ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯƯ THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN MALOLACTIC ĐỂ CẢI THIỆN CHẤT LƯNG RƯU VANG ĐỎ NINH THUẬN Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH - 01/2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC Độc lập-Tự do-Hạnh phúc -oOo Tp.HCM, ngày 17 tháng 01 năm 2011 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ Phái: Nam Ngày tháng năm sinh: 05/11/1984 Nơi sinh: Tp.HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 09310589 TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu điều kiện lên men malolactic để cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực mục tiêu theo hướng nghiên cứu: Khảo sát trình cố định vi khuẩn Oenococcus oeni chất mang alginate, Bacterial cellulose Bacterial cellulose – alginate Tối ưu điều kiện lên men malolactic Ứng dụng chế phẩm cố định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic để cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng năm 2010 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng năm 2011 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung đề cương luận văn thạc só hội đồng chuyên ngành thông qua CB HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CN BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán chấm nhận xét 1: - Cán chấm nhận xét 2: - Luận văn thạc só bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm LỜI CẢM ƠN Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô môn Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Em xin chân thành gởi long biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thúy Hương, người tận tình hướng dẫn em thời gian thực luận văn Cô động viên giúp đỡ em vào lúc khó khăn Cô cho em hiểu tâm huyết, lòng tận tụy người thầy học trò Cô em vừa người thầy, vừa người thân gia đình Cô ơi, em cảm ơn cô nhiều Xin chân thành cảm ơn bạn bè, anh chị em đồng nghiệp đă nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ để hoàn thành tốt nội dung đề luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ ủng hộ động viên suốt thơi gian qua TÓM TẮT LUẬN VĂN - Tên đề tài: Tối ưu điều kiện lên men malolactic để cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận - Học viên thực hiện: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ - Cán hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG - Thời gian thực hiện: Từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2011 Đề tài thu kết sau: Vi khuẩn Oenococcus oeni loài vi khuẩn có khả lên men malolactic điều kiện cực đoan nồng độ cồn cao 10% pH thấp Chế phẩm alginate nồng độ 2.5% alginate, nồng độ 2% CaCl2 109 tế bào/ml ban đầu đưa vào cố định đạt hiệu suất cố định vi khuẩn O.oeni cao 90% Chất lượng chế phẩm alginate đạt 1.36x109 tế bào/g Chế phẩm Bacterial cellulose chế độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, thời gian ủ ngày nhiệt độ ủ 300C cố định O.Oeni mức cao với mật độ trung bình 6.15x109 tế bào/g Chế phẩm Bacterial cellulose-alginate điều kiện tối ưu đạt 7.07x109 tế bào/g Tỷ lệ giống 7%, pH=3.2, nhiệt độ 300C thời gian lên men ngày điều kiện tối ưu cho vi khuẩn O.oeni trình lên men malolactic Quá trình lên men malolactic nho đỏ Ninh Thuận chuyển hóa acid malic thành acid lactic với hiệu suất từ 77.78% đến 88.89% ba chất mang (alginate, BC BCA) Trong đó, chất mang BC-A đạt hiệu tốt với hiệu suất 88.89% sau ngày lên men Quá trình lên men malolactic cố