ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN .14 1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 14 1.1.1 Cấu trúc axit phytic 14 1.1.2 Sự phân bố phytate tự nhiên chức phytate 15 1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng axit phytic 17 1.1.4 Ảnh hưởng phytic tới môi trường 21 1.2 PHYTASE 21 1.2.1 Chức phytase 21 1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa phytase 22 1.2.3 Nguồn phytase tự nhiên .23 1.2.4 Phân loại phytase 24 1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP) 25 1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys) 26 1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases 27 1.2.5 Gen mã hóa phytase 27 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất phytase từ vi sinh vật 29 1.2.6.1 Các yêu tố vật lý 29 1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 30 1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase 31 1.2.8 Các ứng dụng phytase 33 1.2.8.1 Ứng dụng phytase phụ gia thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản… .33 1.3 1.2.8.2 Ứng dụng phytase công nghiệp thực phẩm 35 1.2.8.3 Ứng dụng phytase cải tạo đất 36 1.2.8.4 Ứng dụng phytase dược phẩm .36 1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase .37 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE 37 1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt phytase 37 1.3.2 Nghiên cứu thay đổi pH hoạt động tối ưu phytase 38 1.3.3 Nghiên cứu khả bền axit enzyme protease phytase .39 1.3.4 Nghiên cứu tăng hiệu suất trình sản xuất phytase 40 1.3.5 Nghiên cứu động vật thực vật chuyển gen phytase .41 1.3.6 Những nghiên cứu phytase Việt Nam 41 1.4 LÊN MEN XỐP 43 1.4.1 Khái niệm lên men xốp 43 1.4.2 Những ưu điểm nhược điểm lên men xốp 44 1.4.3 Các ứng dụng lên men xốp .46 1.4.3.1 Sản xuất axit hữu 47 1.4.3.2 Sản xuất hợp chất tạo hương tạo vị 47 1.4.3.3 Sản xuất enzyme 47 1.4.3.4 Sản xuất Fructooligosaccharides 47 1.4.3.5 Sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học .48 1.4.3.6 Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học .48 1.4.3.7 Sản xuất cồn sinh học 48 1.5 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS 48 1.6 THU HỒI ENZYME 53 1.6.1 Chiết rút enzyme 53 1.6.2 Cô đặc enzyme – tủa enzyme .53 1.6.2.1 Tủa enzyme muối ammonium sulfate 53 1.6.2.2 Tủa dung môi hữu 54 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .56 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 56 2.1.1 Chủng vi sinh vật 56 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 56 2.1.2.1 Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt môi trường nhân giống 56 2.1.2.2 Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media)…………… 56 2.1.2.3 Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase 56 2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp 57 2.1.3 Thiết bị 58 2.1.4 Hóa chất 58 2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 59 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase .59 2.2.2 Tuyển chọn chủng 61 2.2.3 Phương pháp xác định khả sinh trưởng .61 2.2.4 Phương pháp phân loại 61 2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN .61 2.2.4.2 Quan sát hình thái 65 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh phytase chủng vi sinh vật nghiên cứu .66 2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện ni cấy giống thích hợp cho khả sinh trưởng chủng nghiên cứu .66 2.2.5.2 Nghiên cứu điều kiện ni cấy xốp thích hợp cho khả tổng hợp phytase chủng nghiên cứu 67 2.2.6 Thu hồi enzyme 68 2.2.6.1 Chiết xuất enzyme 68 2.2.6.2 Thu hồi enzyme dung môi hữu 68 2.2.7 Nghiên cứu enzyme phytase 69 2.2.7.1 Gen mã hóa phytase .69 2.2.7.2 Các đặc tính enzyme 70 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 72 3.1.1 Lựa