ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: HD1: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG HD2: PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG, PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ ThS CAO CÔNG KHÁNH tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia anh chị, bạn cơng tác Viện Kiểm định Vệ sinh An tồn Thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng đại Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học Hoá K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm Hố phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Hạnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Abs Tiếng Anh Absorbance ACN Tiếng Việt Độ hấp thụ quang Acetonitril Association of Official Hiệp hội cộng đồng phân tích AOAC Analytical Community thức AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic GC Gas Chromatography Sắc ký khí High performance liquid HPLC chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High performance thin layer HPTLC chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IR Infrared Hồng ngoại LC- Liquid chromatography tandem MS/MS mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photodiode Array Mảng diod quang R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo RS Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TLC Thin layer chromatography Lớp mỏng cao Thực phẩm chức TPCN tR Retention time Thời gian lƣu USP United States Pharmacopeia Dƣợc điển Hoa Kỳ UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại khả kiến DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng đặc trƣng loại ginsenosid Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon protopanaxadiol Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon protopanaxatriol 10 Bảng 1.4 Saponin với aglycon acid oleanolic 11 Bảng 3.1 Chƣơng trình gradient 1, 26 Bảng 3.2 Chƣơng trình gradient 3, 27 Bảng 3.3 Danh mục pha động HPTLC khảo sát 29 Bảng 3.4 Kết định lƣợng ginsenosid mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết n-butanol khác 34 Bảng 3.5 Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất 37 Bảng 3.6 Độ lặp lại hệ số lƣu giữ Rf 38 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ tuyến tính chất chuẩn Rg1, Rg1 41 Bảng 3.8 Độ lệch điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 43 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ tuyến tính Rg1, Rb1 HPTLC 43 Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 44 Bảng 3.11 Độ lệch chuẩn điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 46 Bảng 3.12 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng 47 Bảng 3.13 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm 48 Bảng 3.14 Độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu nƣớc sâm 49 Bảng 3.15 Kết phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột 50 Bảng 3.16 Kết phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu viên nang mềm HPTLC 51 Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng 52 Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm 53 Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dung dịch 54 Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng HPTLC 55 Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm HPTLC 56 Bảng 3.32 Kết phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 TPCN 57 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mức di động ginsenosid 'Rx' sắc ký lớp mỏng Hình 1.2 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxadiol Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon protopanaxatriol 10 Hình 1.4 Cấu trúc Saponin với aglycon acid oleanolic 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo ginsenosid Rb1 11 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo ginsenosid Rg1 11 Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 27 Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 27 Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 28 Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 28 Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 29 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu chiết mẫu sử dụng MeOH nồng độ khác 31 Hình 3.7 Sắc đồ sử dụng