định tế bào Oenococcus oeni cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận LUẬN VĂN THẠC SĨ MỤC LỤC Chương 1: MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Rượu vang 2.1.1 Nguồn gốc rượu vang .3 2.1.2 Chất dinh dưỡng rượu vang 2.1.3 Vi sinh vật rượu vang .6 2.1.4 Quá trình lên men rượu vang 2.1.5 Rượu vang đỏ 2.2 Quaù trình lên men Malolactic (MLF) rượu vang .11 2.2.1 Lịch sử vi khuẩn Malolactic rượu vang 11 2.2.2 Hóa học trình lên men Malolactic 17 2.2.3 Hệ vi sinh trình lên men Malolactic 23 2.2.4 Những nhược điểm cảm quan từ MLF không điều khiển .30 2.2.5 Nhu cầu dinh dưỡng MLB .33 2.2.6 Những yếu tố môi trường ảnh hưởng MLF 35 2.3 Một số nghiên cứu nước hướng đề tài 37 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 3.1 Nguyên vật liệu 41 3.2 Phương pháp nghiên cứu 43 3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghieäm .45 3.2.1.1 Các tiền thí nghiệm khảo sát chủng giống thí nghiệm vi sinh vật liên quan đến đề taøi 45 3.2.1.2 Khảo sát trình cố định tế bào 47 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ i LUẬN VĂN THẠC SĨ 3.2.1.3 Tối ưu hóa trình lên men malolactic 50 3.2.1.4 Khảo sát trình lên men rượu malolactic rượu vang đỏ Ninh Thuận 51 3.3 Phương pháp phân tích 51 3.3.1 Phương pháp xác định số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu 51 3.3.2 Phương pháp định lượng vi sinh vật đo mật độ quang 52 3.3.3 Phương pháp xác định sinh khối ly tâm cân khối lượng .52 3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng số 53 3.3.5 Phương pháp xác định pH .55 3.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng etanol .55 3.3.7 Phương pháp xác định đường khử Dinitrosalycylic (DNS) 55 3.3.8 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm 56 3.3.9 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm yếu tố toàn phần 56 Chương 4:KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59 4.1 Các tiền thí nghiệm khảo sát chủng giống thí nghiệm vi sinh vật liên quan đến đề tài 59 4.1.1 Gioáng Oenococcus oeni 59 4.1.2 Gioáng Saccharomyces cerevisiae 61 4.1.3 Gioáng Acetobacter xylinum 61 4.2 Khảo sát trình cố định tế bào 61 4.2.1 Cố định tế bào chất mang alginate phương pháp nhốt tạo gel .61 4.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alginate đến cố định tế bào .62 4.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến cố định Oenococcus oeni .63 4.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào đến cố định Oenococcus oeni 63 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ ii LUẬN VĂN THẠC SĨ 4.2.2 Cố định tế bào chất mang Bacterial cellulose (BC) phương pháp bẫy – hấp phụ 65 4.2.2.1 Tốc độ lắc 65 4.2.2.2 Thời gian lắc 66 4.2.2.3 Thời gian uû 68 4.2.2.4 Nhiệt độ ủ 69 4.2.3 Cố định tế bào chất mang Bacterial cellulose-Alginate (BC-A) 70 4.2.4 Tối ưu hóa trình lên men malolactic 70 4.2.4.1 Tỷ lệ giống (%) 73 4.2.4.2 pH 73 4.2.4.3 Nhiệt độ .74 4.2.4.4 Thời gian lên men .74 4.2.5 Khảo sát trình lên men rượu malolactid rượu vang đỏ Ninh Thuận .74 4.2.6 Đánh giá chất lượng cảm quan .77 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHAÛO 81 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ iii LUẬN VĂN THẠC SĨ DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Phân loại chế độ uống rượu vang Bảng 2.2 Thành phần vitamin dịch nho rượu vang nho .5 Bảng 2.3 Phân loại vi sinh vật chủ yếu có rượu vang lên men từ nho Bảng 2.4 Quá trình trao đổi hydratcacbon LAB