HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG THỊ THÚY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE BỔ TRỢ KEO PHÈN PHÒNG BÊNH PHÙ ĐẦU LỢN DO E.COLI DUNG HUYẾT GÂY RA THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Như Quán NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Như Qn mơn Ngoại-Sản tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Ngoại-Sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Cù Hữu Phú toàn thể cán công nhân viên Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thúy ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục sơ đồ hình ảnh viii Trích yếu luận văn………………………………………… ……… ……………………… ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Một số hiểu biết vi khuẩn E coli 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Kháng nguyên 2.1.3 Các yếu tố gây bệnh 2.1.4 Đặc tính ni cấy, sinh vật, hoá học 2.2 Bệnh phù đầu E coli gây 2.2.1 Triệu chứng 2.2.2 Bệnh tích 2.2.3 Chẩn đoán 10 2.2.4 Phòng bệnh 10 2.3 Bệnh phù đầu lợn 10 2.4 Các vacxin phòng bệnh phù đầu lợn 12 2.4.1 Các vacxin phòng bệnh phù đầu E coli gây 12 2.4.2 Vacxin phòng bệnh E coli gây nhập 13 iii Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 14 3.1 Địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Thời gian nghiên cứu 14 3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu 14 3.3.1 Vi khuẩn sử dụng chế tạo vaccine vơ hoạt phịng bệnh Phù đầu lợn lưu giữ Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine 14 3.3.2 Môi trường, hóa chất dùng nghiên cứu, sản xuất vaccine vơ hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn 14 3.3.3 Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 15 3.4 Nội dung nghiên cứu 15 3.5 Phương pháp nghiên cứu 16 3.5.1 Phương pháp giám định vi khuẩn 16 3.5.2 Phương pháp giám định vi khuẩn 16 3.4.4 Phương pháp giám định vi khuẩn 17 3.4.5 Phương pháp giám định vi khuẩn 17 3.5.6 Phương pháp giám định vi khuẩn 18 3.6 Phương pháp phân tích số liệu 21 Phần Kết thảo luận 22 4.1 Kết kiểm định giống E coli sản xuất vaccine 22 4.1.1 Kết kiểm tra số đặc tính ni cấy 22 4.1.2 Kết kiểm tra số đặc tính sinh hố vi khuẩn E coli 24 4.1.3 Kết kiểm tra serotype kháng nguyên O vi khuẩn E coli 26 4.1.4 Kết kiểm tra gen quy định sinh tổng hợp yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli 27 4.1.5 Kết kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn E coli chuột bạch 27 4.2 Quy trình sản xuất vaccine theo quy mô công nghiệp 28 4.2.1 Giống vi khuẩn E coli để sản xuất vaccine 29 4.2.2 Nhân giống vi khuẩn E coli môi trường thạch máu 29 4.2.3 Nhân giống vi khuẩn E coli môi trường lỏng 30 4.2.4 Bổ sung keo phèn vào canh trùng 32 4.2.5 Giai đoạn đóng chai, dán nhãn vaccine 32 4.2.7 Quá trình bảo quản vaccine 33 iv 4.3 Kết kiểm nghiệm vaccine sản xuất thử nghiệm 34 4.3.1 Kết kiểm tra số tiêu lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp 34 4.3.2 Kết kiểm tra khiết canh trùng sử dụng chế tạo vaccine 34 4.3.3 Kết kiểm tra vô trùng lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp 35 4.3.4 Kết kiểm tra an toàn chuột nhắt trắng 36 4.3.5 Kết kiểm tra hiệu lực chuột nhăt trắng 37 4.3.6 Kết kiểm tra an toàn vaccine lợn 39 4.3.7 Kết thử hiệu lực vaccine lợn 40 4.3.8 Kết xác định liều tiêm vaccine Phù đầu lợn 41 4.3.9 Kết xác định độ dài miễn dịch vaccine Phù đầu lợn 43 4.4 Kết thử nghiệm vaccine diện rộng 44 Phần Kết luận kiến nghị 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo 46 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ BHI : Brain Heart Infusion CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng DHL : Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA : DeoxyriboNucleic Acid ETEC : EnteroToxigenic E coli E coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay GDP : Guanin DiPhosphate GTP : Guanin TriPhosphate