Đột biến điểm trên gen yếu tố viii gây bệnh hemophilia a

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp mô tả có phân tích hàng loạt ca lấy mẫu thuận tiện.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Bệnh viện Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Y Sinh học phân tử- Đại học Y Dược TP.HCM, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học.

2.3 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn từ dự án nghiên cứu phát hiện đột biến gen FVIII gây bệnh Hemophilia A và chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ mang kiểu gen dị hợp tử Nghiên cứu được thực hiện do sự phối hợp giữa

Sở Khoa Học Công Nghệ và Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu lớn này bao gồm hai nhóm tham gia: 53 bệnh nhân và 109 thành viên nữ trong gia đình của họ Các bước xác định đột biến gen FVIII được thực hiện thông qua nhiều nghiên cứu nhỏ khác nhau.

Nghiên cứu chúng tôi là một nhánh nhỏ nhằm xác định đột biến điểm trên bệnh nhân tham gia Qui trình chọn mẫu như sau:

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân được khám, xét nghiệm, chẩn đoán xác định Hemophilia A , dựa trên kết quả chẩn đoán các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng như sau:

 Bệnh nhân dễ chảy máu, khi đã chảy máu thì máu khó đông

 Chảy máu có thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ

 Đặc điểm chảy máu là đám bầm máu dưới da, chảy máu ở khớp

 Xét nghiệm thời gian đông máu kéo dài

 Định lượng yếu tố VIII giảm T khởi đầu intron

5 Đây là một đột biến tại vị trí cắt nối intron-exon và do đó, làm ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện mRNA sau dịch mã Đột biến được công bố do tác giả Green năm 2008 gây ra kiểu hình bệnh thể nặng với nồng độ yếu tốFVIII:C < 1 IU/dl [11].

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân Hem10

Bệnh nhân Hem10 có đột biến mất nucleotide A tại vị trí c.3965delA trên exon 14, dẫn đến sự thay đổi protein thành p.Gln1322Argfs* và làm lệch khung dịch mã từ vị trí đột biến.

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự gen FVIII ở bệnh nhân Hem15

Bệnh nhân Hem15 mang đột biến c.6545G>A trên exon 23, dẫn đến việc thay đổi bộ ba CGC thành CAC, làm thay thế acid amin Arginin tại codon 2182 bằng Histidin Đột biến này có điểm số nguy cơ gây bệnh là 1,0 khi phân tích bằng phần mềm Polyphene-2 Được phát hiện ở nhiều bệnh nhân trên toàn cầu, đột biến này lần đầu tiên được công bố bởi tác giả Bogdanova vào năm 2005.

Hình 3.6 Kết quả phân tích nguy cơ gây bệnh của đột biến c.6545G>A bằng phần mềm Polyphene-2

Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân Hem16 cho thấy có một đột biến thêm nucleotide A tại vị trí c.4825dupA trên exon 14, dẫn đến biến đổi p.Thr1609Asnfs*3 trên chuỗi B của protein FVIII Đột biến này thường gặp ở nhiều bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng, nhưng hiếm khi xuất hiện ở thể trung bình Đột biến này lần đầu được công bố bởi tác giả Lin.

Kết quả giải trình tự cho thấy bệnh nhân Hem21 mang đột biến nucleotide c.4379dupA trên exon 14, dẫn đến biến đổi p.Asn1460Lysfs*1 trong vùng B Đột biến này lần đầu tiên được công bố bởi tác giả Higuchi và cộng sự.

Bệnh nhân Hem23 mang đột biến thay thế nucleotide T thành A tại vị trí c.2025 là thay đổi bộ ba TAT mã hóa cho Tyrosine thành bộ ba kết thúc TAA.

Sự xuất hiện của bộ ba kết thúc tại exon 13 đã làm dừng quá trình phiên mã và dẫn đến việc protein FVIII bị cắt cụt Các đột biến vô nghĩa thường gây ra bệnh thể nặng, và đột biến này là một trường hợp mới chưa được ghi nhận trong các cơ sở dữ liệu về bệnh Hemophilia A.

Hình 3.10 Kết quả phân tích gen FVIII của bệnh nhân Hem25

Kết quả giải trình tự cho thấy bệnh nhân Hem25 mang đột biến c.3870dupA, dẫn đến biến đổi p.Gly1291Argfs*29 tại exon 14, làm thay đổi acid amin và lệch khung dịch mã từ vị trí chèn nucleotide A Đột biến này được công bố lần đầu bởi Frusconi vào năm 2002 và đã được phát hiện ở nhiều bệnh nhân Hemophilia A thể nặng tại các quốc gia như Anh, Ý, New Zealand và Tây Ban Nha.

Bệnh nhân Hem27 có đột biến mất nucleotide G tại vị trí c.1141 trên exon 8, dẫn đến sự thay đổi acid amin tại codon 381 của vùng a1 từ axit aspartic thành methionine và làm lệch khung dịch mã Phân tích nguy cơ bằng phần mềm Polyphene-2 cho thấy đột biến này có số điểm nguy cơ là 0,98, cho thấy khả năng gây bệnh cao khi số điểm càng gần 1,0.

Hình 3.12 Kết quả phân tích nguy cơ gây bệnh của đột biến c.1141delG

Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân Hem30 cho thấy có sự chèn nucleotide G tại vị trí c.1096 trên exon 8, dẫn đến sự thay đổi acid amin Aspatic axit thành Glycine tại codon 366, đồng thời làm thay đổi khung dịch mã từ vị trí chèn.

Bệnh nhân Hem34 mang đột biến c.4512delG trên exon 14, được phát hiện bởi tác giả Repesse vào năm 2007 ở một bệnh nhân thể nặng tại Pháp Đột biến này làm thay đổi acid amin tại codon 1504 từ Leucine thành Phenylalanine (p.Leu1504Phefs*62) và gây lệch khung dịch mã từ vị trí đột biến trở đi Phân tích bằng phần mềm Polyphene-2 cho thấy đột biến này có khả năng gây bệnh cao với điểm nguy cơ là 0,999.

