinh, hiệu phịng trị kháng sinh khơng cao, giá thành chi nƣớc trạng thái ổn định trì đƣợc chất lƣợng Từ kết sơ lựa chọn đƣợc nồng độ chế phẩm sử dụng dự kiến 500gram/1000m3 nƣớc hiệu mà kinh tế b Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm đến nồng độ NH4+ nƣớc Khi mơi trƣờng ao ni bị nhiễm, chu trình chuyển hóa nitơ hiệu dẫn đến nồng độ NH4+ tồn dƣ nhiều nƣớc ao gây hại cho động vật thủy sản Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm khác đến nồng độ NH4+ nước Thời gian theo Bể Bể Bể Bể Bể 0 0 0 1,67 ±1,1 0 0 14 6,67± 1,1 6,67±1,9 5,00±0,0 5,00±0,0 10,00±0,0 21 13,33±1,1 10,00±2,2 15,00±0,0 15,00±0,0 10,00±0,0 28 18,33±1,1 13,33±2,2 15,00±0,0 15,00±0,0 10,00±0,0 35 20,00±0,0 13,33±2,2 18,33±1,1 16,67±1,1 16,67±6,5 42 20,00±0,0 13,33±2,2 16,67±1,1 15,00±0,0 15,00±0,0 dõi (ngày) Kết bảng 3.14 cho thấy: Khi bổ sung chế phẩm có xu hƣớng làm giảm nồng độ NH4+ gây độc nƣớc so với đối chứng cụ thể với bể 1; nồng độ bổ sung chế phẩm 500 gram/ 1000m3 giữ đƣợc nồng độ NH4+ ổn định so với bể 1, 3, 4, với nồng độ chế phẩm bổ sung tƣơng ứng kg, 1kg 2kg/ 1000m3 Điều giải thích biến động NH4+ diễn mạnh theo thời gian trình ni c Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm đến tăng trọng cá Khi chất lƣợng môi trƣờng tốt điều kiện thuận lợi cho cá sinh trƣởng phát triển Do đó, nồng độ nhiễm thể qua nồng độ NH4+, NO2- bể thí nghiệm thấp bể đối chứng tăng trọng cá bể thí nghiệm có xu hƣớng cao sơ với bể đối chứng 62 Bảng 3.16 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm khác đến sinh trưởng cá Thời gian theo Bể Bể Bể Bể Bể 41,0±0,4 41,2±0,3 41,5±0,3 42,5±0,6 42,5±0,6 43,6±0,2 46,0±0,7 46,9±0,9 47,6±1,0 46,2±0,6 14 46,7±0,4 48,2±0,4 49,1±0,7 51,4±1,4 48,6±0,8 21 50,7±0,4 53,2±0,7 56,2±0,8 56,4±0,8 53,9±0,8 28 53,7±0,1 57,2±0,4 60,2±0,8 63,1±1,2 59,2±0,8 35 57,7±0,4 62,2±0,6 63,7±0,9 63,1±1,2 64,3±0,2 42 62,0±0,9 67,0±0,7 68,5±0,8 67,6±1,8 71,5±0,3 dõi (ngày) Theo bảng 3.16 thấy tăng trọng cá bể 2, 3, 4, có xu hƣớng tốt so bể Điều giải thích chất lƣợng mơi trƣờng ni đƣợc cải thiện tạo điều kiện thuận lợi để cá sinh trƣởng phát triển Sau 42 ngày theo dõi trọng lƣợng cá bể 1, 2, 3, 4, tăng trọng lần lƣợt 21, 25,8; 27; 25,1; 29g 3.7.2 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae gây bệnh xuất huyết cá rô phi Để đánh giá hiệu ức chế Streptococcus agalactiae chế phẩm, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả ức chế chế phẩm đến S.agalactiae nồng độ bổ sung chế phẩm 500 gram /1000m3 1kg/1000m3 để tiến hành thử nghiệm Trong điều kiện có ni cá, cảm nhiễm 103 CFU/ml vi khuẩn Streptococcus agalactiae HV-Strep O2 sau theo dõi biến động nồng độ S.agalactiae bể ngày sau bổ sung chế phẩm Bảng 3.17 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm khác đến khả ức chế S.agalactiae Thời gian theo dõi (ngày) Nồng độ S.agalactiae 103 (CFU/ml) Bể Bể Bể 1,07 ± 0,07 1,07 ± 0,07 1,07 ± 0,06 1,21 ± 0,04 0,96 ± 0,06 0,85 ± 0,07 1,23 ± 0,04 0,77 ± 0,09 0,65 ± 0,03 1,32 ± 0,04 0,23 ± 0,03 0,13 ± 0,01 63 Khi bổ sung chế phẩm vào với nồng đồ khác ức chế, làm giảm phát triển vi khuẩn S.agalactiae có mơi trƣờng điều đƣợc giải thích chủng Bacillus chế phẩm đƣợc lựa chọn có khả sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae tốt Hàm lƣợng bổ sung cao khả cạnh tranh, ức chế mạnh Hình 3.7 Khuẩn lạc Streptococcus agalactiae mơi trường BA bổ sung kháng sinh 64 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu đề tài, thu đƣợc kết sau: Phân p, lựa chọn chung giống: - Từ 68 mẫu thực địa, phân lập đƣợc 55 chủng Bacillus sp để tiến hành sàng lọc thông qua đặc tính sinh học nhƣ sinh enzyme ( amylase, protease, cellulase, xylanase), khả khử NO2-, NH4+, khả sinh chất kháng Streptococcus agalactiae gây bệnh xuất huyết cá rơ phi Từ chọn đƣợc chủng hội tụ đủ đặc tính tốt cho đề tài SHV27; SHV43 SHV52 - Kết xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng SHV27 có độ tƣơng đồng 100% với Bacillus subtilis, chủng SHV43 có độ tƣơng đồng với Bacillus paralicheniformis 100% chủng SHV52 tƣơng đồng với Bacillus pumilus 99,93% Lên men tạo chế phẩm: - Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng nhiệt độ, môi trƣờng dinh dƣỡng, pH môi trƣờng