HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ THÙY DƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH ĐẬU GÀ TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI HUYỆN KIM SƠN - NINH BÌNH Ngành: Thú Y Mã ngành: 60 64 01 01 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ để lấy học vị Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Thùy Dương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài, để hồn thành luận văn thạc sĩ, ngồi nỗ lực thân tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, gia đình bạn bè suốt thời gian thực tập Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hữu Nam môn Bệnh lý Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi tận tình q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Các chị phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học khoa Thú Y - Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Cùng tồn thể thầy cô giáo, cán công nhân viên mơn Bệnh lý thú y tồn thể thầy cô giáo khoa Thú Y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Sự động viên tạo điều kiện tốt gia đình, bạn bè góp phần giúp đỡ tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Một lần xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tất người Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Thùy Dương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục chữ viết tắt viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình nghiên cứu bệnh đậu gà 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh đậu gà giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh đậu nước 2.2 Đặc điểm bệnh 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Hình thái, cấu trúc 2.2.3 Tính chất ni cấy 2.2.4 Sức đề kháng 2.3 Dịch tễ học 2.4 Triệu chứng lâm sàng 11 2.5 Bệnh tích 13 2.5.1 Bệnh tích đại thể 13 2.5.2 Bệnh tích vi thể 14 2.6 Chẩn đoán bệnh 14 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 14 2.6.2 Chẩn đoán phân biệt 14 2.6.3 Chẩn đoán virus học 15 2.6.4 Chẩn đoán huyết học 15 iii 2.6.5 Chẩn đoán phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 16 2.7 Phòng bệnh 16 2.7.1 Phòng bệnh vaccine 16 2.7.2 Vệ sinh phòng bệnh 19 2.8 Điều trị 20 Phần Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.2 Địa điểm nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Nguyên liệu 21 3.4.1 Mẫu bệnh phẩm 21 3.4.2 Hóa chất, mơi trường, mồi cần thiết 21 3.4.3 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả 22 3.5.2 Theo dõi quan sát triệu chứng lâm sàng 22 3.5.3 Phương pháp mổ khám (theo tiêu chuẩn ngành thú y 10TCN năm 2005) 22 3.5.4 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 22 3.5.5 Phương pháp làm tiêu mô bệnh học (Phương pháp vùi mô paraffin) 23 3.5.6 Phương pháp tách chiết DNA tổng số hóa chất 25 3.5.7 Phương pháp xét nghiệm số tiêu huyết học gà mắc bệnh đậu 25 3.5.8 Phương pháp xử lý số liệu……………………… .27 Phần Kết thảo luận 27 4.1 Điều tra tình hình bệnh đậu gà địa bàn xã kim tân – kim sơn ninh bình 27 4.1.1 Tình hình chăn ni dịch bệnh 27 4.1.2 Tỷ lệ mắc theo lứa tuổi 29 4.2 Triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh đậu 30 4.3 Kết phản ứng PCR 35 iv 4.4 Biến đổi bệnh lý gà mắc bệnh đậu 37 4.4.1 Bệnh tích đại thể 37 4.4.2 Bệnh tích vi thể chủ yếu gà mắc bệnh đậu 42 4.5 Một số tiêu sinh lý, sinh hóa máu gà mắc bệnh đậu 46 4.5.1 Số lượng hồng cầu 46 4.5.2 Tỷ khối huyết cầu 47 4.5.3 Hàm lượng huyết sắc tố (phân tử hemoglobin) 47 4.5.4 Số lượng bạch cầu công thức bạch cầu 48 4.6 Biện pháp phòng chống bệnh đậu gà 46 4.6.1 Chú ý 46 4.6.2 Phòng bệnh 49 4.6.3 Điều trị triệu chứng 50 Phần Kết luận đề nghị 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 Tài liệu tham khảo 52 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Quy trình chạy mẫu máy chuyển đúc mẫu tự động 23 Bảng 4.1 