chọn chủng ưa nhiệt .72 3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao .72 3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt 73 3.2 PHÂN LOẠI 74 3.2.1 Xác định trình tự ADNr 16S 74 3.2.2 Đặc điểm hình thái 77 3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 78 3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 78 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 81 3.4 THU HỒI ENZYME 88 3.4.1 Thu hồi enzyme dung dịch chiết khác 88 3.4.2 Tủa enzyme dung môi khác 89 3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 90 3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase so sánh với lồi có quan hệ gần gũi……… 90 3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô……… 90 DANH MỤC TÀI LIÊU THAM KHẢO 93 DANH MỤC BẢNG, HÌNH Tên bảng Trang Bảng Hàm lượng phosphor phytate số loại thức ăn gia cầm phổ biến Bảng Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……………………………… 47 Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL………………………………………………………………………… 53 Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S………………… 54 Bảng Hoạt tính phytase chủng SP1901 D15 lên men xốp lên men dịch thể 63 o Bảng Độ bền nhiệt chủng SP1901 D15 60 C………………………… Tên hình 64 Trang Hình Cấu trúc axit phytic đề xuất Neuberg, 1908 (A) Anderson, 1914 (B)………………………………………………………………………………… Hình Sự tương tác ion kim loại với IP6……………………………………… Hình Sự liên kết IP6 với protein tinh bột trực tiếp (A) gián tiếp (B)…… 10 Hình Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate……………………………… 12 Hình Cấu trúc khơng gian phyA từ A niger NRRL 3135……………………… 16 Hình Mơ hình cấu trúc phytase β-propeller………………………………………… 17 Hình Lên men xốp túi nilon……………………………………………… 34 Hình Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc………………………………………… 50 Hình Sinh trưởng vịng phân giải phytase chủng SP1901 (trái) D15 (phải) PSM……………………………………………………………………… ……… 62 Hình 10 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 lồi Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự AND r16S……………………………………… 65 Hình 11 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 lồi thuộc nhóm Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL 16S rRNA…………………………………………………………………………………… 66 Hình 12 Hình thái tế bào (trái) khuẩn lạc (phải) chủng SP1901……………… 67 Hình 13 Mơi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901…………………………… 68 Hình 14 pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………………… 69 Hình 15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………………… 69 Hình 16 Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………… 70 Hình 17 Chế độ thơng khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………… 70 Hình 18 Cơ chất thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901……………………… 71 Hình 19 Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901……………………… 72 Hình 20 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp chủng SP1901………… 72 Hình 21 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh khối hoạt tính phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… 74 Hình 22 Nguồn bon thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901 (Đối chứng âm: không bổ sung nguồn bon)…………………………………………………… 75 Hình 23 Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp chủng SP1901 (Đối chứng âm: không bổ sung nguồn nitơ)……………………………………………………………… 75 Hình 24 Ảnh hưởng ion kim loại đến khả sinh tổng hợp phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… 76 2+ Hình 25 Ảnh hưởng hàm lượng Ca đến khả sinh tổng hợp phytase chủng SP1901…………………………………………………………………………… 77 Hình 26 Chiết xuất enzyme dung mơi khác nhau…………………………… 78 Hình 27 Tủa enzyme cồn aceton……………………………………………… 80 Hình 28 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn SP1901 lồi Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen phytase…………………………………… 81 Hình 29 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền phytase chủng SP1901…………… 82 Hình 30 pH hoạt động thích hợp phytase chủng SP1901………………………… 84 Hình 31 Nhiệt độ hoạt động thích hợp phytase chủng SP1901…………………… 84 Hình 32 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính phytase chủng SP1901… 85 2+ Hình 33 Ảnh hưởng Ca đến độ bền nhiệt phytase chủng SP1901 xử lý 60oC (trái), xử lý 70oC (phải)………………………………………………… 86 Hình 34 Khả bền nhiệt phytase chất sấy khơ 50oC 24h 87 Hình 35 Ảnh hưởng enzyme tiêu hóa đến hoạt động phytase chủng SP1901… 88 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ANFs Anti-nutritional factors BPP ß-propeller phytase DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetracetic acid GRAS Generally regarded as safe GIT Gastro intestinal tract- ống dày ruột HAP Histidine acid phosphatase phytase IP1, IP2, IP3,IP4,IP5 Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate IP6 Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate IUB International Union of Biochemistry IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry NCBI National Center for Biomedical Informatics PAP Purple acid phosphatase phytase PDB Protein database bank Pi Phosphate vô Tm Nhiệt độ biến tính ppm Một phần triệu MỞ ĐẦU Phospho (P) nguyên tố thiết yếu cho sinh trưởng phát triển sinh vật, phospho chủ yếu tìm thấy loại đá phốtphat vơ thể sống Ở thể sống, phospho vô dạng phốtphat PO43- tham gia vào cấu trúc đại phân tử sinh học ADN ARN (hình thành liên kết phosphoeste gốc 3’OH 5’phosphate nu kế tiếp, tham gia cấu thành “đồng tiền lượng” thể sống ATP (adenosin triphosphate), thành phần chủ yếu màng tế bào (phospholipid), muối canxi phốtphat làm cứng xương động vật… Do độ hoạt động hóa học cao, khơng người ta tìm thấy dạng đơn chất tự nhiên thể sống hấp thụ P dạng hợp chất Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) dạng dự trữ chủ yếu phospho tự nhiên, có mặt nhiều loại ngũ cốc, hạt họ đậu hạt lấy dầu (Axit phytic chiếm 80% lượng P thực vật này) nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người động vật Axit phytic có khả tạo phức chặt chẽ với ion kim loại tạo nên muối (phytate: muối axit phytic với Na+, phytin: muối axit phytic với Ca2+, Mg2+) hợp chất khác axit amin, protein, làm ức chế enzyme tiêu hóa, ngăn cản hấp thu chất thể sống Vì axit phytic coi yếu tố kháng dinh dưỡng (an anti-nutrient compound) thức ăn thực phẩm Phytase enzyme đóng vai trị quan trọng cơng nghiệp chế biến thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân muối axit phytic (phytate, phytin) giải phóng orthophosphate myo-inositol-6phosphate cấp độ thấp phản ứng phosphoyl hóa Việc sử dụng phytase không làm tăng khả hấp thu phospho vơ mà cịn tăng khả hấp thu ngun tố khống khả tiêu hóa hợp chất khác Do dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic thành phần thức ăn cần thiết 116 Rimbach G, Pallauf J (1997), Cadmium accumulation, zinc status, and mineral bioavailability of growing rats fed diets high in zinc with increasing amounts of phytic acid Biological Trace Element Research 57(1): 59-70 117 Roberts AH, Yudkin J (1960), Dietary phytate as a possible cause of magnesium deficiency Nature 185: 823-825 118 Rodriguez E, Porres JM, Han Y, Lei XG (1999), Different sensitivity of recombinant Aspergillus niger phytase (r-PhyA) and Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase (r-AppA) to trypsin and pepsin in vitro Archives of Biochemistry and Biophysics 365(2): 262-267 119 Rooney AP, Price NP, Ehrhardt C, Swezey JL & Bannan JD (2009), Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59(10): 2429-2436 