lƣu lƣợng khí cấp vào q trình lên men Bacillus subtilis SHV27 20h cho nồng độ tế bào cao 16,61×108 CFU/ml - Đối với chủng B paralicheniformis SHV43 B pumilus SHV52, tiến hành lên men điều kiện giống với B subtilis SHV27 cho kết tƣơng tự nồng độ tế bào cao 20h tƣơng ứng 16,57×108 16,40×108 CFU/ml - Tạo đƣợc chế phẩm nhƣ sau: Thành phần Nồng độ Bacillus paralicheniformis 1,2×109 CFU Bacillus subtilis 1,2×108 CFU Bacillus pumilus 1,2×107 CFU Tá dƣợc (dextrose) vừa đủ gram - Theo dõi đƣợc độ ổn định chế phẩm sau 15 tháng bảo quản Kết ghi nhận không giảm chất lƣợng sản phẩm Nồng độ vi sinh chế phẩm đạt tiêu chuẩn 65 Đánh giá hiệu chế phẩm phịng thí nghiệm ƣớt: - Khi bổ sung chế phẩm với nồng độ từ 500gram/1000m3 giúp xử lý ô nhiễm môi trƣờng thông qua việc làm giảm nồng độ NH4+, NO2- từ cải thiện tăng trọng cá - Khi bổ sung chế phẩm với nồng độ 500gram/1000m3 trở lên ức chế vi khuẩn Streptococcus agalactiae điều kiện phịng thí nghiệm 66 KIẾN NGHỊ Do thời gian hạn chế nên nhiều vấn đề tồn tại, tơi kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu, nâng cao suất trình lên men thu sinh khối chủng vi khuẩn chế phẩm - Tiếp tục nghiên cứu quy trình sản xuất quy mơ lớn - Tiếp tục theo dõi, đánh giá dộ ổn định sản phẩm - Thử nghiệm sản phẩm thực địa, làm sở cho việc sản xuất sử dụng sản phẩm 67 PHỤ LỤC AAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGAC GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGA TCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTG CGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTT TCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCA TAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTC ACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGAT CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTC TTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCC CCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCG GAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTA ACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATC CTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGA GAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACC GCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGT TTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTA AGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCT TGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCT TTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGT TCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCAC GCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACT GCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCG ATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTAC CTCACCAACTAACTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCC GAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGT ATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACC CACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCC ATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTC CTGAGCAG Hình 3.8 Trình tự nucleotid chủng B subtilis SHV27 68 CGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAA ACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATT CACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCA GTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATT GGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCAC GTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGA ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGT CAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGC GACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAA AGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGA CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAG CGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAC ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTG CACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGG CTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC GTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTA TTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAA AACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTG CGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTC AGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGC CTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCAT CTGTAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATAATTGAACCATGCGGTT CAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC TTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATC AGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACG CCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCA, Hình 3.9 Trình tự nucleotid chủng B licheniformis SHV43 69 GGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAA ACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATT CACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCA GTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTATGGGATT GGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCAC GTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAA ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACC CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTC AAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTC CACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCG ACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAA GGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGA CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAG CGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAC ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTG CACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGG CTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC GTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGT TACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAA ACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGC GGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCA GTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCC TTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATC TGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCA AGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTT ACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCG GGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCC GCCAGCGTTCGTCCTGAGCC Hình 3.10 Trình tự nucleotid chủng B pumilus SHV52 70 Bảng 3.18 Hóa nghiệm thành phần dinh dưỡng môi trường MT1 Chỉ tiêu Thành phần hóa nghiệm pH 7,35 NaCl (%) 1,00 Glucose (%) 3,20 Axit amin (%) 3,40 Peptone (%) 7,50 Tryptophan (g/l) 0,67 Protein (g/l) 39,5 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://agromonitor.vn/viet-nam-muc-tieu-san-luong-ca-ro-phi-400000-tanvao-nam-2030_105607.html Trewavas, E (1983), Tilapia Fishes or genera Sarotherodon, Oreochromis, Danakilia, British museum (Natural History) Bạch Thị Tuyết (1999), So sánh caon lại đơn tính lai khác lồi siêu đực cá rô phi Oreochromis niloticus, Luận văn thạc sĩ nuôi trồng thủy sản, trƣờng Đại học thủy sản Nha Trang Madan Mohan Dey (2001), "Tilapia production in South Asia and the Far East", In Subasinghe and Tariochan Singh (Editors), Tilapia production, Marketing and Technological Developments, Published by INFOFISH, pp 17 – 27 FAO (2018 ) Tilapia Trade Global and Regional Trends, http://www.fao.org/fi/staticmedia/MeetingDocuments/TiLV/dec2018/p13 https://tongcucthuysan.gov.vn/trien-vong-san-luong-cac-loai-ca-co-vay-nuoitoan-cau-nhip-do-tang-truong-cham Schmittou (1998), Nguyên lý nuôi cá mật độ cao lồng bè nhỏ (tài liệu dịch tiếng anh sang tiếng việt), Hội đậu tƣơng Hoa Kì, 120 trang Nguyễn Cơng Dân, Trần Mai Thiên, Trần Đình Ln, Phan Minh Qúi (2000), “Chọn giống cá rô phi Oreochromis niloticus nhằm nâng cao sức sinh trƣởng khả chiun lạnh”, Tuyển tập báo cáo khoa học năm 2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang 53-62 Phạm Anh Tuấn (2006) Báo cáo qui hoạch phát triển cá rô phi giai đoạn 2006 – 2015 10 http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/1039_55041/Ca-ro-phi-Viet-Nam-boi-ra-thegioi.htm 11 Bbutt T H TE (1995), Principles of water quality control, Published by INFOFISH 248 pages 12 Nguyễn Thị Kim Thái, Lê Hiền Thảo (1999), Sinh thái học bảo vệ môi trƣờng, NXB Xây dựng, Thành phố Hồ Chí Minh, 182 trang 72 13 Shoemaker, C.A., Xu, D., Klesius, P.H and Evans, J.J, (2008) Concurrent infections (Parasitism and bacterial diesease) in