Hình 3.15 Kết quả phân tích nguy cơ gây bệnh của đột biến c.4512gelG bằng phần mềm Polyphene-2

Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân Hem35 cho thấy tại vị trí c.266 trên exon 3, nucleotide G bị thay thế bằng A, dẫn đến việc thay đổi bộ ba GGT mã hóa cho Glycine tại codon 89 thành GAT mã hóa cho Aspartic acid Sự thay đổi này ảnh hưởng đến tính chất của các liên kết giữa các acid amin trong cấu trúc của FVIII, gây ra bệnh Hemophilia A thể nặng Phân tích bằng phần mềm Polyphene-2 cho thấy đột biến này có số điểm nguy cơ là 1,0 Đột biến này lần đầu tiên được công bố bởi tác giả Becker vào năm 1996 trong nghiên cứu về bệnh nhân Hemophilia A tại Đức.

Hình 3.17 Kết quả phân tích nguy cơ gây bệnh của đột biến c.266G>A bằng phần mềm Polyphene-2

Hình 3.18 Kết quả giải trình tư gen FVIII của bệnh nhân Hem39

Kết quả giải trình tự exon 7 của bệnh nhân Hem39 cho thấy sự thay thế nucleotide C thành A tại vị trí c.812, dẫn đến việc bộ ba TCA mã hóa cho acid amin Serine bị biến đổi thành bộ ba TAA, một bộ ba kết thúc Đột biến này làm protein FVIII mất hoàn toàn các vùng chức năng A2, A3, B, C1, C2 cùng với các vùng nối a1, a2, a3.

Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân Hem40 cho thấy bệnh nhân mang đột biến c.3637dupA trên exon 14, gây lệch khung dịch mã và dẫn đến sự thay đổi protein p.Ile1213Asnfs*28 Đột biến này đã được ghi nhận ở nhiều bệnh nhân thể nặng và được công bố lần đầu năm 1995 trong nghiên cứu về đột biến gây bệnh Hemophilia A của tác giả Pieneman.

BÀN LUẬN

Mô tả hình thái bệnh nhân

Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại Thành Phố Hồ Chí Minh bao gồm Bệnh viện Đại học Y Dược, Bệnh viện Huyết học Truyền máu, Trung tâm

Trong nghiên cứu về sinh học phân tử tại Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh từ tháng 8/2015 đến tháng 8/2016, 26 bệnh nhân được chọn để thực hiện giải trình tự gen FVIII nhằm xác định đột biến điểm Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh nhân thể nặng chiếm 65,4% (17/26), thể trung bình 23,1% (6/26) và thể nhẹ 11,5% (3/26) Tỷ lệ bệnh nhân thể nặng thấp hơn so với nghiên cứu trước đó của Lưu Vũ Dũng, nơi tỷ lệ này vượt quá 90% Sự khác biệt này có thể do nghiên cứu hiện tại đã loại bỏ những bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22, một đột biến thường gặp ở bệnh nhân Hemophilia A thể nặng Gen FVIII, được mô tả lần đầu tiên vào năm 1982, là gen lớn nhất với chiều dài 186.000 bp, bao gồm 26 exon và nhiều intron lớn hơn 14 kb Quá trình phiên mã loại bỏ intron để tạo ra mRNA trưởng thành dài khoảng 9 kb, tổng hợp protein với 2332 acid amin.

Intron 22 là intron lớn nhất với kích thước 32,4 kb, chiếm tỷ lệ đột biến cao do thường xuyên xảy ra các dạng đột biến tại vị trí nối giữa intron 22 và 23 Những đột biến này có thể dẫn đến sự thất bại trong quá trình sao mã của mARN, góp phần làm tăng tỷ lệ đột biến ở intron 22 so với các intron khác.

Tỷ lệ đột biến điểm ở các thể bệnh

Tỷ lệ phát hiện đột biến điểm trong nghiên cứu này đạt 88,5%, thấp hơn từ 4-9% so với các nghiên cứu trước, có thể do không sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán cho vùng intron và chưa xác định được các đột biến lặp đoạn DNA bằng MLPA Nghiên cứu của chúng tôi cũng có tỷ lệ phát hiện đột biến điểm thấp hơn khoảng 3% so với nghiên cứu tương tự khác, do đã loại trừ các trường hợp đột biến đảo đoạn intron 22 và 1 Tỷ lệ đột biến điểm phân loại theo thể bệnh nặng, trung bình và nhẹ lần lượt là 100%, 66,7% và 66,7%, tương đồng với nghiên cứu của Lưu Vũ Dũng với tỷ lệ 72% Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện đột biến điểm ở thể bệnh nặng cao hơn 5-7% và thấp hơn 10-15% ở thể bệnh trung bình và nhẹ, nguyên nhân có thể do số lượng mẫu ở thể trung bình và nhẹ ít Đột biến điểm xuất hiện 100% ở thể bệnh nặng, thường liên quan đến mất hoặc thêm nucleotid, ảnh hưởng lớn đến cấu trúc gen FVIII và quá trình đông máu Đột biến sai nghĩa cũng xuất hiện ở cả các dạng thể bệnh và có sự đa dạng nhất, gây ra thể bệnh nặng Nghiên cứu từ Hà Nội cũng cho kết quả tương tự, và trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ ghi nhận 3 trường hợp mất đoạn nhỏ, trong đó chỉ 1 trường hợp là thể bệnh nặng.

4.3 Các đột biến điểm chƣa đƣợc công bố

Hàng năm, nhiều đột biến mới trên gen FVIII được công bố trên cơ sở dữ liệu HAMSTERS và CDC, với gen này có kích thước lớn và các đột biến phân bố rải rác Nghiên cứu tại Trung Quốc và Tunisia đã phát hiện 15 vị trí đột biến mới, trong khi Việt Nam cũng ghi nhận một đột biến tại vị trí c.1268 gây bệnh nặng Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện hai vị trí đột biến chưa được công bố: một ở bệnh nhân Hem23 với đột biến thay thế nucleotide T thành A tại vị trí c.2025, dẫn đến việc mã hóa Tyrosine thành bộ ba kết thúc TAA, làm protein FVIII bị cắt cụt Đột biến này thường gây bệnh thể nặng Bệnh nhân Hem43 có đột biến điểm sai nghĩa c.4450A>G, biến đổi codon AGT thành GGT tại exon 14, gây ra sự thay đổi protein p.Ser1484Gly, cũng chưa được ghi nhận trên bất kỳ cơ sở dữ liệu nào.