IHA : Indirect Haemagglutination test InvA : Invasion A LPS : LipoPolySaccharide PCR : Polymerase Chain Reaction RR : Relative Risk TSA : Tryptic Soya Agar TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VX : Vaccine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi công ty Fermentas cung cấp để xác định yếu tố độc lực bám dính vi khuẩn E coli 17 Bảng 4.1 Một số đặc tính ni cấy chủng vi khuẩn E coli 22 Bảng 4.2 Một số đặc tính sinh hố vi khuẩn E coli 25 Bảng 4.3 Serotyp kháng nguyên O chủng vi khuẩn E coli nghiên cứu 26 Bảng 4.4 Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen quy định sinh tổng hợp yếu tố gây bệnh 27 Bảng 4.5 Độc lực 10 chủng vi khuẩn E coli chuột bạch 28 Bảng 4.6 Kết kiểm tra đậm độ lô vaccine 34 Bảng 4.7 Kết kiểm tra khiết lô canh trùng sử dụng chế tạo vaccine 35 Bảng 4.8 Kết kiểm tra vô trùng vaccine chế tạo 35 Bảng 4.9 Kết kiểm tra an toàn vaccine chuột nhắt trắng 37 Bảng 4.10 Kết kiểm hiệu lực vaccine chuột nhắt trắng 38 Bảng 4.11 Kết kiểm tra an toàn vaccine lợn 39 Bảng 4.12 Kết đánh giá hiệu lực vaccine lợn 40 Bảng 4.13 Kết xác định kháng thể lợn tiêm vaccine với liều tiêm khác 42 Bảng 4.14 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn tiêm vaccine 43 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH Sơ đồ 4.1 Quy trình sản xuất vaccine vơ hoạt phù đầu lợn có bổ trợ keo phèn 19 Hình 4.1 Hình thái vi khuẩn E coli mọc thạch máu 23 Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn E coli soi kính hiển vi quang học 23 Hình 4.3 Cấy nhân giống vi khuẩn E coli thạch máu 29 Hình 4.3 Vi khuẩn E coli giống nhỡ ni cấy tủ lắc 30 Hình 4.4 Máy lên men sục khí 15 lít SATORIUS CHLB Đức 31 Hình 4.5 Máy lên men sục khí 120 lit SATORIUS CHLB Đức 32 Hình 4.6 Hệ thống chai tự động Ý 33 Hình 4.7 Dây truyền dán nhãn tự động 33 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hồng Thị Thúy Tên luận văn: “Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn E coli dung huyết gây theo quy mô công nghiệp” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Đánh giá đươc quy trình sản xuất vaccine quy mơ cơng nghiệp, quy trình kiểm nghiệm, sử dụng bảo quản vaccine vơ hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn vi khuẩn E coli dung huyết gây Phương pháp: Phương pháp giám định vi khuẩn Phương pháp xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn phân lập kỹ thuật PCR Phương pháp kiểm tra độc lực vi khuẩn động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn Kết kết luận: chủng vi khuẩn E coli phân lập sử dụng để chế vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn đại diện cho chủng vi khuẩn gây bệnh phù đầu lợn trước sau cai sữa tỉnh, sau bảo quản thời gian dài dạng thạch lỏng đông khô, mang đầy đủ đặc điểm sau: + Mang đầy đủ đặc tính hình thái, ni cấy, sinh hóa chủng gây bệnh tự nhiên + Mang gen quy định sinh tổng hợp yếu tố gây bệnh ổn định sau lưu giữ sau thời gian dài thạch lỏng Glycerin đông khô + Có độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm vịng 24 Các lơ vaccine chế tạo quy mô công nghiệp đạt tiêu về: + Phương pháp lên men sục khí canh trùng nuôi cấy đạt đậm độ vi khuẩn: từ 17 x 10 vi khuẩn/ml + Vô trùng Formol 0,5% đạt kết 100% vô trùng kiểm tra môi trường thạch máu, nước thịt, môi trường yếm khí thạch nấm ix giống nhỏ đến nhỡ lớn mô tả phần phương pháp Kết trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết kiểm tra khiết lô canh trùng sử dụng chế tạo vaccine Kiểm tra kết Môi trường Đánh giá Lô I Lô II Lô III Thạch thường Thuần khiết Thuần khiết Thuần khiết Đạt Thạch máu Thuần khiết Thuần khiết Thuần khiết Đạt Nước thịt gan yếm khí Thuần khiết Thuần khiết Thuần khiết Đạt Thạch macconkey Thuần khiết Thuần khiết Thuần khiết Đạt Qua bảng 4.7 cho thấy: Canh trùng dùng để chế tạo lô vaccine thử nghiệm đạt tiêu khiết Trên môi