rượu vang 12 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát trình cố định tế bào alginate 48 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát trình cố định tế bào chất mang BC 49 Bảng 3.3 Thông số tối ưu điều kiện lên men malolactic 50 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ alginate đến cố định Oenococcus oeni 62 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến cố định Oenococcus oeni 63 Bảng 4.3 Ảnh hưởng mật độ tế bào đến trình cố định .64 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình cố định Oenococcus oeni chất mang BC 65 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian lắc đến trình cố định Oenococcus oeni chất mang BC 67 Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình cố định Oenococcus oeni treân chất mang BC 68 Baûng 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến trình cố định Oenococcus oeni chất mang BC 69 Bảng 4.8 Kết tối ưu trình lên men malolactid 71 Bảng 4.9 Kết thí nghiệm tâm 71 Bảng 4.10 Kết khảo sát tỷ lệ giống 73 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ iv LUẬN VĂN THẠC SĨ Bảng 4.11 Kết khảo saùt pH .73 Bảng 4.12 Kết khảo sát nhiệt độ 74 Baûng 4.13 Kết khảo sát thời gian lên men .74 Bảng 4.14 Kết số thông số sau lên men rượu ngày 75 Bảng 4.15 Kết sau leân men malolactid .75 Bảng 4.16 Kết tổng hợp màu 77 Baûng 4.17 Kết phân tích ANOVA nhân tố màu 77 Bảng 4.18 Kết tổng hợp mùi .77 Bảng 4.19 Kết phân tích ANOVA nhân tố mùi 78 Bảng 4.20 Kết tổng hợp vị 78 Bảng 4.21 Kết phân tích ANOVA nhân tố vị .78 Bảng 4.22 Kết tổng hợp độ 79 Bảng 4.23 Kết phân tích ANOVA nhân tố độ 79 Sơ đồ 2.1 Quy trình sản xuất rượu vang đỏ 10 Sơ đồ 3.1 Quy trình xử lý nho 41 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 44 Sơ đồ 3.3 Quy trình thu nhận BC thô 46 Sơ đồ 3.4 Quy trình xử lý BC 47 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ v LUẬN VĂN THẠC SĨ Ở nhiệt độ 300C, chất mang BC có mật độ tế bào cao 6.33x109 tế bào/g nằm khoảng nhiệt độ Oenococcus oeni 400C thấp 300C 3.27x109 tế bào/g, chênh lệch tương đđối cao 400C nhiệt độ hạn chế phát triển Oenococcus oeni Vậy, nhiệt độ 300C đđược chọn mức tối ưu cho khảo sát Tóm lại, phương pháp cố định bẫy – hấp phụ chất mang BC có điều kiện tối ưu chế độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, thời gian ủ ngày nhiệt độ ủ 300C Mật độ tế bào trung bình 6.15x109 tế bào/g 4.2.3 Cố định tế bào chất mang Bacterial cellulose-Alginate (BC-A)ï: Chế phẩm BC-A mang ưu điểm alginate ngăn khả khuếch tán tế bào môi trường, tính chất lý bền vững cao chất mang BC, khả trao đổi chất tế bào vi khuẩn không bị ảnh hưởng Chúng áp dụng điều kiện tối ưu nồng độ 2.5% alginate, nồng độ 2% CaCl2, 109 tế bào/ml, chế độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, thời gian ủ ngày nhiệt độ ủ 300C chất mang BC-A có đặc điểm sau: - Cấu trúc: mềm, trơn, rắn - Mật độ vi khuẩn cố định được: 7.07x109 tế bào/g Vậy, kết dạng chất mang cố định O.oeni đạt sau: - Chế phẩm Alginale: đạt 1.36x109 tế bào/g - Chế phẩm Bacterial cellulose: đạt 6.15x109 tế bào/g - Chế phẩm Bacterial cellulose – alginate: đạt 7.07x109 tế bào/g 4.2.4 Tối ưu trình lên men malolactic: Kết tính toán tối ưu hóa trình lên men malolactic theo acid lactic sinh trình bày sau: HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ Bảng 4.8 Kết tối ưu trình lên men malolactic x1 (tỷ lệ giống) + x2 (thời gian lên men) + + + + + x3 (nhiệt độ) x4 (pH) Acid lactic (g/l) + + 0.45 + + - 1.71 + - + 0.45 - - 1.98 - + + 0.54 + - + - 2.79 + - - + 0.72 + - - - 3.15 - + + + 0.27 10 - + + - 1.08 11 - + - + 0.36 12 - + - - 0.63 13 - - + + 0.27 14 - - + - 0.45 15 - - - + 0.09 16 - - - - 0.18 TN Baûng 4.9 Kết thí nghiệm tâm TN x1 x2 x3 x4 Acid lactic (g/l) 0 0 1.62 0 0 2.16 0 0 2.34 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 71 LUẬN VĂN THẠC SĨ Dựa vào bảng 4.8 4.9 tiến hành tính toán tối ưu thu kết sau: - Kết tính hệ số phương trình hồi quy: b0=0.939 b1=0.534 b2=-0.084 b3=0.017 b4=-0.557 - Kiểm định hệ số hồi quy: s2th=0.1404 sb=0.0937 t0=10.03 t1=5.70 t2=0.90 t3=0.18 t4=5.94 Tra bảng phân bố Student tp(f)=t0.05(2)=4.30 t0, t1, t4 > tp(f), hệ số b0, b1, b4 có ý nghóa Kiểm định tương thích với Fisher s2dư=131.27 F=935 Tra bảng F1-p(f1,f2)=F0.95(13,2)=19.4189 F> F0.95(13,2), mô hình không phù hợp với thực nghiệm, kết không tương thích Vì kiểm tra Fisher không phù hợp nên tiến hành điều kiện tối ưu theo quy hoạch thực nghiệm Tuy nhiên, yếu tố tỷ lệ giống, thời gian lên men, nhiệt độ, pH ảnh hưởng đến trình lên men malolactic, ta tiến hành tối ưu phần Khi tiến hành tối ưu phần, thông số khảo sát acid lactid sinh thực tế trình lên men malolactic chuyển từ acid malic sang acid lactic làm cho lượng HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 72 LUẬN VĂN THẠC SĨ acid lactic tăng lên lượng acid malic giảm Vậy, ta chọn thông số khảo sát acid lactic sinh 4.2.4.1 Tỷ lệ giống (%): Bảng 4.10 Kết khảo sát tỷ lệ giống Tỷ lệ giống (%) Acid lactic (g/l) 0.18 0.72 1.26 2.34 1.80 Theo bảng 4.10 lượng acid sinh nhiều tỷ lệ giống 7% Khi tăng lên 9% giống không làm tăng lượng acid lactic sinh tỷ lệ giống tăng cao đến mức ức chế khả hoạt động vi khuẩn Vậy tỷ lệ giống 7% chọn làm mức tối ưu cho khảo sát 4.2.4.2 pH: Bảng 4.11 Kết khảo sát pH pH Acid lactic (g/l) 2.9 2.43 3.2 3.15 3.5 2.52 3.8 0.72 4.1 0.54 Theo baûng 4.11 pH thấp vi khuẩn Oenococcus oeni có xu hướng làm tăng lượng acid lactic nhiều so với pH cao Ở pH=3.2 lượng acid lactic sinh cao nên chọn làm mức tối ưu cho khảo sát HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 73 LUẬN VĂN THẠC SĨ 4.2.4.3 Nhiệt độ: Bảng 4.12 Kết khảo sát nhiệt độ Nhiệt độ (0C) Acid lactic (g/l) 20 1.53 22.5 1.89 25 2.79 27.5 2.97 30 3.15 Theo bảng 4.12 nhiệt độ tăng lượng acid lactic sinh tăng theo tuyến tính Nhiệt độ cao trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic nhanh Vậy, nhiệt độ 300C chọn làm mức tối ưu cho khảo sát 4.2.4.4 Thời gian lên men: Bảng 4.13 Kết khảo sát thời gian lên men Thời gian lên men (ngày) Acid lactic (g/l) 0.27 1.89 3.33 3.06 2.88 Theo bảng 4.13 thời gian lên men tối ưu cho trình malolactic thời gian ngày Sau 4, ngày lượng acid sinh giảm so với ngày, nguyên nhân chuyển hóa qua lại chất làm tăng lượng acid hạn chế hoạt động vi khuẩn Oenococcus oeni Vậy, trình tối ưu hóa phần đạt mức tối ưu tỷ lệ giống 7%, pH=3.2, nhiệt độ 300C thời gian lên men ngày 4.2.5 Khảo sát trình lên men rượu malolactic rượu vang đỏ Ninh Thuận: Để khảo sát trình lên men malolactic, ta phải thực trình lên men rượu có sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae chịu nồng độ đường cao HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 74 LUẬN VĂN THẠC SĨ Dịch nho loại bỏ cuống xử lý theo sơ đồ 3.1 Sau đó, dịch nho điều chỉnh thích hợp cho trình lên men rượu Tỷ lệ giống 3% v/v nấm men bổ sung để lên men kỵ khí vòng ngày nhiệt độ phòng Bảng 4.14 Kết số