Tình hình chăn ni gà chung xã Kim Tân – Ninh Bình 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ mắc bệnh đậu gà theo lứa tuổi xã Kim Tân – huyện Kim Sơn – Ninh Bình 30 Bảng 4.3 Triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh đậu giai đoạn - tháng tuổi 31 Bảng 4.4 Sự có mặt virus đậu tổ chức da gà xác định phản ứng PCR 35 Bảng 4.5 Bệnh tích đại thể gà mắc đậu giai đoạn - tháng tuổi 38 Bảng 4.6 Bệnh tích vi thể số quan gà mắc bệnh đậu 42 Bảng 4.7 Một số tiêu huyết học gà mắc bệnh 46 Bảng 4.8 Công thức bạch cầu gà mắc bệnh đậu 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Lớp vỏ virus Hình 2.2 Cấu trúc virus Hình 4.1 Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng 33 Hình 4.2 Kết phản ứng PCR 36 Hình 4.3 Một số hình ảnh chạy PCR 37 Hình 4.4 Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà mắc đậu 41 Hình 4.5 Một số hình ảnh bệnh tích vi thể 45 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt PCR : Polymerase Chain Reaction ELISA : Enzyme linked immuno sorbent assay DNA : Acid Deoxyribo Nucleic Nhuộm HE : Haematoxilin Eosin TBE buffer : Tris boric acid EDTA TAE : Tris acid axetic EDTA AVP : Variola avium pox FPV : Fowpox virus TCID50 : 50 % tissue culture infective dose (Liều gây nhiễm 50 % tế bào) CAM : Chorioallantoic membrane (màng nhung niệu) CPE : Cytophathic Effect (bệnh tích tế bào) viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Thùy Dương Tên luận văn: “Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý bệnh đậu gà đàn gà thả vườn Kim Sơn – Ninh Bình ” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh đậu gà gà thả vườn từ đề xuất biện pháp phịng điều trị bệnh có hiệu Phương pháp nghiên cứu Thơng tin tình hình bệnh đậu gà theo dõi thu thập trực tiếp từ 20 hộ chăn nuôi gà thả vườn xã Kim Tân, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình Các triệu chứng lâm sàng quan sát, theo dõi ghi chép lại Bệnh tích đại thể thực phương pháp mổ khám Bệnh tích vi thể thực phương pháp lấy mẫu xét nghiệm, phương pháp làm tiêu mô bệnh học Kết phản ứng PCR dùng phương pháp tách chiết DNA hóa chất Phương pháp nghiên cứu tiêu huyết học; phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Kết nghiên cứu cho thấy bệnh xảy tất lứa tuổi với triệu chứng tập trung chủ yếu da, hình thành nốt đậu da vùng lơng mào, tích, mí mắt, khóe mắt, khóe miệng … viêm niêm mạc mắt, chảy nước mắt Bệnh tích đại thể chủ yếu gà mắc đậu nốt đậu vùng da lơng chiếm 100,00%, viêm niêm mạc miệng chứa dịch nhày chiếm 76,67%, phổi sưng nhạt màu chiếm tỷ lệ 73,33%, khí quản xuất huyết có dịch xuất lẫn bọt chiếm 66,67%, gan sưng màu nâu nhạt (56,67%), tim nhão tim nhạt màu (53,33%), thận sưng to, xuất huyết (43,33%), lách nhạt màu (40,00%), niêm mạc ruột xuất huyết (33,33%) Bệnh tích vi thể chủ yếu gà mắc đậu da có tượng sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, hoại tử thối hóa tế bào đặc biệt bao hàm bollinger mụn đậu, phổi sung huyết Ngoài bệnh tích khác thay đổi tùy thuộc vào tình trạng bệnh Phương pháp PCR cho phép chẩn đoán nhanh xác virus đậu Những kết nghiên cứu cung cấp thêm sở khoa học giúp ích cho bác sĩ thú y, người làm công tác chẩn đốn lâm sàng chẩn đốn virus đậu sơ dựa vào triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể trước thu mẫu đến phòng xét nghiệm Các tiêu huyết học gà mắc đậu nói lên tình trạng gà bị thiếu máu số lượng hồng cầu giảm dẫn tới hàm lượng huyết sắc tố giảm tăng số lượng bạch cầu toan, bạch cầu đa nhân trung tính ix niêm mạc gây bệnh lý đặc trưng: hình thành nốt vùng da lơng, niêm mạc xuất huyết có phủ lớp màng giả, quan phủ tạng thối hóa nhẹ Bệnh tích đặc trưng tổn thương mỏ, chân khu vực khác da Các tổn thương mí mắt xung quanh mỏ ảnh hưởng đến tầm nhìn ăn Theo Sato (2000) nghiên cứu thấy khí quản có lớp