120 Sandberg AS, Hulthen LR, Turk M (1996), Dietary Aspergillus niger phytase increases iron absorption in humans Journal of Nutrition 126(2): 476-480 121 Sansinenea E & Ortiz A (2011), Secondary metabolites of soil Bacillus spp Biotechnology Letters 33(8): 1523-1538 122 Scott JJ, Loewus FA (1986), Phytate metabolism in plants In: Graf E, editor Phytic Acid: Chemistry and Applications Minneapolis, MN: Pilatus Press: 23-42 123 Segueilha L, Lambrechts C, Boze H, Moulin G, Galzy P (1992), Purification and properties of the phytase from Schwanniomyces castellii Journal of Fermentation and Bioengineering 74(1): 7-11 124 Siegel H, editor (1976), Metal ions in biological systems: Reactivity of coordination compounds N.Y.: M Dekker, Inc: 384 125 Simon O, Igbasan F (2002), In vitro properties of phytases from various microbial origins International Journal of Food Science & Technology 37(7): 813-822 126 Simpson CJ, Wise A (1990), Binding of zinc and calcium to inositol phosphates (phytate) in vitro Bristish Journal of Nutrition 64(1): 225-232 127 Sharpe LM, Peacock WC, Cooke R, Hams RS (1950), The effect of phytate and other food factors on iron absorption Journal of Nutrition 41(3): 433-446 128 Shieh TR, Ware JH (1968), Survey of microorganism for the production of extracellular phytase Applied Microbiology 16(9): 1348-1351 129 Shimizu M (1992), Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77 Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56: 12661269 130 Smith AK, Rackis JJ (1957), Phytin elimination in soybean protein isolation Journal of the American Chemical Society 79: 633-637 131 Steinke FH, Hopkins DT (1978), Biological availability to the rat of intrinsic and extrinsic iron with soybean protein isolates Journal of Nutrition 108(3): 481-489 132 Susana Rod ríguez Couto, M Ángeles Sanromán (2006), Application of solidstate fermentation to food industry—A review Journal of Food Engineering 76(3): 291–302 133 Tambe SM, Kaklij GS, Kelkar SM, Parekh LJ (1994), Two distinct molecular forms of phytase from Klebsiella aerogenes: Evidence for unusually small active enzyme peptide Ferment Bioeng 77(1): 23-27 134 Tanaka K, Yoshida T, Kasai Z (1974), Radio autographic demonstration of the accumulation site of phytic acid in rice and wheat grains Plant Cell Physiol 15(1): 147-151 135 Tanaka K, Kasai Z (1981), Phytic acid in rice grain In: Ory RLD, editor Antinutrients and natural toxycants in food Westport, CT: Food and Nutrition press: 239-260 136 Thompson DB, Erdman JW (1982), Phytic acid determination in soybeans Journal of Food Sciences 47(2): 513-517 137 Thompson LU (1986), Phytic acid: a factor influencing starch digestibility and blood glucose response In: Graf E, editor Phytic Acid: Chemistry and Applications Minneapolis, MN: Pilatus Press: 173-194 138 Thompson LU (1993), Potential health benefits and problems associated with antinutrients in foods Food Research International 26(2): 131-149 139 Thuy T T (2010), Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp MD2: effect of divalent metals on activity and stability Journal Inorganic biochemistry 105(7): 1000-1007 140 Thuy T T (2010), Thermostable phytase from a Bacillus sp Heterologous production, mutation, characterization and assay development, Doctoral Thesis, Department of Biotechnology, Lund university, Sweden 141 Thuy Thi Tran (2010), A thermostable phytase from Bacillus sp MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 37(3): 279–287 142 Tuyet T.T , Nguyen Duy Long, Hoang Quoc Khanh (2004), “Production of phytase by Aspergillus niger NRRL 363” J Agri Sci Technol Nong Lam University 4: 28-32 143 Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Lei XG, Mullaney