thông số sau lên men rượu ngày Dịch nho ban đầu 3.89 140 20 Không đáng kể Dịch nho điều Dịch nho sau chỉnh lên men rượu 3.89 3.85 pH 160 40 Đường tổng (g/l) o 28 Chất khô ( Bx) Không đáng kể 10 Độ rượu (%v) 0.5 Acid lactic (g/l) 1.2 Acid malic (g/l) Sau leân men rượu ngày, ta tiến hành lên men malolactic vòng Thông số ngày, tỷ lệ giống 7%, nhiệt độ 30oC Cụ thể: - Mẫu không sử dụng O.oeni : M0 - Mẫu O.oeni tự do: M1 bổ sung 14 ml giống cấp vào 200 ml dịch nho lên men rượu, đạt mật độ 3.5x107 tế bào/ml - Mẫu O.oeni cố định alginate: M2 bổ sung 5.18 g chất mang alginate vào 200ml dịch nho lên men rượu, đạt mật độ 3.5x107 tế bào/ml - Mẫu O.oeni cố định BC : M3 bổ sung 1.14g chất mang BC vào 200 ml dịch nho lên men rượu, đạt mật độ 3.5x107 tế bào/ml - Mẫu O.oeni cố định BC-A : M4 bổ sung 0.99 g chất mang BC-A vào 200 ml dịch nho lên men rượu, đạt mật độ 3.5x107 tế bào/ml Bảng 4.15 Kết sau lên men malolactic Mẫu Acid lactic ban đầu (g/l) M0 M1 M2 M3 M4 0.5 Acid lactic tổng sau lên men malolacic (g/l) 0.5 1.04 1.13 1.22 1.22 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ Acid lactic hình thành sau lên men malolactic (g/l) 0.54 0.63 0.72 0.72 75 LUẬN VĂN THẠC SĨ Sau lên men malolactic, mẫu có sử dụng chế phẩm cố định có khả chuyển hóa acid malic lớn mẫu tự Trong mẫu cố định BC BC-A cao 0.8 Acid lactic hình thành (g/l) 0.7 0.72 0.72 M3 M4 0.63 0.6 0.54 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 M0 M1 M2 Mẫu Biểu đồ 4.6.Kết sau lên men malolactic Nho đỏ Ninh Thuận, với độ chin cấp có hàm lượng acid malic 1.2 g/l dịch lên men Về lý thuyết, 1.2g/l acid malic có khả tối đa chuyển thành 0.81 g/l acid lactic Các chế phẩm cố định chuyển hóa 0.63-0.72 g/l acid lactic đạt hiệu suất 77.78-88.89% cao so với tế bào Oenococcus oeni tự chuyển hóa 0.54 g/l acid lactic đạt hiệu suất 66.67% Bởi vì, tế bào O.oeni nằm chất mang bảo vệ môi trường cực đoan (có nồng độ ethanol cao, acid thấp…) giúp chuyển hóa tốt Ngoài ra, ta thấy chất mang BC BC-A cho hiệu suất 88.89% cao so với 77.78% với chất mang alginate alginate có độ bền lý không cao mà BC lại có độ bền sinh học, sức căng khả chịu nhiệt cao nên giúp tế bào hoạt động tốt [21,32,37,38] HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ 4.2.6 Đánh giá chất lượng cảm quan: Năm mẫu M0, M1, M2, M3, M4 sau lên men malolactic, tiếp tục tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan màu, mùi, vị độ rượu vang đỏ Ninh Thuận 4.2.6.1 Màu: Bảng 4.16 Kết tổng hợp màu Mẫu Tổng người thử Tổng điểm Điểm trung bình Phương sai M0 25 168 6.72 0.87 M1 25 170 6.8 M2 25 159 6.36 0.91 M3 25 164 6.56 1.17 M4 25 169 6.76 0.61 Bảng 4.17 Kết phân tích ANOVA nhân tố màu Nguồn bieán sai SS df MS F P- value F crit Giữa mẫu 3.28 0.82 0.898 0.4672 2.447 Trong mẫu 109.52 120 0.91 Tổng cộng 112.8 124 Kết phân tích ANOVA cho thấy giá trị F=0.898 < F crit=2.447 nên chấp nhận giả thiết H0 có nghóa khác biệt màu mẫu 4.2.6.2 Mùi: Bảng 4.18 Kết tổng hợp mùi Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 Tổng người thử 25 25 25 25 25 Tổng điểm 179 175 178 188 197 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ Điểm trung bình 7.16 7.12 7.52 7.88 Phương sai 0.81 0.75 0.69 0.76 0.69 77 LUẬN VĂN THẠC SĨ Bảng 4.19 Kết phân tích ANOVA nhân tố mùi Nguồn biến sai SS df MS F P- value F crit Giữa mẫu 13.008 3.252 4.391 0.0024 2.447 Trong mẫu 88.88 120 0.741 Tổng cộng 101.888 124 Theo kết phân tích ANOVA cho thấy F=4.391 > F