với dung mơi chiết MeOH 70% 31 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu chiết mẫu sử dụng EtOH nồng độ khác 32 Hình 3.9 Đồ thị biểu thị hiệu chiết mẫu với dung mơi hữu loại lipid 33 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng 39 Hình 3.12 Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 Hình 3.13 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 39 Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV ginsenosid Rg1 40 Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV ginsenosid Rb1 40 Hình 3.16 Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid 41 Hình 3.17 Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 phân tích HPLC 42 Hình 3.18 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm 42 Hình 3.19 Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 HPTLC 44 Hình 3.20 Sắc đồ ginsenosid Rg1 Rb1 phân tích HPTLC 45 Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha dung dịch mẫu trắng 45 Hình 3.22 Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần viên nang cứng 47 Hình 3.23 Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 48 Hình 3.24 Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nƣớc sâm lần 49 Hình 3.25 So sánh độ lặp lại sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức chứa nhân sâm dạng bột 50 Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1, RB1 mẫu viên nang mềm HPTLC 51 Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang cứng lần 52 Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang mềm lần 53 Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid dung dịch lần 54 Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 57 Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 57 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHĨA LUẬN CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhân sâm hoạt chất nhân sâm 1.1.1 Giới thiệu chung nhân sâm 1.1.2 Tác dụng đặc trƣng nhân sâm 1.1.3 Vài nét nhóm hoạt chất ginsenosid 1.1.4 Cơng thức cấu tạo tính chất vật lý ginsenosid Rg1 Rb1 11 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích ginsenosid 12 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu 16 1.4 Tổng quan kỹ thuật HPTLC 17 1.4.1 Sắc ký lớp mỏng 17 1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Khảo sát điều kiện HPLC 22 2.4.2 Khảo sát điều kiện phân tích ginsenosid HPTLC 22 2.4.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 23 2.4.4 Thẩm định quy trình 24 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 24 2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị 24 2.6.1 Thiết bị dụng cụ 24 2.6.2 Hóa chất, thuốc thử 25 2.6.3 Dung dịch chuẩn 25 CHƢƠNG – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26 3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid HPLC 26 3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid HPTLC 29 3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 37 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống 37 3.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 38 3.4.3 Khoảng tuyến tính 41 3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 45 3.4.5 Độ lặp lại phƣơng pháp 46 3.4.6 Độ thu hồi phƣơng pháp 51 3.4.7 Kết áp dụng phƣơng pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 số sản phẩm 55 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 63 Phụ lục 1: Sắc đồ đƣờng chuẩn 63 Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại 64 Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi 65 MỞ ĐẦU Từ xa xƣa, nhân sâm (tên khoa học Panax Ginseng) đƣợc xem thảo dƣợc quý Hoạt chất tạo nên tác dụng kỳ diệu nhân sâm thành phần ginsenosid Hợp chất đƣợc phân thành hai nhóm nhóm Rb1 nhóm Rg1 Vài năm gần nhiều nhà khoa học hƣớng tới quan tâm đặc biệt tới nhân sâm với nhiều nghiên cứu đƣợc công bố Ở Việt Nam nhƣ giới, nhân sâm đƣợc biết đến không nguồn dinh dƣỡng q báu mà cịn vị thuốc vơ quan trọng Theo nghiên cứu khoa học sách đông y nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe ngƣời Ở Việt Nam nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao Nguồn nguyên liệu chủ yếu đƣợc nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên dễ bị giả mạo, sản phẩm nhập chất lƣợng