EJ (2000), Biochemical characterization of cloned Aspergillus fumigatus phytase (phyA) Biochemical and Biophysical Research Communications 275(2): 279-285 144 Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Mullaney E J, Ziegelhoffer T, Austin-Phillips S (2002), Cloned and expressed fungal phyA gene in alfalfa produces a stable phytase Biochemical and Biophysical Research Communications 290(4): 1343–1348 145 Ullah AHJ, Sethumadhavan K (2003), PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases Biochemical and Biophysical Research Communications 303(2): 463-468 146 Vaintraub IA, Bulmaga VP (1991), Effect of phytate on the in vitro activity of digestive proteinases Journal of Agricultural and Food Chemistry 39: 859861 147 Vallee BL, Galdes A (1984), The metallobiochemistry of zinc enzymes Adv Enzymol 56: 283-340 148 Vats P, Banerjee UC (2004), Production studies and catalytic properties of phytases (myoinositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview Enzyme Micob Technol 35: 3-4 149 Vohra A, Satyanarayana T (2003), Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications Critical Reviews in Biotechnology 23(1): 29-60 150 Vohra P, Gray GA, Kratzer FH (1965), Phytic acid-metal complexes Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 120(2): 447-449 151 Walker ARP (1951), Cereals, phytic acid, and calcification Lancet 2(6676): 244-248 152 Wang LT, Lee FL, Tai CJ & Kasai H (2007), Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(8): 1846-1850 153 Wang xueying (2003), Phytase studies: producer screening, enzyme purification and characterization and gene cloning PhD thesis, Faculty of graduate studies Mahidol University 154 Wills MR, Day RC, Phillips JB, Bateman FC (1972), Phytic acid and nutritional rickets in immigrants Lancet 1(7754): 771-773 155 Wodzinski RJ, Ullah AHJ (1996), Phytase Advances in Applied Microbiology 42: 263-302 156 Wyss M., Brugger R., Kronenberger A., Roland R., Fimbel R., Oesterhelt G., Lehmann M., Adolphus P G M Van Loon (1999), Biochemical Characterization of Fungal Phytases (myo-Inositol hexakisphosphate Phosphohydrolases): Catalytic Properties Applied and environmental microbiology 65(2): 367–373 157 Yetti M., Rina D., Neni G Gita C (2010), Identification Characterization and Production of Phytase from Endophytic Fungi World Academy of Science, Engineering and Technology 65(2010): 1044 158 Yi Z, Kornegay ET, Ravindran V, Denbow DM (1996), Improving phytate phosphous availability in corn and soybean meal for broilers using microbial phytase and calculation of phosphous equivalency values for phytase Poultry Sciences 75(2): 240-249 159 Yoon JH, Thompson LU, Jenkins DJ (1983), The effect of phytic acid on in vitro rate of starch digestibility and blood glucose response The American Journal of Clinical Nutrition 38(6): 835-842 160 Yoon SJ, Choi YJ, Ki MH, Kwang CK, Wook KJ, Cheol LC, Hoo JY (1996), Isolation and identification of phytase producing bacterium, Enterobacterium sp 4, and enzymatic properties of phytase enzyme Enzyme Microbial Technology 18(6): 449-454 WEBSITE 161 www.nature.com 162 www.ncbi.nml.nhi.com 163 www.elsevier.com 164 www.sciencedirect.com/science 165 www.scribd.com/doc/19835831/Enzyme-Hoc PHỤ LỤC Danh sách chủng có khả sinh trưởng 40oC sinh phytase +: có khả sinh trưởng 40oC có khả sinh phytase - : khơng có khả sinh trưởng 40oC khơng có khả sinh phytase Bộ giống phân lập từ Sa Pa Số Khả Khả Số Khả Khả thứ Chủng sinh trưởng sinh thứ Chủng sinh trưởng sinh o o tự 40 C phytase tự 40 C phytase 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 SP11 SP12 SP13 SP14 SP15 SP16 SP17 SP18 SP19 SP110 SP111 SP112 SP113 SP114 SP115 SP116 SP117 SP118 SP119 SP120 SP121 