4.4 Vị trí đột biến điểm gen FVIII tại Việt Nam Được xây dựng và công bố từ những năm 1982, cấu trúc gen FVIII được mô tả như sau:những vùng chính của protein trưởng thành gồm 3 loại: vùng A,vùng B và vùng C Trong đó 3 vùng A (A1, A2, A3) có cấu trúc tương đồng với những yếu tố đông máu khác như yếu tố V và ceruloplasmin, vùng B không tương đồng đáng kể với các chuỗi khác, 20% amino acid ởvùng C tương đồng với các lectin discoidin Ba vùng nhỏ hơn (a1, a2 và a3) nằm giữa các vùng chính tương ứng với A1-A2, A2-B và B-A3 Ngoài ra, còn có các ion ràng buộc như: Cu2+, Ca2+, Mn2+ và các vị trí của glycosyl hóa được quan sát thấy trong cấu trúc protein FVIII Ion Cu2+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình liên kết, ràng buộc giữa vùng A1 và vùng A3, ion này có chức năng quan trọng trong nhận dạng và xác định đúng vị trí sắp xếp của các vùng sau khi vùng B bị loại bỏ trong quá trình hoàn thiện protein FVIII Các ion Ca2+, Mn2+ được biết đến như yếu tố chuyển tiếp giữa các vùng có chức năng gắn kết với các đồng yếu tố khác trong quá trình đông máu, tăng khả năng linh động của phân tử protein.

4.5 Tỷ lệ đột biến ở các exon và intron

Các nghiên cứu trước đây không phát hiện điểm nóng trong sự phân bố đột biến gen FVIII Do đó, toàn bộ 26 exon và các vị trí nối exon-intron đã được phân tích qua phương pháp giải trình tự Một trong những trình tự mồi phổ biến được thiết kế bởi David và cộng sự vào năm 1999, với khoảng 10-15 nucleotide của intron ở đầu và cuối các exon Chúng tôi tiến hành phân tích giải trình tự DNA trực tiếp cho từng sản phẩm PCR, dựa trên trình tự gen FVIII tham khảo từ Genebank 92.

Exon 14 là exon mã hóa cho vùng B có kích thước lớn từ axit amin741 đến 1648 và không có sự tương đồng với các gen đã được mã hóa trước đây[20].Vùng B không cần cho chức năng của FVIII và sau quá trình dịch mã, vùng B bị cắt khỏi chuỗi nặng của FVIII Sự mất bỏ vùng B vẫn tạo được các gen FVIII với đầy đủ chức năng.

Trong nghiên cứu này, tỷ lệ phát hiện đột biến ở exon 14 đạt hơn 50%, cao hơn so với các exon khác Đột biến ở exon 14 có tần suất xảy ra lớn hơn do kích thước của nó lên tới khoảng 3,1 Kb (từ 3106 đến 7227bp), chiếm khoảng 43% vùng mã hóa protein FVIII.

Tỷ lệ này cao hơn với các báo cáo trong nghiên cứu tại Đài Loan đột biến ở exon

Tỷ lệ đột biến tại exon 14 của FVIII được ghi nhận là 21,9% ở một nghiên cứu tại Italia và khoảng 25% trong một nghiên cứu tại Việt Nam Mặc dù nghiên cứu này loại bỏ các đột biến đảo đoạn ở intron 22 và 1, tỷ lệ đột biến điểm trên exon 14 vẫn tương đồng với các nghiên cứu trước đó, cho thấy sự quan trọng của đột biến ở vùng B đối với chức năng hoạt động của FVIII Do tỷ lệ đột biến cao tại exon 14, các chuyên gia khuyến cáo nên tiến hành giải trình tự exon 14 ngay sau khi xác định không có đột biến đảo đoạn ở intron 22 và 1 Theo tác giả David, tỷ lệ đột biến tại vị trí c.3637insA trong exon 14 cũng cao, vì vậy cần thực hiện giải trình tự sớm trước khi tìm kiếm các vị trí đột biến ở các exon khác.

Đột biến sai nghĩa tại exon 14 thường dẫn đến thể bệnh nhẹ, nhưng trong nghiên cứu của chúng tôi, có 3 trường hợp đột biến tại exon 14, trong đó 1 trường hợp gây thể hình trung bình và 2 trường hợp gây thể bệnh nhẹ Những đột biến này đã được ghi nhận trong các nghiên cứu trước đây tại Trung Quốc.

Exon 14 của gen FVIII cho thấy sự xuất hiện đáng kể của các đột biến mất và thêm nucleotid, với tần suất gần 50% Đây là một trong những exon dài nhất của gen này, do đó có khả năng xảy ra đột biến cao hơn so với các vị trí khác Các dạng đột biến này thường làm lệch khung dịch mã, dẫn đến việc đa phần bệnh nhân bị ảnh hưởng nặng nề.

Trong nghiên cứu này, các exon còn lại đều có tỷ lệ đột biến tương đương nhau Tuy nhiên, một số vị trí chưa phát hiện được đột biến do hạn chế về cỡ mẫu Sau khi loại trừ các đột biến do đảo đoạn intron 22 và 1, nghiên cứu chỉ chọn được 26 bệnh nhân, trong đó tỷ lệ bệnh nhân thể nặng chiếm tỷ lệ cao.