khơng đáp ứng đƣợc chất lƣợng Vì việc kiểm sốt tính chất lƣợng ngun liệu đầu vào quan trọng Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lƣợng nguyên liệu nhân sâm thực phẩm chức chứa nhân sâm nƣớc ta nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng ngƣời dân sử dụng nhầm dƣợc liệu mua phải dƣợc liệu bị chiết hết hoạt chất, chất lƣợng Điều gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời bệnh, quyền lợi ngƣời tiêu dùng mà gây lòng tin ngƣời sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế Kinh tế đất nƣớc Thông thƣờng phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tích hàm ginsenosid Rg1 Rb1 bao gồm: phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu cao (HPTLC), sắc ký mỏng hiệu cao (HPTLC) Việt Nam phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu phƣơng pháp HPLC Phƣơng pháp HPLC đƣợc áp dụng viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính định lƣợng ginsenosid thực phẩm chức có chứa nhân sâm Tuy nhiên chƣa có tiêu chuẩn việc định lƣợng ban hành Việt Nam Do việc áp dụng phụ thuộc vào điều kiện phịng thí nghiệm cụ thể Ngoài ra, phƣơng pháp HPTLC cho thấy tiềm áp dụng để kiểm tra nhanh chất lƣợng nhân sâm sản phẩm từ Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại ginsenosid Rg1 – Rb1 Từ kết bảng 3.16 cho thấy phƣơng pháp đạt yêu cầu AOAC mức nồng độ 0,1% RSD dƣới 3,7% phân tích ginsenosid mẫu TPCN dạng bột kỹ thuật HPTLC 3.4.6 Độ thu hồi phƣơng pháp Độ phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua độ thu hồi, cách thêm dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 vào mẫu trắng không chứa ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu nang cứng, nang mềm dung dịch Kết phân tích thực nghiệm thu đƣợc từ bảng 3.17 đến bảng 3.19, từ hình 3.27 đến hình 3.29 a Phƣơng pháp phân tích HPLC  Viên nang cứng Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng HPLC Thí nghiệm % Độ thu hồi Rg1 % Độ thu hồi Rb1 96,60 92,71 100,7 96,57 96,60 92,71 99,67 95,57 99,33 95,29 98,07 94,00 Trung bình 98,50 94,48 51 mAU 203nm,4nm (1.00) 1750 1500 Rg1/21.897/3472072 Rb1/39.377/5903828 1250 1000 750 500 250 -250 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang cứng lần Nhận xét: Kết phân tích mẫu viên nang cứng, độ thu hồi ginsenosid Rg1 bảng 3.17 khoảng từ 96,6% đến 98,5% (trung bình 98,50%) ginsenosid Rb1 khoảng từ 92,71% đến 96,57% (trung bình 94,48%) Nhƣ phƣơng pháp đạt yêu cầu AOAC độ thu hồi mẫu viên nang cứng  Nền mẫu nang mềm Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm HPLC Thí nghiệm Trung bình % Độ thu hồi Rg1 % Độ thu hồi Rb1 101,4 96,67 98,67 96,53 95,73 95,73 97,60 96,13 97,33 96,00 98,53 97,87 98,21 96,49 52 mAU 203nm,4nm (1.00) 2250 2000 1750 1500 Rg1/21.464/3402945 Rb1/38.928/7324122 1250 1000 750 500 250 -250 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid viên nang mềm lần Nhận xét: Theo AOAC, khoảng nồng độ 0,1% độ thu hồi phƣơng pháp phải đạt 90 – 105 % [12] Từ bảng 3.18 cho thấy ginsenosid Rg1 có độ thu hồi khoảng từ 95,73% đến 101,4% ginsenosid Rb1 có hiệu suất thu hồi từ 95,73% – 97,87 % nằm giới hạn cho phép Nhƣ phƣơng pháp chúng tơi có hiệu suất thu hồi cao, đạt yêu cầu AOAC phân tích ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu viên nang mềm  Nền mẫu dung dịch Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dung dịch HPLC Thí nghiệm % Độ thu hồi Rg1 % Độ thu hồi Rb1 95,09 98,51 93,98 92,07 93,76 96,94 97,09 93,74 95,83 95,22 97,69 96,45 95,60 95,50 Trung bình 53 80 mAU 203nm,4nm (1.00) 70 /38.812/627684 60 /20.990/580968 50 40 30 20 10 -10 -20 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi ginsenosid dung dịch lần Nhận xét: Theo AOAC, khoảng nồng độ 0,1% độ thu hồi phƣơng pháp phải đạt 90 – 105 % [12] Từ bảng 3.19 cho thấy ginsenosid Rg1 có độ thu hồi khoảng từ 93,76% đến 97,69% ginsenosid Rb1 có hiệu suất thu hồi từ 93,74% – 98,51 % nằm giới hạn cho phép Nhƣ phƣơng pháp chúng tơi có độ thu hồi đạt yêu cầu AOAC phân tích ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng dung dịch b Đối với kỹ thuật HPTLC Tiến hành tƣơng tự nhƣ với kỹ thuật HPTLC, kết thu đƣợc độ lặp lại ginsenosid Rg1 Rb1 đƣợc thể từ bảng 3.20 đến bảng 3.21  