SP122 SP123 SP124 SP125 SP126 SP21 SP22 - - 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 SP23 SP24 SP25 SP26 SP27 SP28 SP29 SP210 SP211 SP212 SP213 SP214 SP215 SP216 SP217 SP218 SP219 SP220 SP221 SP222 SP223 SP31 SP32 SP33 SP34 SP35 SP36 SP37 - - Số thứ Chủng tự 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 SP38 SP39 SP41 SP42 SP43 SP44 SP45 SP46 SP47 SP48 SP49 SP51 SP52 SP53 SP54 SP55 SP56 SP57 SP58 SP59 SP510 SP511 SP512 SP513 SP514 SP515 SP62 SP63 SP64 SP65 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Khả Khả Số Khả sinh trưởng sinh thứ Chủng sinh trưởng 40oC phytase tự 40oC + - - 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 SP66 SP67 SP68 SP69 SP610 SP611 SP612 SP613 SP614 SP615 SP616 SP617 SP618 SP71 SP72 SP73 SP74 SP75 SP76 SP77 SP710 SP711 SP712 SP713 SP714 SP715 SP81 SP82 SP83 SP84 - Khả sinh phytase - Số thứ tự Chủng 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 SP85 SP86 SP87 SP812 SP91 SP92 SP93 SP94 SP95 SP96 SP101 SP102 SP103 SP104 SP105 SP106 SP107 SP108 SP109 SP1010 SP1011 SP1012 SP1013 SP1014 SP1015 SP1016 SP111 SP112 SP113 SP114 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Khả Khả Số Khả sinh trưởng sinh thứ Chủng sinh trưởng o 40 C phytase tự 40oC + + + - - 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 SP115 SP116 SP117 SP118 SP119 SP1110 SP1112 SP1113 SP1114 SP1115 SP1116 SP1117 SP1118 SP1119 SP1120 SP1121 SP1122 SP1123 SP1124 SP1125 SP1126 SP1127 SP97 SP98 SP99 SP910 SP911 SP912 SP913 SP914 + + + + - Khả sinh phytase - Số thứ tự Chủng 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 SP915 SP121 SP122 SP123 SP124 SP125 SP126 SP127 SP128 SP1211 SP1212 SP1213 SP1214 SP1215 SP1216 SP1217 SP1218 SP1219 SP1220 SP1221 SP1222 SP1223 SP131 SP132 SP133 SP134 SP135 SP136 SP137 SP138 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Khả Khả Số sinh trưởng sinh thứ Chủng o 40 C phytase tự + + + + + + + + + + + - 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 SP139 SP1310 SP1311 SP1312 SP1313 SP1314 SP1315 SP1316 SP1317 SP1318 SP141 SP142 SP143 SP144 SP145 SP146 SP147 SP148 SP149 SP151 SP152 SP153 SP154 SP159 SP156 SP1511 SP158 SP1510 SP161 SP162 Khả sinh trưởng 40oC Khả sinh phytase + + + + + + + + + + + - - Số thứ tự Chủng 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 SP163 SP164 SP165 SP166 SP167 SP168 SP169 SP1610 SP1611 SP1612 SP1613 SP1614 SP171 SP172 SP173 SP174 SP175 SP176 SP177 Bộ giống phân lập từ Sa Pa Khả Khả Số sinh trưởng sinh thứ Chủng o 40 C phytase tự + + + + + + + + + + - - 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 SP178 SP179 SP1710 SP1711 SP1712 SP1713 SP1714 SP181 SP182 SP183 SP184 SP185 SP186 SP187 SP188 SP189 SP1811 SP1812 SP1901 Khả sinh trưởng 40oC Khả sinh phytase + + + + + + + Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 Chủng 92 D15 D12 4524 BS9 B Poly D13 BiO2 B2610 B56 BS6 B71 B55 5-4 B315 B6633 B52 Bộ giống phân lập từ Ba Vì Khả Khả Số sinh trưởng sinh thứ Chủng o 40 C phytase tự 18 46A + + 19 M55 + 20 B477 + 21 M22LV + 22 462 + 23 BS2 + 24 BS4 + 25 BC11 + 26 BS1 27 BM8049 + 28 BM8048 + 29 BCK8 + 30 B55 + 31 BS3 + 32 B21556 + 33 BM8009 + 34 BM8007 Khả sinh trưởng 40oC + + + + + + + + + + + + + + + + + Khả sinh phytase - Số thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Chủng 0409 0108 0107 0105 0109 0110 0111 0112 0503 0504 0701 0702 0405 0502 0501 0401 0114 0115 0113 Bộ giống phân lập từ Phú Quốc Khả Khả Số Khả sinh sinh thứ Chủng sinh trưởng trưởng phytase tự 40oC 40oC 20 0201 + 21 0404 + 22 0206 + 23 0207 24 0402 25 0103 + 26 0104 + 27 0101 + + 28 0102 + 29 0205 + + 30 0202 31 0203 + 32 0204 + 33 01005 + 34 0703 35 01004 + 36 01001 + 37 0703 + 38 0704 - Khả sinh phytase - Trình tự gen chủng SP1901: ADNr 16S, groEL, gyrA, polC, purH, rpoB >16S rDNA GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGC ATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATG CGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT AAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCAC CTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG GGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA CGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTA ACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCA AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCT AGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC AACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTG CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC CCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCA GCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG >groEL TTACATGGTGACTGATTCTGATAAGATGGAAGCGGTTCTTGACAATCCTT ACATCTTAATCACAGACAAAAAAATCACAAACATTCAAGAAATCCTTCC TGTGCTTGAGCAAGTTGTACAGCAAGGCAAACCGTTGCTTCTGATCGCT GAAGATGTTGAAGGGGAAGCTCTTGCTACACTCGTTGTCAACAAACTTC GCGGCACATTCAACGCTGTTGCCGTTAAAGCTCCTGGCTTCGGTGACCG CCGTAAAGCAATGCTTGAAGACATCTCTGTTCTTACAGGCGGAGAAGTG ATCACAGAAGACTTAGGCCTTGACCTGAAATCTACTGAAATCGGACAAT TGGGACGCGCTTCTAAAGTTGTGGTAACGAAAGAAAACACAACAATCGT AGAAGGCGCAGGCGACACTGAAAAAATCGCTGCACGCGTCAACCAAAT CCGCGCTCAAGTGGAAGAAACAACTTCTGAATTCGACAGAGAAAAATT ACAAGAGCGTCTTGCGAAACTTGCCGGCGGCGTAGCTGTCATCAAAGTC GGCGCTGCGACTGAAACTGAGCTGAAAGAGCGTAAACTTCGCATCGAA GACGCCCTCAACTCAACTCGCGCAGCTGTTGAAGAAGGTATCGTATCCG GCGGTGGTACAGCGCTTGTCAACGTATACAACAAAGTCGCTGCAGTTGA AGCTGAAGGCGATGCGCAAACAGGTATCAACATCGTGCTTCGCGCGCTT GAAGAGCCGATCCGTCAAATCGCGCACAATGCAGGTCTTGAAGGATCTG TCATCGTTGAGCGCCTGAAAAACGAAAAAATCGGCGTAGGCTTCAACGC TGCA >gyrA GCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGACGTGCGTGACGGTCTGAAGCC GGTTCACAGGCGGATTTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGT GACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGTA AGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCAGTTTACGAATCAATGGTCAGAAT GGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAAC TTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAG CGAGAATGTCAAAAATCGCGATGGAAATCCTCCGGGACATTACGAAAG ATACGATTGATTATCAAGATAACTATGACGGCGCAGAAAGAGAACCTGT CGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGAGCTGCCGGT ATTGCGGTCGGAATGGCGACCAATATTCCTCCGCATCAGCTTGGGGAAG TCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCA GGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAGGTCAG ATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGAT CCATTACGATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACATCATCGGGAA AAGAAAGAATTATTGTCACAGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAG ATTAATTGAAAAAATCGCAGATCTTGTCCGGGATAAAAAAATCGAAGG AATTACCGATCTGCGTGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTC ATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGT ACAAACAAACAGCCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAACCTGCTGGCGCT > polC GATATGGGATTTTTAAATGTGGCGTACAAGCGTCTTTTGAAAACGGAAA AAGCGAAAAATCCGGTCATTGATACACTGGAACTCGCGCGTTTCCTGTA TCCTGAGTTTAAAAATCACCGCTTAAATACGCTATGTAAGAAGTTTGAT ATCGAATTAACCCAGCATCACCGAGCGGTTTTTGACGCTGAAGCAACGG GCTACCTGCTGTTGAAAATGCTCAAAGATGCCGCTGAAAAAGACATTTT TTATCATGATCAGCTGAATGAGAATATGGGACAATCCAATGCTTATCAA AGATCAAGGCCTTATCACGCTACATTGCTTGCCGTGAATGAGACCGGCC TTAAAAATCTGTTTAAGCTCGTGTCCATTTCTCATATTCAATATTTCTAC AGAGTGCCGCGCATTCCGAGGTCGCAGCTTAATAAATACAGAGAAGGTC TGTTAATCGGCTCTGCCTGTGACAGGGGAGAGGTCTTTGAAGGCATGAT GCAAAAATCTCCTGAAGAGGTTGAAGATATCGCATCCTTCTATGATTAT CTTGAAGTGCAGCCGCCGGAAGTATACAGACACCTTCTGCAGCTTGAGC TCGTCCGGGATGAAAAAGCGCTGAAAGAAATCATCGCCAACATTACGA AGCTCGGAGAAAAATTGAATAAGCCGGTCGTGGCTACGGGAAATGTCC ACTATTTAAACGATGAGGATAAAATTTACCGGAAGATCTTAATATCTTC