4.6 Tỷ lệ đột biến ở vùng mã hóa

Theo các đột biến được công bố trên HAMSTERS, khoảng 50% đột biến điểm ở gen FVIII nằm chủ yếu ở vùng A1 và A2, cho thấy tầm quan trọng của các vùng này trong hoạt động của protein FVIII và sự dễ bị tổn thương của chúng Các đột biến trong khu vực này làm giảm sự tương tác của FVIII với các yếu tố khác, dẫn đến sự mất ổn định của các yếu tố kích hoạt FVIII Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy gần 50% đột biến điểm xuất hiện ở vùng A, trong đó 48% là đột biến thay thế nucleotid gây ra đột biến sai nghĩa, hầu hết đều gây thể bệnh nặng Khác với các nghiên cứu trước, một số đột biến tiêu biểu trong nghiên cứu này, như thay đổi acid amin tại codon 381 từ axit aspartic thành methionine, gây lệch khung dịch mã và có nguy cơ cao gây bệnh với điểm số 0,98 theo phần mềm Polyphene-2 Tại vị trí c.266 trên exon 3 của gen FVIII, nucleotide G bị thay thế bằng A, làm thay đổi codon 89 từ Glycine thành Aspartic acid, dẫn đến thay đổi tính chất của các liên kết giữa các acid amin trong cấu trúc FVIII, gây bệnh ở thể nặng.

Nghiên cứu này phát hiện hai trường hợp đột biến gây mã kết thúc tại vị trí c.2025 và c.4027 trong vùng A1 và A2, dẫn đến thể hình nặng do ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của gen FVIII Đột biến trong vùng B có tần suất tương đối cao, đặc biệt là tại exon 14, nơi thường xảy ra nhiều đột biến Các đột biến sai nghĩa trong vùng B thường xảy ra ở các vị trí nối hoặc tại các vị trí tách thrombin, liên quan đến các vùng lân cận, thường dẫn đến bệnh Hemophilia.

A Đột biến tạo mã kết thúc trong vùng B, dẫn đến việc chấm dứt sớm quá trình dịch mã protein, luôn luôn ảnh hưởng đến toàn bộ protein FVIII và gây bệnh Hemophilia A [27] Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi đột biến ở vùng B chủ yếu là đột biến mất hoặc thêm Nucleotid Vì vậy khác với nghiên cứu trước đây tại Việt Nam, hầu hết các trường hợp đột biến điểm vùng B của nghiên cứu này đều gây thể bệnh nặng.

Vùng C thuộc chuỗi nhẹ của gen FVIII là khu vực xảy ra nhiều đột biến, trong đó phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm từ 38-45% các đột biến gây Hemophilia A, thường ở thể nặng Các nghiên cứu cho thấy đột biến sai nghĩa tại vùng C thường dẫn đến bệnh thể trung bình và nhẹ Tuy nhiên, một trường hợp đặc biệt là đột biến c.6545G>A trên exon 23 ở bệnh nhân Hem23, thay đổi bộ ba CGC thành CAC, dẫn đến việc thay thế Arginin tại codon 2182 bằng Histidin Đột biến này ảnh hưởng đến khả năng gắn kết các yếu tố đông máu.

Nghiên cứu được tiến hành trên 26 bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học và Trung tâm Y Sinh học Phân tử, cho thấy những kết quả đáng chú ý.

- Tỷ lệ phát hiện được đột biến là 88,5% (23/26 bệnh nhân), trong đó tỷ lệ phát hiện đột biến ở thể nặng 100%, ở thể trung bình 66,7% và ở thể nhẹ 66,7%.

Vị trí đột biến điểm Gen FVIII tại VN

Cấu trúc gen FVIII, được công bố từ năm 1982, bao gồm ba vùng chính: A, B và C Trong đó, ba vùng A (A1, A2, A3) có cấu trúc tương đồng với các yếu tố đông máu khác như yếu tố V và ceruloplasmin, trong khi vùng B không tương đồng đáng kể với các chuỗi khác Vùng C có 20% amino acid tương đồng với lectin discoidin Ngoài ra, ba vùng nhỏ hơn (a1, a2, a3) nằm giữa các vùng chính, cùng với các ion như Cu2+, Ca2+, Mn2+ và các vị trí glycosyl hóa được quan sát trong cấu trúc protein FVIII Ion Cu2+ đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết giữa vùng A1 và A3, giúp xác định vị trí sắp xếp của các vùng sau khi loại bỏ vùng B Các ion Ca2+ và Mn2+ cũng hỗ trợ trong quá trình đông máu bằng cách tăng khả năng linh động của protein.

4.5 Tỷ lệ đột biến ở các exon và intron

Các nghiên cứu trước đây không phát hiện điểm nóng trong sự phân bố của các đột biến trong gen FVIII Vì vậy, tất cả 26 exon và các vị trí nối giữa exon-intron đã được phân tích bằng phương pháp giải trình tự Một trong những trình tự mồi phổ biến được thiết kế bởi David và cộng sự vào năm 1999, với khoảng 10-15 nucleotide của intron ở đầu và cuối các exon Chúng tôi đã thực hiện phân tích giải trình tự trực tiếp DNA cho từng sản phẩm PCR, sử dụng trình tự gen FVIII tham chiếu từ Genebank 92.

Exon 14 là exon mã hóa cho vùng B có kích thước lớn từ axit amin741 đến 1648 và không có sự tương đồng với các gen đã được mã hóa trước đây[20].Vùng B không cần cho chức năng của FVIII và sau quá trình dịch mã, vùng B bị cắt khỏi chuỗi nặng của FVIII Sự mất bỏ vùng B vẫn tạo được các gen FVIII với đầy đủ chức năng.

Tỷ lệ phát hiện đột biến ở exon 14 trong nghiên cứu này đạt hơn 50%, cao hơn so với các exon khác Sự xuất hiện của đột biến ở exon 14 cao hơn do kích thước lớn hơn nhiều lần, với chiều dài khoảng 3,1 Kb (từ 3106 đến 7227bp), chiếm khoảng 43% vùng mã hóa protein FVIII.