crit=2.447 Pvalue= 0.0024 < 0.05 nên bác bỏ giả thiết H0 có nghóa có khác biệt mùi mẫu Trong đó, mùi mẫu cố định M3, M4 có số điểm trung bình 7.22, 7.58 có mùi ưa thích mẫu O.oeni tự M1 bổ sung O.oeni M0 7.16 Mùi ưa thích mẫu M4 4.2.6.3 Vị: Bảng 4.20 Kết tổng hợp vị Mẫu Tổng người thử Tổng điểm Điểm trung bình Phương sai M0 25 154 6.16 0.72 M1 25 169 6.76 1.44 M2 25 182 7.28 1.13 M3 25 191 7.64 0.82 M4 25 189 7.56 1.09 Bảng 4.21 Kết phân tích ANOVA nhân tố vị Nguồn biến sai SS df MS F P- value F crit Giữa maãu 38.32 9.58 9.206 1.6x10-6 2.447 Trong maãu 124.88 120 1.04 Tổng cộng 163.2 124 Phân tích ANOVA cho thấy F=9.206 > F crit=2.447 P-value=1.6x10-6 < 0.05 nên bác bỏ giả thiết H0 có nghóa có khác biệt vị mẫu Ngoài ra, mẫu M1 có bổ sung O.Oeni có số điểm trung bình 6.76 ưa thích mẫu đối chứng M0 bổ sung mẫu 6.16 Hơn nữa, mẫu cố định M2, M3, HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 78 LUẬN VĂN THẠC SĨ M4 có điểm trung bình 7.28, 7.64, 7.56 ưa thích mẫu không cố định M0, M1 4.2.6.4 Độ trong: Bảng 4.22 Kết tổng hợp độ Mẫu Tổng người thử Tổng điểm Điểm trung bình Phương sai M0 25 192 7.68 0.48 M1 25 145 5.8 1.17 M2 25 185 7.4 0.58 M3 25 148 5.92 0.91 M4 25 186 7.44 0.34 Bảng 4.23 Kết phân tích ANOVA nhân tố độ Nguồn biến sai SS df MS F P- value F crit Giữa maãu 82.672 20.668 29.724 3.52x10-17 2.447 Trong maãu 83.44 120 0.695 Tổng cộng 166.112 124 Theo kết phân tích ANOVA F=29.724 > F crit=2.447 Pvalue=3.52x10-17 < 0.05 nên bác bỏ giả thiết H0 có nghóa khác biệt độ mẫu Trong đó, độ mẫu cố định M2, M3, M4 có điểm số 7.4, 5.92, 7.44 lớn M1 có bổ sung O.Oeni 5.8, tất thua mẫu đối chứng M0 bổ sung O.Oeni 7.68, giải thích độ bị ảnh hưởng bới mật độ tế bào có dịch lên men Tóm lại , theo kết đánh giá cảm quan phân tích ANOVA nhân tố cho thấy màu bị hưởng bới trình lên men malolactic, lại mùi, vị độ trình lên men malolactic cố định tế bào Oenococcus oeni cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận [1] HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 79 LUẬN VĂN THẠC SĨ 5.1 KẾT LUẬN: Vi khuẩn Oenococcus oeni loài vi khuẩn có khả lên men malolactic điều kiện cực đoan nồng độ cồn cao 10% pH thấp Chế phẩm alginate nồng độ 2.5% alginate, nồng độ 2% CaCl2 109 tế bào/ml ban đầu đưa vào cố định đạt hiệu suất cố định vi khuẩn O.oeni cao 90% Chất lượng chế phẩm alginate đạt 1.36x109 tế bào/g Chế phẩm Bacterial cellulose chế độ lắc 200 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, thời gian ủ ngày nhiệt độ ủ 300C cố định O.Oeni mức cao với mật độ trung bình 6.15x109 tế bào/g Chế phẩm Bacterial cellulose-alginate điều kiện tối ưu đạt 7.07x109 tế bào/g Tỷ lệ giống 7%, pH=3.2, nhiệt độ 300C thời gian lên men ngày điều kiện tối ưu cho vi khuẩn O.oeni trình lên men malolactic Quá trình lên men malolactic nho đỏ Ninh Thuận chuyển hóa acid malic thành acid lactic với hiệu suất từ 77.78% đến 88.89% ba chất mang (alginate, BC BC-A) Trong đó, chất mang BC-A đạt hiệu tốt với hiệu suất 88.89% sau ngày lên men Quá trình lên men malolactic cố định tế bào Oenococcus oeni cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận 5.2 KIẾN NGHỊ: Tiến hành tái sử dụng chế phẩm cố định vi sinh vật Tiếp tục nghiên cứu loại chất mang có giá thành rẻ thành, ổn định, dễ sử dụng, mang tính an toàn sinh học cao Khảo sát trình lên men malolactic fermentor tự động với tế bào tự tự bào cố định loại chất mang Nghiên cứu tìm phương pháp hỗ trợ cho trình lên men