màng bã đậu dính vào niêm mạc khí quản hầu hết trường hợp mổ khám không bắt gặp tượng mà thấy khí quản xuất huyết có dịch nhày Điều lý giải biến chủng virus, đường xâm nhập, cường độ độc lực mầm bệnh không cao, điều kiện chăn nuôi, sức đề kháng thể…Các tổn thương khí quản, họng xoang gây cản trở cho hô hấp Tử vong cao nghẹt thở, tắc nghẽn hay tổn thương khí quản Hiện tượng thối hóa tim (cơ tim nhão) gặp trường hợp mổ khám gà Cơ tim nhạt màu, nhão, độ rắn Điều giải thích q trình viêm phổi làm gà khó thở để đáp ứng nhu cầu oxy cho hơ hấp tim phải tăng cường hoạt động bù hoạt động q mức tim bị thối hóa Đồng thời bệnh tích phổi sưng, nhạt màu giải thích cho triệu chứng khó thở Do gà bị viêm niêm mạc miệng nên gà giảm ăn, bỏ ăn Thận sưng, niêm mạc ruột xuất huyết, lách nhạt màu bệnh tích chúng tơi quan sát mổ khám Từ tổn thương đại thể đưa kết luận sau: Virus đậu gà gây biến đổi bệnh lý toàn thân ba hệ quan chịu tác động mạnh virus xâm nhiễm da, niêm mạc miệng, hệ hô hấp 39 Niêm mạc miệng phủ màng giả, có dịch nhày Khí quản xuất huyết Thận sưng Lách nhạt màu Phổi sưng Tim nhão, tim nhạt màu Hình 4.4 Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà mắc đậu 40 Trong quan nội tạng kiểm tra ko bắt gặp mụn đậu Điều lại lần khẳng định virus hướng thượng bì Các bệnh tích đại thể khác thay đổi tùy thuộc vào diễn biến bệnh kế phát bệnh khác Do thường có kế phát tác nhân gây bệnh khác nên bệnh tích thể có tác nhân kế phát gây Việc phân biệt bệnh tích virus đậu gây tác nhân kế phát khó thực Trong lâm sàng, việc chẩn đốn gà bị mắc đậu dựa vào số bệnh tích như: nốt đậu vùng da lơng, viêm niêm mạc miệng chứa dịch nhày cịn bệnh tích khác giống với số bệnh truyền nhiễm Do để có kết luận xác cần có hỗ trợ xét nghiệm phịng thí nghiệm Những quan sát chúng tơi có kết giống với nghiên cứu nhiều tác giả công bố Hồ Thị Việt Thu (2012); Nguyễn Văn Hanh (1978) 4.4.2 Bệnh tích vi thể chủ yếu gà mắc bệnh đậu Nghiên cứu bệnh tích vi thể nội dung quan trọng giúp cho việc đánh giá tổn thương bệnh lý cấp độ mô bào Sau kiểm tra bệnh tích đại thể từ 10 gà nghi mắc bệnh đậu mổ khám, tiến hành lấy mẫu tổ chức: da chứa nốt đậu, khí quản, phổi, gan, thận, tim có đặc điểm bệnh tích điển hình mắc bệnh ngâm formol 10% làm tiêu biến đổi vi thể Từ biến đổi vi thể giúp ta khẳng định chắn yếu tố gây bệnh có mặt virus đậu Từ quan gà mắc bệnh đậu, cắt lấy block vị trí có bệnh tích đặc trưng tiến hành làm tiêu vi thể Sau đúc mẫu bệnh phẩm thu 20 block, block tiến hành cắt, nhuộm tiêu chọn tiêu đẹp sau tiến hành soi kính hiển vi quan sát bệnh tích vi thể Để đánh giá bệnh tích vi thể: Nếu block có tiêu có bệnh tích trở lên chúng tơi coi dương tính (+) Chúng tơi nhận thấy bệnh tích chủ yếu 10 nghiên cứu biến đổi da Kết trình bày bảng 4.5 41 Bảng 4.6 Bệnh tích vi thể số quan gà mắc bệnh đậu Bệnh tích vi thể TT Cơ quan Sung huyết Xuất huyết Hoại tử tế bào Thối hóa tế bào Thâm nhiễm tế bào viêm Thể bao hàm Bollinger n (+) (%) n (+) (%) n (+) (%) n (+) (%) n(+) (%) n(+) (%) Gan (n = 20) 16 80 0 20 14 70 10 50 0 Phổi (n = 20) 18 90 40 20 40 16 80 0 Thận (n = 20) 10 50 30 20 20 10 50 0 Tim (n = 20) 20 0 0 0 40 0 Khí quản (n =20) 14 70 40 20 20 0 0 Da (n = 20) 20 100 0 20 100 20 100 20 100 20 100 Trong đó: - n: số block nghiên cứu - n(+): số block dương tính 42 Qua bảng 4.6 cho thấy tỷ lệ quan bị sung huyết, thối hóa tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm chiếm tỷ lệ cao Các bệnh tích khác chiếm tỷ lệ thấp Cụ thể sau:  Da: Da quan có biến đổi đặc trưng rõ ràng nhất, xuất nhiều thể bao hàm Bollinger nguyên sinh chất tế bào, tượng sung huyết, thối hóa tế bào, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm chiếm tỷ lệ 100% Tế bào thượng bì tăng sinh nhanh, lớp tế bào thối hóa mỡ tạo thành túi nhỏ chứa chất quánh kem, xuất