CCAAGGCGGCGCCAACCCGTTTAACAGACACGAACTGCCTAAA >purH AAAACTTCTTCAGGAAAACGGTGTGGATGTCATCGGCATTTCAGAAGTG ACCGGATTTCCTGAAATTATGGACGGACGGTTAAAAACCCTCCATCCTA ATATTCACGGCGGCCTGCTTGCCGTAAGAGACAATGAAGAGCATATGGC GCAGATCAATGAGCACGGCATTGCACCGATTGACCTTGTGGTTGTCAAC CTTTATCCGTTTAAAGAAACGATTTCAAAAGAAGACGTAACATACGATG AAGCGATAGAAAACATTGATATCGGCGGTCCCGGCATGCTGCGCGCCGC CTCGAAAAACCATCAGGATGTGACGGTCATCACAGATCCGGCCGATTAC AGCTCCGTGCTCAATGAGATTAAAGAACACGGCGGCGTTTCTCTTAAAA GAAAACGCGAGCTTGCGGCCAAAGTATTCCGCCATACCGCGGCATACGA CGCATTAATCGCTGATTACTTAACACGCGAGGCCGGTGAGAAAGACCCT GAGCAATTCACCGTTACATTTGAGAAAAAACAATCGCTCCGCTACGGTG AAAACCCTCACCAAGAGGCGGTTTTCTACCAAAGCGCACTTCCCGTCTC CGGTTCCATCGCGGCGGCAAAACAGCTTCACGGCAAAGAGCTTTCTTAC AACAACATTAAGGACGCAGATGCGGCTGTTCAAATCGTCCGGGAATTTA CAGAACCCGCAGCTGTCGCCGTTAAACATATGAACCCGTGCGGAGTCGG TACGGGAGCTTCAATTGAGGAAGCATTCAATAAAGCGTATGAAGCTGAT AAAACCTCCATTTTCGGCGGCATCATCGCGCTGAACCGTGAAGTTGATC AGGCAACGGCTGAAGCCCTTCACGGCATTCTTTTAGAAATCA > rpoB AAAGATGATGTATACACATCTATTCACATTGAAGAATATGAATCAGAAG CACGTGATACAAAGCTTGGGCCTGAAGAGATCACCCGCGATATTCCAAA CGTAGGGGAAGACGCGCTTCGCAATCTTGATGACCGCGGAATTATCCGT ATCGGTGCGGAAGTCAACGACGGAGACCTTCTCGTAGGTAAAGTAACGC CTAAAGGTGTAACTGAGCTTACGGCTGAAGAACGCCTTCTGCATGCGAT CTTTGGAGAAAAAGCGCGTGAAGTCCGTGATACTTCTCTCCGTGTGCCT CACGGCGGCGGCGGAATTATCCACGACGTAAAAGTCTTCAACCGTGAAG ACGGCGACGAACTTCCTCCGGGAGTGAACCAGCTTGTACGCGTATATAT CGTTCAGAAACGTAAGATTTCTGAAGGTGATAAAATGGCCGGACGTCAC GGAAACAAAGGGGTTATCTCGAAGATTCTTCCTGAAGAAGATATGCCTT ACCTTCCTGACGGCACGCCGATCGATATCATGCTTAACCCGCTGGGTGT ACCATCACGTATGAATATCGGTCAGGTATTAGAACTTCACATGGGTATG GCTGCCCGCTACCTCGGCATTCACATCGCGTCACCTGTATTTGACGGCGC GCGTGAAGAAGATGTGTGGGAAACACTTGAAGAAGCAGGCATGTCAAG AGACGCTAAAACAGTTCTTTATGACGGCCGTACGGGAGAACCGTTTGAC AACCGTGTATCAGTCGGAATCATGTACATGATCAAACTGGCGCACATGG TTGATGATAAACTTCATGCCCGTTCTACAGGTCCTTACTCACTTGTTACG CAGCAGCCTCTCGGCGGTAAAGCCCAATTCGGCGGACAGCGTTTCGGTG AGATGGAGGTTTGGGCGCTTGAAGCTTACGGCGCAGCTTACACGCTTCA AGAAATCCTGACTGTGAAGTCCGATGACGTGG Trình tự gen phytase chủng SP1901 GTTATACGCGGCAGCGGATTAGATGCTCACGTGCGGTGCGGTTTCTTCC CAGGCCAAGCATAAACTGTCTGATCCTTATCATTTTACAGTGAATGCGG CGGCGGAAACGGAGCCGGTTGATACAGCCGGTGATGCAGCTGATGATC CTGCGATTTGGCTGGACCCCAAGAATCCTCAGAACAGCAAATTGATCAC AACCAATAAAAAATCAGGCTTAGTCGTGTACAGCCTTGAGGGAAAGAT ACTTCATTCCTATCCTACCGGGAAGCTGAACAATGTTGATATCCGCTATG ATTTTCCGTTGAACGGAAAAAAAGTCGATATTGCGGCGGCATCCAATCG GTCTGAAGGAAAGAATACCATTGAGATTTACGCCATTGACGGGAAAAA CGGCACATTACAAAGCATTACGGACCCAGACCGCCCGATTGCGTCAGCA ATTGATGAAGTATACGGTTTCAGCTTGTACCACAGTCAAAAAACAGGAA AATATTACGCGATGGTGACAGGGAAAGAAGGCGAATTTGAACAATACG AATTAAATGCGGATAAAAATGGATACATATCCGGCAAAAAGGTAAGGG CGTTTAAAATGAATTCTCAGACAGAAGGGATGGCAGCAGATGACGAAT ACGGCAGTCTTTATATCGCAGAAGAAGATGAGGCCATCTGGAAGTTCAG CGCTGAGCCGGACGGCGGCAGTAACGGAACGGTGATCGATCGTGCCGA CGGCAGGCATTTAACCCCTGATATTGAAGGACTGACGATTTACTACGCT GCTGACGGGAAAGGTTATTTGCTTGCATCAAGCCAGGGTAACAGCAGCT ACGCGATTTATGAAAGACAGGGACAGAACAAATATGTTGCGGACTTTCA GATAACAGACGGACCTGAAACAGACGGCACAAGCGATACAGACGGGAA TTGACGTTCTTGGGTTTCGGGCTGGGGCCTGAATATCCGTTCGGGCCTTT TTGTCGCACAGGGACGGAGAAAATATTAGATCACGGGCCAAAAGGCCA ATCAAAATTTTTAAAATGGTGGCCATGGGGAAAGAATCCCCTGAAAAAA TCCGGCTTTCACCCGCAGGTCAATAAACAGGTTGACCCGGAAACTGCGC AAGGACCGAGAGGGGAGACTAATTATAATTATAATTATATATATAAAAA AAAAAA ... loài vi sinh vật, nhu cầu tầm quan trọng sản phẩm phytase thương mại, tiến hành đề tài nghiên cứu ? ?Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase? ?? nhằm tìm kiếm lồi vi sinh vật có khả sinh enzyme. .. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Phan Thị Thu Mai PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... phytase vi sinh vật bền với pH phytase từ thực vật, phytase thực vật giảm đáng kể hoạt tính khoảng 4-7,5 phytase vi sinh vật tương đối bền khoảng pH từ 3-8 [64, 65, 149] Ngoài khả chịu axit phytase