malolactic nhằm tăng hiệu suất rút ngắn thời gian lên men, cải thiện chất lượng rượu vang HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT: Chu Văn Mẫn, 2003, Ứng dụng tin học sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội Đàm Sao Mai, 2009, Công nghệ sản xuất rượu vang, NXB QGĐH TP.HCM, 1229 Lương ðức Thẩm, 2006, Nấm men coâng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, 188221 Nguyễn Thúy Hương, 2007, Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni để ứng dụng lên men rượu vang hai giai đoạn, Báo cáo Hội nghị khoa học công nghệ lần thứ 10, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghóa, 2007, Công Nghệ Sinh Học tập – Enzyme ứng dụng, NXB Giáo Dục Trần Thị Thanh, 2003, Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Giáo Dục TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƯỚC NGOÀI: Antonio Palacios, 2005, Organoleptic defects caused by uncontrolled malolactic fermentation, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada Bove K, 2002, Effect of resveratrol on growth of 4T1 breast cancer cells in vitro and in vivo, Biochem Biophys Res Commun 291:1001-1005 Carol Brannon, 2008, Is Wine a “Functional Food”?, Nutrition Dimension, Ashland, OR 10 Charles Bamforth, Grape vs Grain, 2008, A Historical, Technological and Social Comparison of Wine and Beer, Cambride University Press, p 1-181 11 Cheetham, 2004, Physical studies on cell immobilization using Calcium alginate gels, Biotechol Bioeng, 2004, p 2155-2168 12 Chris Powell and Richard , 2005, The microbiology of malolactic fermentaion, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 81 LUẬN VĂN THẠC SĨ 13 Derived Volatile Compounds of Red Wine during Malolactic Fermentation with Four Commercial Starter Cultures of Oenococcus oeni, J Agric Food Chem, p 10134-10139 14 Francoise Coucheney and Jean Guzzo, 2005, A new approach for selection of Oenococcus oeni strains in order to produce malolactic starters, p.463-470 15 Goldberg IJ and Piano MR, 2001, Wine and Your Heart: A Science Advisory for Healthcare Professionals from the Nutrition Committee, Council on Epidemiology and Prevention, and Council on Cardiovascular Nursing of the American Heart Association, Circulation 103: 472-475 16 Helmut König and Jürgen Fröhlich, 2009, Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine, Springer, p 3-46, 351-360 17 Herve Alexandrea and Michele Guilloux-Benatier, 2004, Saccharomyces cerevisiae – Oenococcus oeni interactions in wine: current knowledge and perspectives, International Journal of Food Microbiology, p.141-154 18 IwataT And Azuma J., Afinity of hemicellulose for cellulose produce by Acetobacter Xylinum, Cellulose, Vol 5, 1998, p 215-228 19 John I Husnik and Hennie J.J Van Vuuren, 2007, Functional analyses of the malolactic wine yeast MLO1, Am J Enol Vitic, p.42-52 20 J.F Cavin and C.Divies, 1998, Medium for Screening Leuconostoc oenos Strains Defective in Malolactic Fermentation, Applied and Enviromental microbiology, p 751-753 21 Kenneth C Fugelsang, 2007, Wine microbiology Practical Applications and Procedures, Published by Springer, p.1-381 22 Lonvaud and Desens C, 1988, Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabolism, J Sci Food Agrie, p.183-191 23 Maurizio Ugliano and Luigi Moio, 2005, Changes in the Concerntrantion of Yeast HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 82 LUẬN VĂN THẠC SĨ 24 M.A Pozo-Bayón and