Tilapia, The 8th Internationl Symposium on Tilapia in Aquaculture, Cairo, Egypt, p 1365 – 1375 14 Huicab-Pech ZG, Castaneda-Chavez MR* and Lango-Reynoso F, ( 2017) Pathogenic Bacteria in Oreochromis Niloticus Var Stirling Tilapia Culture National Technological Institute of Mexico, Fish Aqua J 2017, 8(2 ), pp 1-7 15 Buller, N.B (2004) Bacteria from fish and other aquatic animals: a practice identification manual, 361pp 16 Pretto – Giordano, LG., Muller, E.E., de Frritas, J.C and da Silva, V.G (2010) Evaluation on the Pathogenesis of Streptococcus agalactiae in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Brazilian Arch Biol Technol., 53, p 8792 17 Yuasa, Kamaishi, Hatai, Bahnnan and Borisuthpeth (2005) Two case of Streptococal infections of cultured tilapia in Asia In Sixth Symposium on Disease in Asian Aquaculture (ed Bondad-Reantaso MG, Mohan, C.V., Crumlish, M and Subasinghe, R.P.) Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Colombo-Srilanka, pp 259-268 18 Musa, N., L.S Wei, N Musa, R.H Hamdan and L.K Leong et al., 2009 Short communication: Streptococcosis in red tilapia (Oreochromis niloticus) commercial farm in Malaysia Aquac Res., 40: 630-632 Suanyuk, N., H Kanghear, R Khongpradit and K Supamattaya, 2005 Streptococcus agalactiae infection in tilapia (Oreochromis niloticus) Songklanakarin J Sci Technol., 27: 307-319 19 Lisifa Report of DEGITA Species in Asia in China, Shang Hai Fisheries University, 1997 (Lisifa,1997) 20 Wongtavatchai Maisak (2008) Maisak, H., Patamalai, B., Amonsin, A and Wongtavatchai, J 2008 Streptococcosis Oreochromis nilotica Proceedings of the th in Thai cultured tilapia Chulalongkorn University Veterinary Science Annual Conference Bangkok, Thailand p 85-86 21 E Hernandez, J Figueroa, C Iregui Streptococcosis on a red tilapia, Oreochromis sp., farm: a case study J Fish Dis., 32 (3) (2009), pp 247-252 73 22 G.F Mian, D.T Godoy, C.A.G Leal, T.Y Yuhara, G.M Costa, H.C.P Figu eiredoAspects of the natural history and virulence of Streptococcus agalactiae infection in Nile tilapia Vet Microbiol., 136 (2009), pp 180-183 23 M Zamri-Saad, M.N Amal, A Siti-ZahrahPathological changes in red tilapia Oreochromis spp naturally infected by Streptococcus agalactiae J Comp Pathol., 143 (2010), pp 227-229 24 Bromage, E.S., Thomas, A and Owens, L., 1999 Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer Diseases of Aquaculture Organisms 36(3):177–181 25 Intervet, R (2006) Diseases of Tilapia – An Introduction 26 Nguyễn Viết Khuê, Trƣơng Thị Mỹ Hạnh, Đồng Thanh Hà, Nguyễn Thị Hà, Phạm Thành Đô, Bùi Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Nguyện, Nguyễn Hải Xuân, Phạm Thái Giang Nguyễn Thị Thu Hà, (2009) Xác định nguyên nhân gây chết hàng loạt cá rô phi nuôi thƣơng phẩm số tỉnh miền Bắc Báo cáo khoa học Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I 27 Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê Nguyễn Thị Hạnh (2010) Một số đặc điểm Streptococcus agalactiae tác nhân gây bệnh streptococcosis cá rô phi miền Bắc Việt Nam Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo mơi trƣờng phịng ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I 28 Đinh Thị Thủy (2007) Nghiên cứu bệnh nguy hiểm thƣờng gặp cá rô phi thâm canh Thông tin KHCN kinh tế thủy sản 12 29 Whiley RA, Hardie JM (2009) Genus I Streptococcus Rosenbach 1884 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Vol 3: The Firmicutes (2nd ed.) Springer pp 655–711 ISBN 978-0-387-95041-9 30 Bullock, GL (1981) Streptococcal infections of fishes US Fish & Wildlife Publications, Fish Disease leaflet (63 ): 127 31 Salvador, Rogério, Muller, Ernst Eckehardt, Freitas, Julio César de, Leonhadt, Julio Hermann, PrettoGiordano, Lucienne Garcia and Dias, Juliana Alves (2005) Isolation and characterization of Streptococcus spp group B in Nile tilapias (Oreochromis niloticus) reared in hapas nets and 74 earth nurseries in the northern region of Parana State, Brazil Ciência Rural, 35(6): 1374-1378 32 Burbank et al, 2011: Burbank M, Weaver T, Green T, Williams B, Crawford R 2011 Precipitation of calcite by indigenous microorganisms to strengthen liquefiable