Với mẫu viên nang cứng Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang cứng HPTLC Thí nghiệm % Độ thu hồi Rg1 % Độ thu hồi Rb1 97,77 89,07 99,34 93,93 88,24 91,53 94,91 90,33 89,64 88,47 91,55 89,27 Trung bình 93,58 90,43 54  Với mẫu viên nang mềm Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 viên nang mềm HPTLC Thí nghiệm Độ thu hồi Rg1(%) Độ thu hồi Rb1(%) 99,80 89,40 90,70 98,70 89,60 91,30 95,80 97,10 92,70 91,10 90,10 92,10 Trung bình 93,10 93,30 Nhận xét: Các kết từ bảng 3.20 đến bảng 3.21 cho thấy phân tích mẫu viên nang mềm viên nang cứng cho độ thu hồi đạt yêu cầu (trung bình > 90% ginsenoside Rg1 Rb1) Đồng thời độ thu hồi kỹ thuật HPTLC có phần so với kỹ thuật HPLC Điều phân tích HPTLC có thêm giai đoạn cạn dung mơi hịa cặn lại MeOH làm thêm mẫu Tuy nhiên với kỹ thuật HPTLC phân tích đồng thời nhiều mẫu, giúp tiết kiệm thời gian chi phí hóa chất 3.4.7 Kết áp dụng phƣơng pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 số sản phẩm Chúng tiến hành nghiên cứu 12 TPCN chứa ginsenosid Rg1 Rb1 đƣợc lấy ngẫu nhiên thị trƣờng theo hai phƣơng pháp HPLC, HPTLC Tất mẫu phân tích đƣợc phân tích định tính phƣơng pháp HPTLC trƣớc, đối mẫu phân tích xuất Rg1, Rb1 tiếp tục tiến hành định lƣợng phƣơng pháp HPLC Kết thu đƣợc nhƣ bảng 3.22, hình 3.30, 3.31 55 Bảng 3.22 Kết phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 TPCN Vùng lấy mẫu Stt Mã sản phẩm Cửa hàng thuốc – Hồ Tùng Mậu – Hà Nội Cửa hàng thuốc – Hoàng Hoa Thám – Hà Nội NC1 NC2 10 11 12 Cửa hàng thuốc – Hoàng Mai – Hà Nội Cửa hàng thuốc – Đƣờng Láng – Hà Nội Cửa hàng thuốc – Hàng Than – Hà Nội Cửa Hàng Thuốc – Đông Anh – Hà Nội Cửa hàng thuốc – Vĩnh Tuy – Hà Nội Cửa Hàng Thuốc – Phạm Hùng – Hà Nội 5,10 24,26 - - - 0,52 0,63 0,95 7,15 5,48 1,45 4,85 2,40 1,09 - 0,56 - - 8,52 6,24 6,34 6,17 Nang cứng NC4 Cửa hàng thuốc – Bùi Thị Xuân – Hà Nội 4,84 Nang cứng Mua mạng Cửa hàng thuốc – Khánh Toàn – Hà Nội 1,42 Nang cứng NC3 Hàm lƣợng (mg/g) ginsenosid ginsenosid Rg1 Rb1 Nang cứng Mua mạng Dạng bào chế Nang cứng NC5 Nang cứng NC6 Nang mềm NM1 Nang mềm NM2 Nang mềm NM3 Nang mềm NM4 Nang mềm NM5 Nang mềm NM6 Trong đó: “- ” : khơng phát 56 mAU 2500 203nm,4nm (1.00) 2000 57.915/72127 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 mAU 203nm,4nm (1.00) 300 200 100 -100 10 20 30 40 50 Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 Dựa kết phân tích mẫu thực, thấy khơng phải tất sản phẩm cơng bố có chứa ginsenosid đạt chất lƣợng nhƣ nhà sản xuất cơng bố ghi bao bì Do đó, cần có kiểm sốt chặt chẽ sản phẩm TPCN thị trƣờng 57 KẾT LUẬN Sau hoàn thành nghiên cứu, kết thu đƣợc nhƣ sau: Đã lựa chọn tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phân tích đồng thời hai ginsenosid Rg1 Rb1 phƣơng pháp HPLC, HPLC bao gồm: Giai đoạn xử lý mẫu: mẫu đƣợc chiết MeOH, lắc xoáy, rung siêu âm, thủy phân 150 phút nhiệt độ 800, định mức, lọc tiến hành phân tích sắc ký viên nang, phân tích SPE lấy dịch phân tích sắc ký mẫu nƣớc  Giai đoạn phân tích HPLC với điều kiện: o Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; µm) tiền cột loại o Pha động: phân tích theo chƣơng trình gradient nồng độ nƣớc -ACN o Nhiệt độ cột: 300C, tốc độ dịng: mL/phút, thể tích bơm mẫu: 50 µL o Detector PDA với bƣớc sóng phát 203 nm  Giai đoạn phân tích HPTLC: o Pha tĩnh: mỏng silica gel 60 F254 (20×10) o Pha động: Cloroform – ethyl acetat - MeOH - nƣớc (15: 40: 22: 10) o Định lƣợng bƣớc sóng 450 nm o Nhiệt độ phòng, tốc độ chấm 150 nl/giây, thể tích bơm mẫu: µl  Phƣơng pháp xây dựng xác định đƣợc khoảng tuyến tính xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn cho ginsenosid, xác định đƣợc LOD, LOQ ginsenosid, độ chọn lọc, độ lặp lại, độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu AOAC Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lƣợng ginsenosid Rg1 Rb1 phƣơng pháp HPLC, HPTLC 12 mẫu thực phẩm chức gồm:viên nang cứng, nang mềm Từ kết thu đƣợc, nhận thấy phƣơng pháp HPLC thích hợp cho việc phân tích định lƣợng, phƣơng pháp HPTLC đƣợc lựa chọn để định tính, phát nhanh ginsenosid mẫu chế phẩm cần tiến hành kiểm tra Nhƣ vậy, tùy thuộc vào mục đích việc phân tích ta lựa chọn phƣơng pháp phân tích mẫu hợp lý 