trường thạch máu, thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt gan yếm khí,… ni cấy riêng biệt với loại canh trùng loại vi khuẩn khác ba lô vaccine I, II III có vi khuẩn E coli phát triển 4.3.3 Kết kiểm tra vô trùng lô vaccine sản xuất theo quy mô công nghiệp Sau tiến hành vô hoạt vi khuẩn formol 0,5%, để tủ ấm 37oC/24 giờ, tiến hành kiểm tra vô trùng cách nuôi cấy loại môi trường khác Bảng 4.8 Kết kiểm tra vô trùng vaccine chế tạo Số TT Lô vaccine Kết kiểm tra Đánh giá Thạch máu Thạch MacConkey Nước thịt BHI Lô I Không mọc Không mọc Không mọc Đạt Lô II Không mọc Không mọc Không mọc Đạt Lô III Không mọc Không mọc Không mọc Đạt 35 Kết cho thấy lô vaccine sau vô hoạt Formol 0,5% đạt yêu cầu Mỗi loại môi trường cấy kiểm tra ống; ống môi trường sau cấy bồi dưỡng tủ ấm 37oC Qua bảng 4.8 cho thấy: Trong loại môi trường thạch máu, thạch Mac Conkey, nước thịt dùng để kiểm tra tiêu vô trùng vaccine không quan sát thấy loại vi khuẩn mọc qua thời gian ngày theo dõi Kết kiểm tra vô trùng tác giả Lê Thị Tuyết Lan, 2009 thông báo tương tự Như vậy, lô vaccine chế thử nghiệm đạt tiêu vô trùng tất giai đoạn canh trùng sử dụng chế tạo vaccine sau vô hoạt formol 0,5% 4.3.4 Kết kiểm tra an toàn chuột nhắt trắng Dựa vào Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vaccine dùng Thú y Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn (2003) Điều khẳng định vaccine đạt yêu cầu độ an toàn động vật thí nghiệm tiến hành kiểm tra hiệu lực vaccine động vật thí nghiệm Kiểm tra an toàn chuột nhắt trắng: chọn 10 chuột khoẻ mạnh để tiêm vaccine, tiêm phúc xoang với liều 0,5 ml/con (gấp 2,5 lần liều miễn dịch), tiêm tĩnh mạch đuôi với liều 0,2ml/con Theo dõi 10 ngày Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.9 Qua bảng 4.9 cho thấy: Với đường tiêm phúc xoang tĩnh mạch đuôi cho chuột nhắt trắng lô vaccine chế tạo thử nghiệm, chuột tiêm phúc xoang tĩnh mạch đuôi sống khỏe mạnh qua thời gian 10 ngày theo dõi Kết nghiên cứu tương tự kết luận Lê Thị Tuyết Lan, 2009; Vũ Khắc Hùng cs (2014), nghiên cứu an toàn hiệu lực vaccin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu, phó thương hàn lợn quy mơ phịng thí nghiệm đánh giá tiêu an tồn thấy động vật thay hoàn toàn khỏe mạnh sau ngày tiêm 36 Bảng 4.9 Kết kiểm tra an tồn vaccine chuột nhắt trắng Lơ vaccine 10 Thử an toàn Đường tiêm Đánh giá Liều tiêm Số tiêm Số sống (ml/con) (con) (con) Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt Phúc xoang 0.5 5 Đạt Tĩnh mạch đuôi 0.2 5 Đạt 4.3.5 Kết kiểm tra hiệu lực chuột nhăt trắng Kiểm tra hiệu lực chuột bạch: lô vaccine chọn 10 chuột khoẻ, tiêm 0,2 ml vaccine vào da Sau 21 ngày, chuột tiêm miễn dịch với chuột đối chứng đem thử thách với chủng cường độc với liều 10 LD50 cho chuột Toàn chuột theo dõi 10 ngày Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.10 37 Bảng 4.10 Kết kiểm hiệu lực vaccine chuột nhắt trắng Thử hiệu lực Lô Lô vaccine chuột Liều tiêm Số Liều thử Số Tỷ lệ MD tiêm thách cường sống/số bảo hộ (ml/con) (con) độc thử thách (%) TN 0,2 10 10 LD50 9/10 90 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 7/10 70 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 7/10 70 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 7/10 80 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 7/10 70 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 8/10 80 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 7/10 70 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 9/10 90 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 8/10 80 ĐC 10 LD50 0/5 TN 0,2 10 10 LD50 9/10 90 ĐC 10 LD50 0/5 10 38 (ĐC:Đối chứng, TN: Thí nghiệm) Các lơ thí nghiệm, chuột tiêm miễn dịch với liều 0,2 ml/con sống khoẻ mạnh sau tuần thử thách cường độc với liều 10LD50 có 7090% số chuột bảo hộ Trong chuột đối chứng sau cơng