M.V Moreno-Arribas, 2005,Wine Volatile and Amino Acid Composition after Malolactic Fermentaion: Effect of Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum Starter Cultures, J Agric Food Chem, p 8729-8735 25 Michele Guilloux-Benatier and Herve Alexandre, 2006, Effects of yeast proteolytic activity on Oenococcus oeni and malolactic fermentation, FEMS Microbiol Lett, p.183-188 26 Paolo Specttoli and Arturo Zamorani, 1984, Properties of Malolactic Activity Purified from Leuconostoc oenos ML34 by Affinity Chromatography, Applied and environmental microbiology, p.900-901 27 Peter Costello, 2005, The chemistry of malolactic fermentation, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada 28 Piet Loubser, 2005, Enviromental factors affecting malolactic fermentation, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada 29 P.J.Costello, P.R.Monk, T.H Lee, Numbers and species of lactic acis bacteria in wines during vinification, Food Technol, 1983,p.14-18 30 Ribeùreau-Gayon, 2006, Handbook of Enology, The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments, John Wiley & Sons Ltd, Vol.2, 2006, p 1-138 31 Ronald J clarke and Jokie Bakker, 2004, Introduction, Wine flavour chemistry, Published by Backwell, p.2-18 32 Ronald S.Jackson, PhD, 2008, Introduction, Wine science: Principles and Applications, 3rd Ed., Published by Elsevier, p.1-14, 686-702 33 Scalbert A and Williamson G, 2000, Dietary intake and bioavailability of polyphenols, J Nut 130: 2073S-2085S 34 Sergi Maicas and Sergi Ferrer, 1999, Continuous malolactic fermentation in red wine using free Oenococcus oeni, World Journal of Microbiology & Biotechnology, p.737-739 HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 83 LUẬN VĂN THẠC SĨ 35 Sibylle Krieger, 2005, The history of malolactic bacteria in wine, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada 36 Sibylle Krieger, 2005, The nutritional requirements of malolactic bacteria, Magali Bou and Annamarie Kyne, Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice, Publish by Lallemand, Canada 37 Watanabe K and Yoshinaga F., 1998, Acetobacter Xylinum mutant with high cellulose productivity and an ordered structure, Bioscience Biotechnology, Vol.62, p.1290-1292 38 Yiannis Kourkoutas and Viktor A Nedovíc, 2010, Immobilization of Microbial Cells for Alcoholic and Malolactic Fermentation of Wine and Cider, Nicolaas Jan Zuidam and Viktor A Nedovíc, Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer, New York, p.345-365 Caùc trang web: 39.http://alexandrachel.pbworks.com/w/page/5193206/Classification,Environment,-and-Bacterial-Confirmations-and-Tests 40.http://species.wikimedia.org/wiki/Oenococcus_oeni 41.http://www.intowine.com HVTH: THÁI TRỊNH THƯNG TRÍ 84 ... Bacterial cellulose – alginate Tối ưu điều kiện lên men malolactic Ứng dụng chế phẩm cố định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic để cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận NGÀY GIAO NHIỆM... TÀI: Tối ưu điều kiện lên men malolactic để cải thiện chất lượng rượu vang đỏ Ninh Thuận NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực mục tiêu theo hướng nghiên cứu: Khảo sát trình cố định vi khuẩn Oenococcus oeni chất. .. cellulose-alginate điều kiện tối ưu đạt 7.07x109 tế bào/g Tỷ lệ giống 7%, pH=3.2, nhiệt độ 300C thời gian lên men ngày điều kiện tối ưu cho vi khuẩn O.oeni trình lên men malolactic Quá trình lên men malolactic