tích tụ bạch cầu phân biệt nốt đậu với mô xung quanh Các mụn đậu bề mặt da: lớp tế bào hạt tế bào gai thối hóa khơng bào, tế bào vỡ tạo thành bọc nước đội lớp sừng lên Khi có bạch cầu xâm nhiễm tạo thành mụn mủ hình thành vẩy bong đi, đơn virus đậu tác động nốt lt nơng, tế bào tầng phát sinh bị tổn thương nhẹ, tái sinh khơng thành sẹo Ngồi chúng tơi cịn tìm thấy thể bao hàm mụn đậu gà (thể bollinger tế bào chất) Các tế bào tăng sinh, có tượng hoại tử tế bào Những biến đổi thấy báo cáo kết Tanizaki et al., 1986; Yoshikkawa and Alam, 2002; Beytut and Haligur, 2007  Khí quản: Sung huyết (70%), xuất huyết (40%), hoại tử thối hóa tế bào (20%), niêm mạc tăng sinh có phát triển mạnh tế bào tiết niêm dịch, tế bào biểu mơ phồng lên Có tượng tích dịch phù lớp hạ niêm mạc Nguyên nhân thành mạch khí quản bị tổn thương bị phá vỡ nên thành phần máu chảy ngồi long mạch quản  Phổi: Phổi có biến đổi rõ ràng quan sát thấy nhiều tượng sung huyết (90%), có đám thâm nhiễm tế bào viêm (80%) Sau tượng xuất huyết thối hóa tế bào (40%), có đám vệt tế bào hoại tử (20%) Phổi sung huyết: Tổn thương quan sát thấy mao quản vách phế nang, phế quản giãn rộng chứa đầy hồng cầu lòng mạch Cùng với thâm nhiễm tế bào viêm nguyên nhân làm cho phổi sưng Bên cạnh biến đổi vi thể chủ yếu nêu trên, q trình nghiên cứu chúng tơi xác định số biến đổi khác ruột có tượng xuất huyết 43  Gan: Gan có vị trí xung yếu có chức phức tạp nên dễ bị tổn thương, diễn biến trình bệnh lý gan phụ thuộc vào thời gian tác nhân gây bệnh vào thể Sự tổn thương gan tập trung vào bệnh tích vi thể sung huyết, thối hóa tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm, hoại tử tế bào Sung huyết (80%), hoại tử tế bào (20%), thối hóa tế bào (70%), thâm nhiễm tế bào viêm (50%)  Tim: Có tượng sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm sung huyết (20%), thâm nhiễm tế bào viêm (40%)  Thận: Các tổn thương vi thể kẽ thận sung huyết, xuất huyết, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tượng thối hóa tế bào Trong tượng sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm tế bào chiếm tỷ lệ cao (50%) Ngoài ra, xuất huyết (30%), hoại tử thối hóa tế bào (20%) Sự xác định biến đổi vi thể khác tùy thuộc vào quan, phận, vị trí lấy mẫu kế phát bệnh khác gà mắc bệnh đậu Các biến đổi vi thể minh họa hình 4.3 Các kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả công bố (Deoki N Tripathy and Willie M Reed) 44 Lớp tế bào bị thối hóa mụn đậu gà (HE 10x) Lớp vẩy sừng hóa mụn đậu gà (HE 10x) Phổi sung huyết bệnh đậu gà (HE 10x) Sung huyết lớp hạ bì bệnh đậu gà (HE 20x) Thể bao hàm mụn đậu gà Thể bao hàm mụn đậu gà (HE 20x) (HE 40x) Hình 4.5 Một số hình ảnh bệnh tích vi thể 45 4.5 MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, SINH HÓA MÁU Ở GÀ MẮC BỆNH ĐẬU Máu tổ chức di dộng tạo thành từ thành phần hữu hình tế bào (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) huyết tương Chức máu cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào, tổ chức thể loại bỏ chất thải trình chuyển hóa thể khí cacbonic axid lactic Máu phương tiện vận chuyển tế bào (cả tế bào có chức bảo vệ thể tế bào bệnh lý) chất khác (các amino axit, lipid, hormone) tổ chức quan thể Do để thấy rõ rối loạn bệnh lý gà mắc bệnh đậu phải tiến hành xét nghiệm số tiêu sinh lý, sinh hóa gà Chúng tơi tiến hành lấy máu ngẫu nhiên gà hai đàn Một đàn gà biểu triệu chứng lâm sàng bệnh đậu, đàn gà khỏe Máu xử lý theo phương pháp thường quy phịng thí nghiệm Kết trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7 Một số tiêu huyết học gà mắc bệnh Chỉ tiêu nghiên cứu Gà ốm (x=10) Gà khoẻ (x=10) P X ± mx X ± mx Số lượng hồng cầu (Triệu/µl) 2,44 ± 0,13 2,53 ± 0,07 < 0,05 Tỷ khối huyết cầu (%) 31,78 ± 1,27 30,79 ± 0,69 >0,05 Hàm lượng Hb (g/l) 95,6 ± 0,42 96,1 ± 0,46