Tỷ lệ này cao hơn với các báo cáo trong nghiên cứu tại Đài Loan đột biến ở exon

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến tại exon 14 của FVIII là 21,9% ở một số nơi, trong khi nghiên cứu tại Italia ghi nhận tỷ lệ này lên tới 33%, và một nghiên cứu tại Việt Nam cũng cho kết quả khoảng 25% Tuy nhiên, do nghiên cứu này loại bỏ các đột biến đảo đoạn ở intron 22 và 1, nên tỷ lệ đột biến điểm trên exon 14 tương đồng với các nghiên cứu trước đó Điều này cho thấy đột biến ở vùng B rất quan trọng đối với chức năng hoạt động của FVIII, mặc dù không tham gia vào cấu trúc protein hoàn chỉnh Nhiều nghiên cứu khuyến cáo rằng sau khi xác định không có đột biến đảo đoạn ở intron 22 và 1, nên tiến hành giải trình tự exon 14 để sàng lọc các vị trí có khả năng gây đột biến Theo tác giả David, tỷ lệ đột biến tại vị trí c.3637insA trong exon 14 là cao, do đó cần thực hiện giải trình tự sớm trước khi tìm kiếm các vị trí đột biến ở exon khác.

Các đột biến sai nghĩa tại exon 14 thường chỉ dẫn đến thể bệnh nhẹ Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, có 3 trường hợp sai nghĩa trên exon 14, trong đó 1 trường hợp gây thể hình trung bình và 2 trường hợp gây thể bệnh nhẹ Những đột biến này đã được ghi nhận trong các nghiên cứu trước đây tại Trung Quốc.

Các đột biến mất và thêm nucleotid xuất hiện phổ biến ở exon 14, chiếm gần 50%, do đây là một trong những exon dài nhất mã hóa cho gen FVIII Tần suất đột biến cao hơn ở exon này có thể dẫn đến việc lệch khung dịch mã, gây ra thể bệnh nặng cho bệnh nhân.

Trong nghiên cứu này, tỷ lệ đột biến giữa các exon còn lại là tương đương nhau, tuy nhiên một số vị trí vẫn chưa phát hiện được đột biến do hạn chế về cỡ mẫu Sau khi loại trừ các đột biến liên quan đến đảo đoạn intron 22 và 1, nghiên cứu chỉ chọn được 26 bệnh nhân, trong đó tỷ lệ bệnh nhân thể nặng chiếm tỷ lệ cao.

4.6 Tỷ lệ đột biến ở vùng mã hóa

Theo các đột biến được công bố trên HAMSTERS, một nửa số đột biến điểm ở gen FVIII nằm chủ yếu ở vùng A1 và A2, cho thấy tầm quan trọng của các vùng này trong hoạt động của protein FVIII và sự dễ bị đột biến của chúng Các đột biến này làm giảm sự năng động của FVIII khi tương tác với các yếu tố khác, dẫn đến mất ổn định của các yếu tố kích hoạt FVIII Trong nghiên cứu của chúng tôi, gần 50% đột biến điểm xuất hiện ở vùng A (A1, A2 và A3), trong đó 48% là đột biến thay thế nucleotid gây ra bệnh nặng Khác với các nghiên cứu trước cho thấy đột biến vùng A thường gây bệnh nhẹ, một số đột biến trong nghiên cứu này, như thay đổi acid amin tại codon 381 từ axit aspartic thành methionine, đã cho thấy nguy cơ cao với điểm số 0,98 trên phần mềm Polyphen-2 Đặc biệt, tại vị trí c.266 trên exon 3, nucleotide G bị thay thế bằng A, dẫn đến sự thay đổi tính chất của acid amin tại codon 89 từ Glycine thành Aspartic acid, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cấu trúc của FVIII và dẫn đến bệnh nặng.

Nghiên cứu này chỉ ra rằng hai đột biến tại vị trí c.2025 và c.4027 trong vùng A1 và A2 đã tạo ra mã kết thúc, dẫn đến thể hình nặng do ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của gen FVIII Đặc biệt, đột biến trong vùng B xảy ra với tần suất cao, chủ yếu do exon 14 là exon có tần suất đột biến lớn nhất Các đột biến sai nghĩa trong vùng B thường xảy ra tại các vị trí nối hoặc vị trí tách thrombin, gây ra bệnh Hemophilia.

Vùng C của gen FVIII là khu vực có tần suất đột biến cao nhất, trong đó đảo đoạn intron 22 chiếm 38-45% các đột biến gây Hemophilia A, thường ở thể nặng Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến sai nghĩa tại vùng C thường dẫn đến bệnh thể trung bình và nhẹ Tuy nhiên, trường hợp đặc biệt như đột biến c.6545G>A trên exon 23, liên quan đến bệnh nhân Hem23, đã thay đổi bộ ba CGC thành CAC, dẫn đến việc thay thế Arginin bằng Histidin tại codon 2182, ảnh hưởng đến khả năng gắn kết các yếu tố đông máu.

Nghiên cứu được tiến hành trên 26 bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học và Trung tâm Y Sinh học Phân tử thuộc Đại học Y Dược TP.HCM, đã đạt được những kết quả đáng chú ý.

Các dạng đột biến được phát hiện bao gồm: đột biến sai nghĩa chiếm 34,6% (9/26), đột biến mất nucleotid 11,5% (3/26), đột biến vô nghĩa 7,7% (2/26), đột biến thêm nucleotid 23% (6/26), đột biến vị trí nối exon-intron 3,8% (1/26), và đột biến mất đoạn lớn 7,7% (2/26).

Phát hiện một đột biến mới chưa được công bố, đó là sự thay đổi một nucleotide từ T thành A tại vị trí c.2025, dẫn đến việc thay đổi bộ ba TAT mã hóa cho Tyrosine thành bộ ba kết thúc.

TAAtại exon 13 và đột biến điểm sai nghĩa c.4450A>G làm codon AGT bị thay đổi thành GGTtại exon 14

- Tỷ lệ phát hiện được đột biến ở exon 14 trong nghiên cứu này thường gặp nhất chiếm tỷ lệ52,2%.