cường độc chết 100% vòng 24-48 phân lập vi khuẩn E coli từ máu tim chuột chết Tổng hợp kết kiểm tra an toàn hiệu lực vaccine chuột bạch lô vaccine chế thử, so sánh với tiêu chuẩn Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Quốc gia kiểm nghiệm vaccine chết có bổ trợ keo phèn, cho phép đánh giá: 10 lô vaccine đạt tiêu an tồn 100% có hiệu lực bảo hộ cao chuột bạch (từ 70-90%), đủ tiêu chuẩn để kiểm tra động vật 4.3.6 Kết kiểm tra an tồn vaccine lợn Chúng tơi tiến hành thí nghiệm kiểm tra an tồn vaccine lợn với liều tiêm gấp đôi gấp ba liều tiêm miễn dịch với đường tiêm lứa tuổi lợn khác Các lợn sau tiêm theo dõi vòng ngày phản ứng cục toàn thân biểu lâm sàng như: phù đầu, phù mặt, co giật, tiêu chảy, Kết trình bày bảng 4.9 Bảng 4.11 Kết kiểm tra an tồn vaccine lợn Lơ vaccine 1 Liều tiêm vaccine (ml/con) ml/con ml/con Lứa tuổi Số tiêm vaccine (con) tuần 6 tuần tuần tuần 6 tuần tuần Đường Địa điểm Phản ứng sau tiêm Thí nghiệm tiêm vaccine - Bình thường Dưới da TP Hà Nội - Bình thường - Bình thường - Bình thường Dưới da Bắc Giang - Bình thường - Bình thường Qua theo dõi lợn thử an toàn vaccine cho thấy: Sau tiêm xong, có lợn tuần tuổi tiêm vaccine liều 2ml/con lợn tuần tuổi 39 tiêm vaccine liều 3ml/con có tượng run, sau trở lại bình thường Tiếp tục theo dõi số lợn đến 70 ngày tuổi khơng thấy có biểu ỉa chảy, phù đầu, phù mặt hay co giật Như số 35 lợn thử vaccine liều an tồn có lợn có phản ứng phụ khơng đáng ngại chứng tỏ vaccine có độ an toàn cao tiêm da, tiện lợi cho người sử dụng 4.3.7 Kết thử hiệu lực vaccine lợn Để đánh giá hiệu lực vaccine lợn, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sau: + Lơ thí nghiệm: gồm 17 lợn 21 ngày tuổi thuộc đàn khác tiêm vaccine E coli với liều ml/con vào da gốc tai Theo dõi phản ứng cục tồn thân + Lơ đối chứng: gồm lợn 21 ngày tuổi không tiêm vaccine Các lợn nuôi chuồng có điều kiện chăm sóc ni dưỡng giống Sau 21 ngày, tiến hành công cường độc hỗn hợp chủng vi khuẩn dùng sản xuất vaccine Theo dõi 10 ngày Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết đánh giá hiệu lực vaccine lợn Tiêm vaccine Lô lợn ĐC Kết Số lợn TN Liều tiêm vaccine TN Công cường độc ml ml ml Đường tiêm Dưới da Dưới da Dưới da Liều tiêm (canh Số VK/lợn trùng) Đường tiêm Số Tỷ lệ sống/số bảo hộ công (%) ml x 7,9 x 108 Phúc mạc 5/5 100 ml x 7,9 x 108 Tiêm bắp 5/5 100 10 ml 10 x 7,9 x 108 Cho uống 7/7 100 ml x 7,9 x 108 Phúc mạc 0/5 ( TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng) 40 Kết thí nghiệm cho thấy: + Lơ thí nghiệm: Sau tiêm vaccine, 17 lợn lơ thí nghiệm khoẻ mạnh, ăn uống, lại bình thường Đến ngày thứ 21, tiến hành công cường độc cho lợn liều ml canh trùng/con vào phúc mạc, lợn liều 2ml canh trùng/con vào bắp đùi lợn cho uống canh trùng liều 10ml canh trùng/con Theo dõi sau 18 ngày thấy 17 lợn khoẻ mạnh phát triển bình thường + Lơ đối chứng: lợn không tiêm vaccine sau công cường độc với liều ml canh trùng/con vào phúc mạc lợn có biểu triệu chứng bệnh chết sau 36- 52 Mổ khám thấy có bệnh tích điển lợn mắc bệnh tự nhiên, đồng thời phân lập lại vi khuẩn E coli từ máu tim lợn 4.3.8 Kết xác định liều tiêm vaccine Phù đầu lợn Nhằm xác định liều tiêm vaccine phù đầu lợn phù hợp, để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau tiêm vaccine đạt hiệu cao có độ dài miễn dịch dài nhất, tiến hành xác định liều tiêm vaccine đàn lợn nuôi sau: ô lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm nhóm khác nhau, nhóm lợn thí nghiệm có lợn tuần tuổi Sau tiến hành tiêm cho lợn thí nghiệm sau: - Nhóm 1: Tiêm vaccine Phù đầu cho lợn với liều tiêm 1ml/con, da sau hốc tai - Nhóm 2: Tiêm vaccine Phù đầu cho lợn liều 1ml/con/mũi với mũi tiêm cách ngày, tiêm da sau hốc tai - Nhóm 3: Tiêm vaccine Phù đầu cho lợn liều tiêm 2ml/con /mũi, tiêm da sau hốc tai Lợn thí nghiệm đánh số từ KT1 đến