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO A - Tiếng Việt Trần Tử An (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế Việt Nam: Thông thƣ số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 “Hƣớng dẫn việc quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Ngọc Khơi Phạm Vinh Quang (2002), “Định tính định lƣợng Ginsenosid chế phẩm viên nang mềm chứa nhân sâm thị trƣờng thuốc việt nam”, Y học thành phố Hồ Chí Minh, 1(6) Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương pháp phân tích cơng cụ, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích, Nhà xuất giáo dục Nguyễn Chu Huy, Trịnh Nam Trung, Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Văn Bạch, Đào Văn Đơn (2014), “Nghiên cứu định lƣợng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang ukata sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí y - dược học quân sự, (1) Phạm Luận (2000), Giáo trình Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGHN Phạm Luận (2010), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, khoa Hóa học, Trƣờng ĐHKHTN Hà Nội 10 Dƣơng Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Cơng Luận,và Đồn Trọng Đức (2010), “Xác định hàm lƣợng saponin dƣ lƣợng số chất điều hòa sinh trƣởng callus, chồi rễ sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(2), tr,189-202 11 Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hƣơng "Họ 59 nhân sâm (Araliaceae juss) nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 12 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật 13 Trần Quang Trung, Phan Thị Thu Hằng, Nguyễn Văn Bạch (2013), “Xác định hàm lƣợng Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 sâm ngọc linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm ngọc linh phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPTLC”, Tạp chí Y dược học quân sự, (9) 14 Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lầu, Nguyễn Văn Bạch (2013), “ Định lƣợng Ginsenosid Rb1, Re, Rg1 phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao”, Tạp chí Y dược học quân sự, (1) B - Tài liệu tiếng nƣớc ngồi 15 Bonfill M, Casals I, Palazón J, Mallol A and Morales C (2002), "Improved high performance liquid chromatographic determination of Ginsenosid in Panax ginseng based pharmaceuticals using a diol column", Biomedical Chromatography, 16, pp 68-72 16 Chen W, Dang Y, Zhu C (2010), “Simultaneous determination of three major bioactive saponins of Panax notoginseng using liquid chromatographytandem mass spectrometry and a pharmacokinetic study”, Chinese Medicine 17 Court WA, Hendel HG, and Elmi J (1996), “Reversed-phase high-performance liquid chromatographic determination of Ginsenosid of Panax quinquefolium”, Journal of Chromatography A, 755, pp 11-17 18 Fuzzati N (2004), “Analysis methods of Ginsenosid”, Journal of Chromatography B, 812, pp.119-133 19 Guan J, Lai CM and Li SP (2007), “A rapid method for the simultaneous determination of 11 saponins in Panax notoginseng using ultra performance liquid chromatography”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, pp 996-1000 60 20 Jing B (2013), “Simultaneous determination of four active components in Shengmai injection and its application to the quality control in productive process”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 5(12), pp 971-974 21 Kim IW, Hong HD, Choi SY, Hwang DH, Her Y, and Kim SK (2011), “Characterizing a Full Spectrum of Physico-Chemical Properties of Ginsenosid Rb1 and Rg1 to Be Proposed as Standard Reference Materials”, Journal of ginseng research, 35(4), pp 487-496 22 Kim SN, Ha YM, Shin H, Son SH, Wu SJ, Kim YS (2007), “Simultaneous quantification of 14 Ginsenosid in Panax ginseng C.A.Meyer (Korean red ginseng) by HPLC-ELSD and its application to quality control”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, pp 164-170 23 Lai CM, Li SP ,Yu H,Wan JB, Kan KW and Wang YT (2006), “A rapid HPLC–ESI-MS/MS for qualitative and quantitative analysis of saponins in “XUESETONG” injection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40, pp 669-678 24 Laua AJ, Woob SO, Koha HL (2003), “Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection”, Journal