soils Geomicrobiol J 28(4):301–312 33 Nguyễn Hữu Phúc (2013), “ Khả phát triển việc sử dụng chế phẩm vi sinh nuôi trồng thủy sản Việt Nam”, Tuyển tập nghề cá - Sông Cửu Long, Báo cáo khoa học hội thảo quốc gia, nghiên cứu khoa học phục vụ nghề nuôi trồng thủy sản tỉnh phí Nam, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trang 194-200 34 Mahdhi A, Ángeles Esteban M, Hmila Z, Bekir K, Kamoun F, Bakhrouf A, Krifi B (2012) Survival and retention of the probiotic properties of Bacillus sp strains under marine stress starvation conditions and their potential use as a probiotic in Artemia culture 35 Zhou Q., Zhang P., Zhang G (2014) Biomass and carotenoid production in photosynthetic bacteria wastewater treatment: effects of light intensity Bioresour Technol 171 330–335 36 Kumar et al (2006), Evaluation of Bacillus as a probiotic to Indian major carp Labeo rohita (Ham) 37 Yanong, Roy PE and Francis-Floyd, Ruth (2010) Streptococcal infections of fish Fisheries and Aquatic Sciences, University of Florida, Circular 57 38 Cao Ngọc Điệp,Trần Thị Thƣa Hà Thanh Tồn (2015) ỨNG DỤNG VI KHUẨN CHUYỂN HĨA NITƠ Pseudomonas stutzeri VÀ Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ 39 Zokaeifar H, Luis Balcazar J, Kamarudin MS, Sijam K, Arshad A, Saad CR ( 2012) Selection and identification of non-pathogenic bacteria isolated from fer-mented pickles with antagonistic properties against two shrimp pathogens J Antibiot 40 Rengpipat, S., Tunyanun, A., Fast, A W., Piyatiratitivorakul, S., and Menasveta, P (2003) Enhanced growth and resistance to Vibrio challenge in pond-reared black tiger shrimp Penaeus monodon fed a Bacillus probiotic Dis Aquat Organ 55, 169–173 doi: 10.3354/dao055169 75 41 Vaseeharan, B and Ramasamy, P., 2003 Control of pathogenic Vibrio spp Bacillus Subtilis BT23 apposible probiotic treatment for black tiger shirmp Penaeus monodon Lett Appl Microbiol, 36(2): 83-87 42 El – Sersy et al, 2006 Evaluation of various probiotic bacteria for the survival of panaeus japonicus lavae 43 Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S (1978), Biology of Bacillus popillae, Adv Appl, Microbiol, 23, pp 1-18 44 Lƣơng Đức Phẩm, 2007, Các chế phẩm sinh học đƣợc dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp Hà Nội) 45 Prapansak Srisapoome* and Nonthawit Areechon, 2017 Efficacy of viable Bacillus pumilus isolated from farmed fish on immune responses and increased disease resistance in Nile tilapia (Oreochromis niloticus): laboratory and on-farm trials Yihua Sun 1, Paul De Vos 1, Anne Willems (2018) Influence of Nitrate and Nitrite Concentration on N O Production via Dissimilatory nitrate/nitrite Reduction to Ammonium in Bacillus Paralicheniformis LMG 6934 National Library of Medicine 46 Jngjing Xiao, Changxiong Zhu, Ping Gua, Dongyuan Sun (2011) Removal of ammonium-N from ammonium-rich sewage using an immobilized Bacillus subtilis AYC bioreactor system Journal of Environmental Sciences , 23(8):1279-85 47 Yang, X P., Wang, S M., Zhang, D W & Zhou, L X (2011) Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifyingdenitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1 Bioresour Technol 102, 854– 862 48 T Buruiana et al, 2014) Effect of Probiotic Bacillus species in aquaculturean overview 49 Đỗ Thị Thanh Dung, Lê Thành Bình, Hồng Thị Đăng Dƣơng, Võ Đình Quàng (2017) Tuyển chọn chủng Bacillus spp.sinh enzyme kháng Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm (EMS) tôm 50 https://iqc.com.vn/danh-muc-thuoc-thu-y-thuy-san 76 ... hình chăn ni cá rô phi giới Việt Nam 1.1.1 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi giới 1.1.2 Thực trạng chăn nuôi cá rô phi Việt Nam 1.2 Các chất NH3, NO2- sinh môi trƣờng ao nuôi 1.2.1... phát sinh dịch bệnh Xuất huyết bệnh thƣờng gặp hệ thống nuôi cá thâm canh gây thiệt hại lớn kinh tế cho ngƣời nuôi Trong năm gần đây, nuôi cá rô phi nuôi thâm canh Hải Phòng thƣờng xuất bệnh xuất. .. gây bệnh Vì việc đề xuất đề tài ? ?Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dùng mơi trƣờng ao ni giúp xử lý nhiễm, phịng bệnh xuất huyết cá rô phi Streptococcus agalactiae? ?? yêu cầu cấp thiết Mục đích nghiên