KT15 Trong đó: Lợn ký hiệu KT1 đến KT5 lợn nhóm 1, từ KT6 đến KT10 lợn nhóm từ KT11 đến KT15 lợn thuộc nhóm Trước tiêm vaccine tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể, sau tiêm 21 ngày, lấy máu lợn thí nghiệm để xác định hàm lượng kháng thể kháng lại vi khuẩn E coli có máu lợn tiêm phịng vaccine Dựa kết hàm lượng kháng thể có máu lợn nhóm khác nhau, xác định liều tiêm vacxin cho lợn phù hợp đạt hiệu lực phòng bệnh phù đầu cho lợn cao Kết trình bày bảng 4.13: 41 Bảng 4.13 Kết xác định kháng thể lợn tiêm vaccine với liều tiêm khác Kết xác định hiệu giá kháng thể TT Mẫu HT Trước tiêm VX Sau tiêm VX E.coli KT1 - 1/32 KT2 - 1/32 KT3 - 1/32 KT4 - 1/32 KT5 - 1/32 KT6 - 1/32 KT7 - 1/32 KT8 - 1/32 KT9 - 1/32 10 KT10 - 1/64 11 KT11 - 1/32 12 KT12 - 1/32 13 KT13 - 1/32 14 KT14 - 1/32 15 KT15 - 1/32 Liều tiêm VX 1ml/con Tiêm mũi 1ml/con Tiêm mũi cách ngày 2ml/con Tiêm mũi Kết bảng 4.13 cho thấy 15 lợn lơ thí nghiệm tiêm vaccine lấy mẫu máu kiểm tra trước tiêm vaccine âm tính sau tiêm vaccine có kháng thể tương ứng với thành phần vi khuẩn E coli Kết cho thấy: Ở nhóm tiêm mũi với liều tiêm 1ml/con, sau tiêm vaccine 21 ngày, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn E coli cao 1/32 Lợn nhóm 2: Tiêm mũi với liều tiêm 1ml/con, sau tiêm vaccine 21 ngày, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn E coli cao đạt 1/32 đến1/64 Lợn nhóm 3: Tiêm mũi với liều tiêm 2ml/con, sau tiêm vaccine 21 ngày, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn E coli đạt hiệu giá 1/32 42 Kết cho thấy: Khơng có khác biệt lớn liều tiêm 1ml/con/1 lần với liều 1ml/con/2 lần 2ml/con/1 lần tiêm Như đánh giá liều tiêm vaccine cho lợn đạt hiệu lực bảo hộ tốt tiêm vaccine Phù đầu lợn mũi, với liều tiêm 1ml/con /mũi cách ngày, tiêm da sau hốc tai Nhưng với kiện thực tiễn sản xuất, cần tiêm liều tiêm thích hợp 1ml/con/1 lần Với hiệu giá kháng thể đạt máu lợn sau tiêm 21 ngày, đánh giá sau tiêm vaccine tháng có hiệu lực bảo hộ đàn lợn 100% với vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu lợn 4.3.9 Kết xác định độ dài miễn dịch vaccine Phù đầu lợn Chúng tiến hành chọn 10 lợn khoẻ mạnh 30 – 35 ngày tuổi tiêm vaccine với liều ml/con/mũi da sau hốc tai Các lợn thí nghiệm đánh số tai nuôi chung ô chuồng rộng xác định trọng lượng trung bình trước sau tiêm vaccine thử nghiệm Tiến hành theo dõi trạng thái biểu lâm sàng lợn trước sau tiêm vaccine Tiến hành lấy máu vào thời điểm: trước tiêm vaccine sau tiêm vaccine mũi vào ngày thứ 21, tháng, tháng tháng Xác định mức độ đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vacxin phản ứng ngưng kết, hiệu giá ngưng kết phải đạt ≥ 1/16 sau tháng lợn tiêm vacxin Kết xác định độ dài miễn dịch thể bảng 4.14 Bảng 4.14 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn tiêm vaccine Kết xác định hiệu giá kháng thể TT Mẫu HT Sau tiêm VX Trước tiêm VX 21 ngày tháng tháng tháng PP1 - 1/32 1/32 1/16 1/16 PP2 - 1/32 1/16 1/16 1/16 PP3 - 1/64 1/32 1/32 1/16 PP4 - 1/32 1/32 1/32 1/16 PP5 - 1/32 1/32 1/16 1/16 PP6 - 1/32 1/32 1/32 1/16 PP7 - 1/64 1/16 1/16 1/16 PP8 - 1/32 1/32 1/16 1/16 PP9 - 1/32 1/32 1/32 1/16 10 PP10 - 1/32 1/32 1/32 1/16 43 Kết bảng 4.14 cho thấy 10 lợn tiêm vaccine lấy mẫu máu kiểm tra trước tiêm vaccine âm tính sau tiêm vaccine có kháng thể tương ứng với vi khuẩn E coli 4.