- Các exon 3, 7, 8, 12, 13, 22, 23 gặp với tỷ lệ thấp hơn từ 4,3% - 13%.

- Chưa phát hiện được đột biến trên các exon còn lại.

Tỷ lệ đột biến ở vùng mã hóa

Theo nghiên cứu trên HAMSTERS, khoảng 50% các đột biến điểm ở gen FVIII tập trung chủ yếu tại các vùng A1 và A2, cho thấy vai trò quan trọng của các vùng này trong hoạt động của protein FVIII và tính dễ bị đột biến của chúng Các đột biến trong khu vực này làm giảm sự tương tác của FVIII với các yếu tố khác, dẫn đến mất ổn định của các yếu tố kích hoạt FVIII Gần 50% đột biến điểm được ghi nhận ở vùng A (A1, A2 và A3), trong đó 48% là đột biến thay thế nucleotide gây ra sự thay đổi mã hóa và hầu hết dẫn đến thể bệnh nặng Khác với các nghiên cứu trước, một số đột biến trong nghiên cứu này, như sự thay đổi tại codon 381 từ axit aspartic thành methionine, gây lệch khung dịch mã và có nguy cơ bệnh cao (0,98 theo Polyphene-2) Tại vị trí c.266 trên exon 3 của vùng A1, sự thay thế nucleotide G bằng A đã làm thay đổi codon 89 từ Glycine thành Aspartic acid, ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của FVIII, dẫn đến thể bệnh nặng.

Nghiên cứu này chỉ ra rằng hai trường hợp đột biến tạo ra mã kết thúc tại vị trí c.2025 và c.4027 trong vùng A1 và A2 đã dẫn đến thể hình nặng do ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của gen FVIII Đặc biệt, đột biến trong vùng B xảy ra với tần suất cao, do exon 14 là exon có tần suất đột biến lớn nhất Các đột biến sai nghĩa trong vùng B thường xảy ra tại các vị trí nối hoặc các vị trí tách thrombin, gây ra bệnh Hemophilia.

Vùng C của gen FVIII là khu vực chứa nhiều đột biến nhất, với đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm 38-45% trường hợp gây Hemophilia A, thường ở thể nặng Các nghiên cứu cho thấy đột biến sai nghĩa tại vùng C thường dẫn đến bệnh thể trung bình và nhẹ Tuy nhiên, một số trường hợp đặc biệt, như đột biến c.6545G>A trên exon 23 ở bệnh nhân Hem23, có thể gây ra những thay đổi nghiêm trọng Đột biến này thay đổi bộ ba CGC thành CAC, dẫn đến việc thay thế Arginin tại codon 2182 bằng Histidin, ảnh hưởng đến khả năng gắn kết các yếu tố đông máu.

Nghiên cứu tiến hành trên 26 bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học và Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM đã thu được những kết quả đáng chú ý.

Các dạng đột biến được phát hiện bao gồm: đột biến sai nghĩa chiếm 34,6% (9/26), đột biến mất nucleotid 11,5% (3/26), đột biến vô nghĩa 7,7% (2/26), đột biến thêm nucleotid 23% (6/26), đột biến vị trí nối exon-intron 3,8% (1/26), và đột biến mất đoạn lớn 7,7% (2/26).

Phát hiện một đột biến mới chưa được công bố, cụ thể là sự thay đổi một nucleotide từ T thành A tại vị trí c.2025, dẫn đến việc thay đổi bộ ba TAT mã hóa cho Tyrosine thành bộ ba kết thúc.

TAAtại exon 13 và đột biến điểm sai nghĩa c.4450A>G làm codon AGT bị thay đổi thành GGTtại exon 14

- Tỷ lệ phát hiện được đột biến ở exon 14 trong nghiên cứu này thường gặp nhất chiếm tỷ lệ52,2%.

- Các exon 3, 7, 8, 12, 13, 22, 23 gặp với tỷ lệ thấp hơn từ 4,3% - 13%.

- Chưa phát hiện được đột biến trên các exon còn lại.

Tần suất đột biến ở vùng A cao nhất, đạt gần 50%, trong khi vùng B ghi nhận tỷ lệ 34,6% và vùng C có tần suất đột biến không đáng kể.

- Căn cứ kết quả đột biến điểm, xây dựng bản đồ vị trí đột biến cho bệnh nhân Hemophilia A tại Việt Nam.

- Sàng lọc các trường hợp nữ lành mang bệnh cho gia đình bệnh nhân Hemophilia A và tư vấn di truyền.

- Ưu tiên giải trình tự gen FVIII phát hiện đột biến sai nghĩa tại vị trí exon

14 và vùng B trong các trường hợp loại trừ đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1.

- Triển khai nghiên cứu phát hiện đôt biến điểm với cỡ mẫu lớn hơn và đặc biệt ở nhóm thể trung bình và nhẹ.

1 Nguyễn Tấn Bỉnh(2015), "Bài Giảng Huyết Học Lâm Sàng", Nhà Xuất Bản Y Học Hồ Chí Minh, pp 258.

2 Lưu Vũ Dũng (2014), "Nghiên cứu xác định đột biên Gen F8 gây bệnh

Hemophilia A.", Đại Học Y Hà Nội.

3 Nguyễn Thị Mai Lan, Ngô Thụy Minh Nhi, Vũ Đỗ Uyên Vy (2012), "Đặc điểm bệnh nhân Hemophilia tại bệnh viện nhi đồng từ 1/2009 đến tháng 12/2011", Tạp Chí Y

4 Huỳnh Nghĩa, Nguyễn Thị Băng Sương, Nghiên Cứu Phát Hiện Đột Biến Yếu

Tố FVIII Gây Bệnh Hemophilia A và Phát Hiện Người Lành Mang Bệnh, 1, Editor

5 Đỗ Trung Phấn (2006), "Bài Giảng Huyết Học Truyền Máu Sau Đại Học", Nhà Xuất Bản Y Học Ha Noi, pp 401.