of Chromatography A, 1011, pp.77-87 25 Leung KW and Alice Wong AST(2010), "Pharmacology of Ginsenosid: a literature review", Chinese Medicine, pp 5-20 26 Li L, Zhang JL, Sheng YX, Ye G, Guo HZ, Guo DA (2004), “Liquid chromatographic method for determination of four active saponins from Panax notoginseng in rat urine using solid-phase extraction”, Journal of Choromatongraphy B, 808, pp 177-183 27 Liu S, Cui M, Liu Z, and Song F (2004), “Structural Analysis of Saponins from Medicinal Herbs Using Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”, Journal of the American Spectrometry,15(2), pp 133- 141 61 Society for Mass 28 Park SJ, Lim KH, Noh JH, Jeong EJ, Kim YS , Han BC, Lee SH, Moon KS (2013), “Subacute Oral Toxicity Study of Korean Red Ginseng Extract in Sprague-Dawley Rats”, Toxicological Research, 29(4), pp 285- 292 29 Shi W, Wang Y, Li J, Zhang H, Ding L (2006), “Investigation of ginsenosides in different parts and ages of Panax ginseng”, Food Chemistry, 102 (2007), pp 664-668 30 Shin Y, Sun C, Zheng Bo, Li Y, Wang Y (2010), “Simultaneous determination of nine Ginsenosid in functional foods by high performance liquid chromatography with array detector detection”, Food Chemistry, 123, pp 1322-1327 31 Steinmann D, Ganzera M (2011), “Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis”Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, pp 744-757 32 Vanhaelen-Fastré RJ, Faes ML and Vanhaelen MH (2000), “High-performance thin-layer chromatographic determination of six major Ginsenosid in Panax ginseng”, Journal of Chromatography A, 868, pp 269-276 33 Wan JB, Lai CM, Li SP, Lee YM , Kong LY , Wang YT (2005), “Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, pp 274–279 34 Wang J, Qiao L, Li S and Yang G (2013), “Protective Effect of Ginsenosid Rb1 Against Lung Injury Induced by Intestinal Ischemia-Reperfusion in Rats”, Molecules 2013, 18, pp 1214-1226, 35 Yi JH, Kim MY, Kim YC, Jeong WS, Bae DW, Hur JM and Jun M (2010), “Change of Ginsenosid Composition in Red Ginseng Processed with Citric Acid”, Food Sci, Biotechnol, 19(3), pp 647-654 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc đồ đƣờng chuẩn mAU 2000 203nm,4nm (1.00) Rb1/40.093/12234021 1750 Rg1/22.640/5528404 1500 1250 1000 750 500 250 -250 10 20 30 40 50 50 50 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500 ppm mAU 203nm,4nm (1.00) Rg1/22.687/2236526 750 Rb1/39.961/5051226 1000 500 250 0 10 20 30 40 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 200 ppm Rb1/39.904/2624880 mAU 203nm,4nm (1.00) Rg1/22.731/1164371 400 300 200 100 0 10 20 30 40 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppm Rb1/39.897/1337629 mAU 203nm,4nm (1.00) 175 Rg1/22.755/586840 150 125 100 75 50 25 -25 10 20 30 40 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 50 ppm 63 50 Rb1/39.868/579918 mAU 203nm,4nm (1.00) Rg1/22.735/239282 75 50 25 -25 10 20 30 40 50 50 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 20 ppm mAU 203nm,4nm (1.00) 10 -10 Rb1/40.071/135489 Rg1/22.873/59036 20 -20 -30 10 20 30 40 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp ppm Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại Nền mẫu nang cứng lần mAU 203nm,4nm (1.00) 1250 750 500 250 Rb1/38.727/1758205 Rg1/21.387/1978334 1000 0 20 30 40 50 Nền mẫu nang mềm lần mAU 203nm,4nm (1.00) 1500 1250 750 Rb1/38.631/434531 1000 Rg1/21.289/130643 10 500 250 -250 10 20 30 40 64 50 Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi Nền mẫu nang cứng lần mAU 203nm,4nm (1.00) 1750 Rg1/21.897/3472072 1250 Rb1/39.377/5903828 1500 1000 750 500 250 -250 20 30 40 50 50 Nền mẫu nang mềm lần mAU 203nm,4nm (1.00) 2000 Rb1/38.928/7324122 1500 Rg1/21.464/3402945 10 1000 500 0 10 20 30 40 65 ... - NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC... để nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ginsenosid Rg1 Rb 1trong thực phẩm chức 20 CHƢƠNG – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu xây dựng. .. định số ginsenosid thực phẩm chức chứa nhân sâm (Panax Ginseng)? ?? Mục tiêu nghiên cứu:  Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 Rb1) kỹ thuật HPTLC HPLC  Thẩm định phƣơng pháp