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VACCINE TRÊN DIỆN RỘNG Trên sở kết thử nghiệm vaccine thu phịng thí nghiệm, tiến hành thử nghiệm vaccine địa bàn số tỉnh Chúng tiến hành thử nghiệm vaccine địa bàn số tỉnh thuộc vùng Đồng sông Hồng Hà Nội, Vĩnh phúc, Hưng Yên, Thái Bình Hải Phịng Tiêm vaccine cho lợn 3- tuần tuổi, liều 1ml/con vào da gốc tai Theo dõi an toàn vaccine phương pháp theo dõi trực tiếp đánh giá hiệu phòng bệnh vaccine phương pháp so sánh tỷ lệ lớn ốm, chết nơi tiêm nơi chưa tiêm, năm trước chưa tiêm vaccine năm tiêm vaccine + Toàn số lợn tiêm vaccine khơng có biểu bệnh phù đầu + Vaccine E coli vơ hoạt keo phèn hồn tồn an tồn với lợn từ tuần tuổi trở lên với liều tiêm thích hợp ml/con + Các lợn trước sau cai sữa tiêm vaccine phát triển bình thường có khả bảo hộ chống lại bệnh phù đầu Kết theo dõi an toàn vacxin diện rộng trong thời gian qua, chúng tơi có số nhận xét sau: + Tại tỉnh thử nghiệm vaccine: theo báo cáo Chi cục Thú y triển khai tiêm phòng cho huyện tỉnh với số đầu lợn tiêm 100.000 Qua theo dõi thấy tỷ lệ lợn khơng có biểu bệnh 80%, nhiên, sau tiêm có lợn có biểu phản ứng phụ (chiếm 0.1%) run, tăng hô hấp, tiêu chảy nhẹ, sau tự khỏi dùng kháng sinh điều trị sau ngày khỏi Nhìn chung, số lợn tiêm vaccine phòng bệnh phù đầu, số lợn có phản ứng phụ thấp, khơng ảnh hưởng đến tăng trọng phát triển lợn Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn E coli phân lập sử dụng làm giống chế vaccine bảo quản dạng thạch lỏng đơng khơ có mang đầy đủ yếu tố gây bệnh gây bệnh phù đầu lợn trước sau cai sữa Vaccine E coli chế tạo từ chủng vi khuẩn điển hình phân lập đảm bảo tiêu vô trùng, an tồn hiệu lực phịng thí nghiệm có khả tạo miễn dịch phịng hộ lợn thử sản xuất diện rộng 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau đây: chủng vi khuẩn E coli phân lập sử dụng để chế vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn đại diện cho chủng vi khuẩn gây bệnh phù đầu lợn trước sau cai sữa tỉnh, sau bảo quản thời gian dài dạng thạnh lỏng đông khô, mang đầy đủ đặc điểm sau: + Mang đầy đủ đặc tính hình thái, ni cấy, sinh hóa chủng gây bệnh tự nhiên + Mang gen quy định sinh tổng hợp yếu tố gây bệnh ổn định sau lưu giữ sau thời gian dài thạnh lỏng Glycerin đơng khơ + Có độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm vịng 24 Các lơ vaccine chế tạo quy mô công nghiệp đạt tiêu về: + Bằng phương pháp lên men sục khí canh trùng ni cấy đạt đậm độ vi khuẩn: từ 17 x 109 vi khuẩn/ml + Vô trùng Formol 0,5% đạt kết 100% vô trùng kiểm tra môi trường thạch máu, nước thịt, mơi trường yếm khí thạch nấm Các lơ vaccine chế tạo quy mô công nghiệp đạt tiêu về: + Khi thử nghiệm chuột bạch, đạt tiêu an toàn 100% với liều tiêm 0.5ml/chuột với đường tiêm vào phúc xoang hiệu lực bảo hộ đạt từ 70-90% + Với liều tiêm gấp đôi gấp ba liều tiêm miễn dịch: vaccine an toàn 100% với lợn từ 21 ngày tuổi Vaccine thử nghiệm diện rộng đạt tiêu an toàn cao với liều tiêm ml/con tạo miễn dịch phòng hộ tốt 5.2 KIẾN NGHỊ Cho sử dụng vaccine chế quy mô công nghiệp từ chủng phân lập để phòng bệnh phù đầu cho lợn từ 21 ngày tuổi tất tỉnh toàn quốc 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Trung Trực, Nguyễn Việt Nga, Thái Quốc Hiếu, Lê Thanh Hiếu, Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân (2004) Phân lập định typ kháng nguyên vi khuẩn E Coli phân heo nái, heo tỉnh Tiền Giang Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, (1) Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Đỗ Ngọc Thuý, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường Đào Thị Hảo (2004) Lựa chọn chủng E coli để chế tạo Autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn theo mẹ Viện Thú Y 35 năm xây dựng phát triển (1969 – 2004) NXB Nông nghiệp, Hà Nội Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh Đỗ Ngọc Thuý (2000) Kết phân lập vi khuẩn E coli Salmomella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định số đặc tính sinh hố học chủng vi khuẩn phân lập biện pháp phòng trị Kết nghiên cứu KHKT Thú Y 1996 – 2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Chủng sản xuất vaccine Báo cáo Hội thảo REI, Hà Nội Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ Huỳnh Văn Kháng (1996) Bệnh lợn nái lợn NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 57 – 147 Hoàng Thuỷ Nguyên, Đặng Đức Trạch, Ninh Đức Dự, Nguyễn Hồng Việt, Nguyễn Thị Kê Lê Thị Oanh (1974) Vi sinh vật Y học, tập NXB Y học, Hà Nội Laval A (2000) “Dịch tễ Salmonellosis” Báo cáo hội thảo bệnh lợn Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch Trần Thị Hạnh – Viện Thú y Lê Văn Tạo (1997a) Bệnh Escherichia coli gây Những thành tựu nghiên cứu phịng chống bệnh vật ni, tài liệu giảng dạy sau đại học cho bác sĩ thú y kỹ sư chăn nuôi Viện thú y quốc gia, Hà Nội Lê Văn Tạo cs (1993) Nghiên cứu chế tạo vacxin E coli uống phòng bệnh phân trắng lợn Tạp trí Nơng nghiệp cơng nghiệp thực phẩm, 9/1993, Hà Nội 10 Lê Văn Tạo cs (1996) Xác định yếu tố gây bệnh di truyền Plasmid vi khuẩn E coli phân lập từ lợn bị bệnh phân trắng chọn 11 Nguyễn Bá Hiên (2001) Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp biến động chúng gia súc khỏe mạnh bị tiêu chảy nuôi vùng ngoại thành Hà Nội Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 46 12 Nguyễn Khả Ngự (2000) Xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli bệnh phù đầu lợn đông sơng Cửu Long, chế vacxin phịng bệnh Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội 13 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Văn Đức, Đặng Hồng Mai Nguyễn Vĩnh Phước (1976) Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật, tập NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 14 Nguyễn Như Thanh (2001) Dịch tễ học thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội 15 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (1997) Vi sinh vật thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội 16 Nguyễn Thị Kim Lan (2004) Thử nghiệm phòng trị bệnh coli dung huyết cho lợn Thái Nguyên Bắc Giang Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y XII (3) 17 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở Trần Thị Thu Hà (1989) Nghiên cứu vaccine đa giá Salco phòng bệnh ỉa chảy cho lợn Kết qủa nghiên cứu KHKT Thú y 1985 –1989, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn Vĩnh Phước (1974) Vi sinh vật Thú y, tập NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 19 Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân Trương Văn Dung (1997) Bệnh phổ biến lợn biện pháp phịng trị NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 20 Trịnh Quang Tuyên (2004) Phân lập xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli từ lợn bị tiêu chảy nuôi trại lợn Tam Điệp Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y (4) 21 Trương Quang (2005) Kết nghiên cứu vai trò gây bệnh E coli hội chứng tiêu chảy lợn – 60 ngày tuổi Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú Y XII (1) 22 Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002) Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam Viện Thú y Quốc gia Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản 23 Vũ Khắc Hùng, M pilipcinec (2004) Nghiên cứu so sánh yếu tố độc lực chủng E coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy cộng hòa Slovakia Báo cáo khoa học chăn nuôi Thú y, Hà Nội Tiếng Anh: Bergey’s (1994) Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company 47 Carter G.R, Chengapa.M.M, Rober T.S.A.W (1995) Essentials of veterinary Microbiology A warerly Company, 1995 Casey, T A., Nagy, B & Moon, H W (1992) Pathogenicity of porcine enterotoxigenic Escherichia coli that not express K88, K99, F41, or 987P adhesins American Journal of Veterinary Research 53 Dean E A, Whipp S C & Moon H W (1989) Age-specific colonization of porcine intestinal epithelium by 987P-piliated enterotoxigenic Escherichia coli Infection and Immunity 57 Dean-Nystrom E A & Samuel, J E (1994) Age-related resistance to 987P fimbria-mediated colonization correlates with specific glycolipid receptors in intestinal mucus in swine Infection and Immunity 62 Ewing, Edward (1970) Indentification of Enterobacteriaceae Edicion Revolucionnalria, Instituto Cubano Del libro 19 No 1002, Vedado Habana Fairbrother.J.M (1992) Enteric colibacillosis Diseases of swine IOWA State University Press/AMES, IOWA U.S.A 7th Edition, 1992 Giannella, R A (1976) Suckling mouse model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model Infection and Immunity 14 Guinee, P A M & Jansen, W H (1979) Behavior of Escherichia coli K antigens K88ab, K88ac, and K88ad in immunoelectrophoresis, double diffusion, and haemagglutination Infection and Immunity 23 10 Isaacs.on, R E., Nagy, B & Moon, H W (1977) Colonization of porcine small intestine by Escherichia coli: Colonization and adhesion factors of pig enteropathogens that lack K88 Journal of Infectious Diseases 135 11 Ketyle I Emodyl, Kentrohrt (1975) Mouse lang Oedema caused by a toxin substance of Escherichia coli strains Acta Microbiol, A cad-Sci Hung-25 12 Links, I., Love, R & Greenwood, P (1985) Colibacillosis in newborn piglets associated with class enterotoxigenic Escherichia coli In Infectious diarrhoea of the young: strategies for control in humans and animals, pp 281-287 Edited by S Tzipori Geelong, Australia: Elsevier Science Publishers 13 Morris I.A, Wray C, Sojka W.J (1976) “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a get E mutant of Salmonella typhymurium” Bristh J of Exp 48 14 Nagy, B., Arp, L H., Moon, H W & Casey, T A (1992) Colonization of the small intestine of weaned pigs by enterotoxigenic Escherichia coli that lack known colonization factors Veterinary Pathology 29 15 Nagy, B., Awad-Masalmed, M., Bodoky, T., Munch, P & Szekrenyi, M T (1996) Association of shiga-like toxin type II (SLTII) and heat stable enterotoxins with F18ab, F18ac, K88 and F41 fimbriae of Escherichia coli from weaned pigs In Proceedings of 14th Congress International Pigs Veterinary Society, pp 264 Bologna Italy 16 Nagy, B & Fekete, P Z (1999) Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals Veterinary Research 30 17 Orskov, I Orskov, F Sojka, W.J Wittig, W (1964) K antigens K88ab (L) and K88ac (L) in E coli A new O antigen: O147 and a new K antigen K89 (B) Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica sect, B 62 18 Orskov, F (1978) Vilurence Factor of the bacterial cell surface J Infect 19 Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England 20 Rippinger.P., Bertschinger.H U., Imberechts.H., Nagy.B., Sorg.I., Stamm.M., Wild.P & Wittig W (1995) Designations F18ab and F18ac for the related fimbrial types F107, 2134P and 8813 of Escherichia coli isolated from porcine postweaning diarrhoea and from oedema disease Veterinary Microbiology 45 21 Selbitz H.J (1995) Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren Berl Much Tieruzl Wschr, 144 22 Smith.H.W & Halls.S (1967) Observations by the ligated segment and oral inoculation methods on Escherichia coli infections in pigs, calves, lambs and rabbits Journal of Pathology and Bacteriology 93 23 Timoney J.F, Gillespie J.H, Baelough J.E, Hagan and Bruner’s (1988) “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press 49 ... Phù đầu lợn vi khuẩn E coli dung huyết gây 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu sản xuất vaccine bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu lợn E coli dung huyết gây theo quy mô công nghiệp - Xác định hiệu... bổ trợ keo phèn phịng bệnh Phù đầu lợn theo quy mơ cơng nghiệp - Quy trình sử dụng bảo quản vaccine vơ hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn theo quy mô công nghiệp 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteropathogenic E coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E coli (AEEC) Verotoxingenic E coli (VTEC) Trong đó, chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC VTEC thường gây bệnh tiêu