6 Đỗ Trung Phấn, và cộng sự, Chăm sóc bệnh nhân Hemophilia , in Hội thảo thành lập Hội Hemophilia1996, Viện Huyết học truyền máu Hà Nội.: Ha Noi.

7 Nguyễn Thị Hương Quế (2008), "Nghiên cứu tác động không mong muốn ở bệnh nhân Hemophilia đƣợc truyền chế phẩm máu tại Viện Huyết Học truyền máu Trung Ƣơng giai đoạn 2004-2008", Đại Học Y Hà Nội.

8 Acquila M, Santacroce R, Belvini D (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", J Hum Genet, 53 (275-284).

9 Antonarakis SE, Youssoufian H, Bell W, et al (1988), "Mutations in hemophilia A: estimate of the relative mutation rate at CG dinucleotides", Am J Hum Genet, 42

10 Arai M, Inaba H, Higuchi M, et al (1989), "Direct characterization of factor VIII in plasma: detection of a mutation altering a thrombin cleavage site (arginine-372- -histidine)", Proc Natl Acad Sci U S A, 86 (11), 4277-81.

11 Bagnall R D, Green P M, Waseem N H, et al (2008), "Haemophilia A mutations in the UK: results of screening one-third of the population", Br J Haematol,

12 Becker J., Schwaab R., Moller-Taube A., et al (1996), "Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family studies indicate a mutation type-dependent sex ratio of mutation frequencies", Am J Hum Genet, 58 (4), 657-70.

13 Bogdanova N., Markoff A., Pollmann H., et al (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Hum Mutat,

14 Castaman G., Giacomelli S H., Ghiotto R., et al (2007), "Spectrum of mutations in Albanian patients with haemophilia A: identification of ten novel mutations in the factor VIII gene", Haemophilia, 13 (3), 311-6.

15 CDC The Centers for Disease Control and Prevention Hemophilia A Mutation

16 Drayna D, Baty BJ, Leonard CO (1986), "Prenatal diagnosis of factor VIII deficiency to help with the management of pregnancy and delivery", Lancet, 1 (207- 210).

17 Frusconi Sabrina, Passerini Ilaria, Girolami Francesca, et al (2002),

"Identification of seven novel mutations of F8C by DHPLC", Human Mutation, 20

18 Giannelli F, Bagnall RD, Green PM (2005), "Polymorphism and hemophilia A causing inversions in distal Xq28: A complex picture", Thromb Haemost, 3, 2598-2599.

19 HAMSTERS The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site. 2008.

20 Hans Hermann, Brackmann H H., Jochen Graw, et al (2005), "Heamophilia A: from mutation analysis to new therapies", Nature reviews Genetics, 6, 488-501.

21 Higuchi M., Antonarakis S E., Kasch L., et al (1991), "Molecular characterization of mild-to-moderate hemophilia A: detection of the mutation in 25 of

29 patients by denaturing gradient gel electrophoresis", Proc Natl Acad Sci U S A, 88

22 Hwang S H., Lim J A., Kim H C., et al (2011), "Identification of a shared F8 mutation in the Korean patients with acquired hemophilia A", Korean J Hematol, 46

23 Ivaskevicius V, Oldenburg J, Rost S (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A", J Biochem Biophys Methods, 47, 39-51.

24 Jayandharan G, Peyvandi F, Chandy M (2006), "Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia, 12 (82-89).

25 Jr Lakich D, Kazazian HH, Antonarakis SE, et al (1993), "Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nat Genet, 5, 236-241.

26 Khodjet H, Elmahmoudi H, Wigren E, et al (2012), "First report of molecular diagnosis of Tunisian hemophiliacs A: identification of 8 novel causative mutations",

27 Knopf JL, Toole JJ, Wozney JM, et al (1984), "Molecular cloning of a cDNA encoding human antihemophilic factor", Nature, 3, 332-342.

28 Lin S W., Lin S R., Shen M C (1993), "Characterization of genetic defects of hemophilia A in patients of Chinese origin", Genomics, 18 (3), 496-504.

29 Lindley P, Pemberton S, Zaitsev V, et al (1997), "A molecular model for the triplicated A domains of human factor VIII based on the crystal structure of human ceruloplasmin", Biochemistry, 89 (2413-2421).

30 Liu M., Murphy M E., Thompson A R (1998), "A domain mutations in 65 haemophilia A families and molecular modelling of dysfunctional factor VIII proteins", Br J Haematol, 103 (4), 1051-60.

31 Markoff A, Bogdanova N, Pollmann H (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Hum Mutat, 26, 249-254.

32 McKusick VA (1965), "The Royal Hemophilia", Scient Am, 213 (88-95).

33 Mittal B, Pandey GS (2001), "Molecular diagnosis of Haemophilia A.", Journal of Postgraduate Medicine, 47 (274-280).

34 Moreira I, David D, Lalloz MR, et al (1994), " Analysis of the essential sequences of the factor VIII gene in twelve haemophilia A patients by single-stranded conformation polymorphism", Blood Coagul Fibrinolysis, 14 (257-264).

35 MRC-Holland MRC-Holland MLPA homepage 2008; Available from: http://www.mlpa.com/pages/indexpag.html.

36 Nozari G, Liu Q, Sommer S.S (1998), "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A", Blood, 92 (1458-1459).

37 Oelmueller U, Rainen L, Jurgensen S (2002), "Stabilization of mRNA expression in whole blood samples", Clin Chem, 48 (1883-1890).

38 Pieneman W C., Deutz-Terlouw P P., Reitsma P H., et al (1995), "Screening for mutations in haemophilia A patients by multiplex PCR-SSCP, Southern blotting and RNA analysis: the detection of a genetic abnormality in the factor VIII gene in 30 out of 35 patients", Br J Haematol, 90 (2), 442-9.

39 Radic CP, Rossetti LC, Larripa IB, et al (2005), "Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR", Clin Chem, 51, 154-158.

40 Rallapalli PM, Kemball-Cook G, EG Tuddenham., et al., Factor VIII Variant

41 Repesse Y., Slaoui M., Ferrandiz D., et al (2007), "Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII inhibitor development", J Thromb Haemost, 5 (7), 1469-76.

42 Rodriguez H, Eaton D, Vehar GA (1996), "Proteolytic processing of human factor VIII Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity",

43 Santacroce R., Acquila M., Belvini D., et al (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", J Hum Genet, 53 (3), 275-84.

44 Schroder J, Oldenburg J, Brackmann HH, et al (2004), "Environmental and genetic factors influencing inhibitor development", Semin Hematol, 41 (82-88).

45 Shaji RV, Jayandharan G, George B, et al (2004), "Informativeness of linkage analysis for genetic diagnosis of haemophilia A in India", Hemophilia, 10, 553-559.

46 Shaji RV, Jayandharan G, George B, et al (2004), "Informativeness of linkage analysis for genetic diagnosis of haemophilia A in India", Haemophilia, 553-339.

47 Sirocova N., Tsourea V., Vicol M., et al (2009), "Factor VIII mutations in 42 Moldovan haemophilia A families, including 12 that are novel", Haemophilia, 15 (4), 942-51.

48 Skinner Mark W (2012), "WFH: Closing the global gap – achieving optimal care", Haemophilia, 18, 1-12.

49 Smith MP, Laurie AD, George PM (2007), "Detection of factor VIII gene mutations by high-resolution melting analysis", Clin Chem, 53, 2211-2214.

50 Ventura C, David D, I Moreira, et al (2006), "The spectrum of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia A in 181 Portuguese patients", Haematologica,

51 Waseem N, Bagnall RD, Green PM, et al (2002), "Recurrent invertion breaking intron 1 of factor VIII gene is frequent cause of severe hemophilia A", Blood, 99 (168-174).

52 Williams I, Goodeve AC, Bray GL, et al (2000), "Relationship between factor VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate)", Recombinate PUP Study

53 Wood WI, Gitschier J, Goralka TM, et al (1984), "Characterization of the human factor VIII gene", Nature, 312 (326-330).

54 World federation of Hemophilia, Annual Global Survey 2015, 1, Editor 2015.

55 Yan ZY, Hua BL, Liang Y, et al (2010), "Identification of seven novel mutations in the factor VIII gene in 18 unrelated Chinese patients with hemophilia A.",

PHỤ LỤC Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR giải trình tự gen FVIII

Mồi xuôi Mồi ngược Vùng khuếch đại Kích thước PCR Mồi giải trình tự

F8E1-2: AGC ATC ACA ACC ATC CTA AC

Promoter and Exon 1 1412 bp F8E1-2 and *F8P-2

F8E3-2B: GAT ACG CCA CCA TTA CAA AG

F8E4-2B: GAT TCA GTT GTT TGT ACT TCT C (n)

F8E5-2B: CAT CTC CTT CAT TCC TGA AC (n)

F8E6-2: TAC AGA ACT CTG GTG CTG AA

F8E7-2: TGT CCA GTA AAT TTT ATT AAA AGT

F8E9-2: AGA TAT GTC CAT TGG AGA CAA

F8E10-2: ACT TTA GAC TGG AGC TTG AG

F8E11-2: ACT GAC CTA TAT TGC AAA CCA

F8E12-2: CAT CAT TAT CTG GAC ATC AC

F8E13-2C: AGC ATA CGA ATG GCT AGT GA (n)

F8E14-2: CTT GGC TAT TCA TTA AAC CTG

F8E14-4: CTA CAT TTT GCC TAG TGC TC

F8E14-6: AGG TCC TTC TGA TAA ATG TGA

F8E14-8: GTT GAT AGG TGA GGT TGA CT

F8E15-2: GTG GGA ATA CAT TAT AGT CAG

F8E18-2: CTT AAG AGC ATG GAG CTT GT

F8E20-2: ACT AAT AGA AGC ATG GAG ATG

F8E21-2: GAG TAG ATG TAG TAC ATT TCC

F8E22-2B: GTC CAA TAT CTG AAA TCT GC (n)

F8E23-2: AGT CTC AGG ATA ACT AGA ACA

F8E25-2: TTG CTC TGA AAA TTT GGT CAT A

F8E26-2: GTG TCT GCT AGG ATT TAG CA

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA LUẬN VĂN THEO Ý

KIẾN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ

- Học viên: TRỊNH TUYẾT HUỆ

- Đề tài: Đột biến điểm trên Gen Yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A

- Chuyên ngành: xét nghiệm y học Mã số: 60 72 03 33

- Người hướng dẫn: GS TS Trần Thiện Trung

Luận văn đã được bổ sung và sửa chữa cụ thể các điểm như sau:

1 Chỉnh sửa bổ sung mục lục.

2 Thêm các trích dẫn tài liệu tham khảo vào các hình còn thiếu.

3 Thêm nội dung về đề tài gốc và giải thích cỡ mẫu ước tính.

4 Chỉnh sửa một số lỗi chính tả và lỗi đánh máu: Gen FIII> Gen FVIII, dấu

5 Chỉnh sửa lại phần kết quả- kiến nghị, đề xuất thực hiện với cỡ mẫu lớn hơn Không chỉnh sửa thêm nội dung bàn luận các khả năng không phát hiện đột biến ở thể trung bình và nhẹ, thêm đề xuất cho cỡ mẫu lớn hơn ở bệnh nhân thể trung bình và nhẹ.

6 Chỉnh sửa phần kết quả không hợp lý: Exon 14 bị trùng lặp tỷ lệ %.

7 Bổ sung danh mục từ viết tắt.

8 Bổ sung mã số đào tạo.

Tiêu đề	Đột Biến Điểm Trên Gen Yếu Tố VIII Gây Bệnh Hemophilia A
Tác giả	Trịnh Tuyết Huệ
Người hướng dẫn	GS.TS.BS. Trần Thiện Trung
Trường học	Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Xét Nghiệm Y Học
Thể loại	Luận Văn Thạc Sĩ Kỹ Thuật Y Học
Năm xuất bản	2016
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	85
Dung lượng	2,05 MB