HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG MINH TUẤN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hạnh TS Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phịng Cơng nghệ phơi – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức – Trưởng môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam ln theo sát, hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi sống q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga anh chị cán phịng Cơng nghệ phơi, viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào chức gan từ tế bào gốc người chuột”, Mã số: VAST.ĐL.03/16-17, đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC HÌNH ẢNH VI DANH MỤC BẢNG BIỂU VII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN VIII THESIS ABSTRACT IX PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TẾ BÀO GỐC 2.1.1 Định nghĩa tế bào gốc 2.1.2 Phân loại, đặc tính tế bào gốc 2.1.3 Ứng dụng tế bào gốc 2.2 TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN 11 2.2.1 Cấu tạo, chức dây rốn 11 2.2.2 Tế bào gốc dây rốn 12 2.2.3 Nghiên cứu phương pháp phân lập nuôi hWJSCs 15 2.3 NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS 16 2.4 GEN HNF - 4Α 18 2.4.1 Đặc điểm gen HNF - 4α 18 2.4.2 Nghiên cứu biểu gen HNF - 4α q trình biệt hóa tế bào gốc 19 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 22 3.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 22 iii 3.2.1 Mẫu xét nghiệm 22 3.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.3.1 Thu nhận xử lí dây cuống rốn 24 3.3.2 Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn 25 3.3.4 Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR) 29 3.3.5 Điện di gel agarose 32 3.3.6 Phân lập gen HNF - 4α 33 3.3.7 Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit 34 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO 35 4.1.1 Phân lập tế bào 35 4.1.2 Cấy chuyển tế bào 38 4.1.3 Đông lạnh tế bào 39 4.2 ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN 41 4.2.1 Đánh giá tính ổn định di truyền TBGTM 41 4.2.2 Tách chiết RNA tổng số 43 4.2.3 Định lượng RNA tổng số 43 4.2.4 Đánh giá đặc tính TBGTM biểu gen HNF – 4a trước biệt hóa 44 4.2.5 Đánh giá biểu gen HNF - 4α sau xử lý biệt hóa 47 4.3 PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α 49 4.3.1 Khuếch đại trình tự mã hóa gen HNF - 4α 49 4.3.2 Tinh đoạn DNA sau khuếch đại 50 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 KẾT LUẬN 53 5.2 KIẾN NGHỊ 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt HNF - 4α Nghĩa tiếng Việt MSC Mesenchymal Stem Cell iPS cell Induced pluripotent stem cell ES EG DNA Embryonic stem cells Embryonic germ cells RNA cDNA Bp Kb bFGF CHT CT DMEM/F12 dNTP EGF FBS HSC hWJSCs ICM IVF ITS ICSI TBGTM RT – PCR TBG WJ E.coli Taq UV CDS TAE Human hepatocyte nuclear factor - Deoxyribonucleic acid Ribonucleic acid Complement deoxyribonucleic acid Base pair Kilo base Basic fibroblast growth factor Collagenase / hyaluronidase trypsin Collagenase/ trypsin Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium Deoxyribonucleotide Triphosphate Epidermal growth factor Fetal bovine serum Hemapoietic stem cell (human umbilical cord Wharton’s jelly Stem Cell) Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người Inner cell mass In vitro fertilization Insulin – transferin – selenium Intracytop plasmide sperm injecti Tế bào gốc trung mô Reverse-transcription Polymerase chain reaction Tế bào gốc Wharton’s jelly Escherichia coli Thermus aquaticus Ultra violet (tia cực tím) Coding sequence (trình tự mã hóa) Tris-axit axetic-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Chức tế bào gốc Hình 2.2 Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải) Hình 2.3 Sử dụng iPS cell thử nghiệm thuốc 10 Hình 2.4 Cấu tạo dây rốn 12 Hình 3.1 Mẫu dây rốn trước xử lý 25 Hình 3.2 Sử dụng dao panh để chọn lọc phần mô cần sử dụng 26 Hình 3.3 Mẫu dây rốn trước xử lý 26 Hình 3.4 Tủ ni cấy tế bào 37oC, 5% CO2 27 Hình 3.5 Quy trình tách RNA tổng số kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN) 28 Hình 3.6 Nguyên lý RT-PCR 30 Hình 4.1 Tế bào bắt đầu mọc từ rìa mảnh mơ 35 Hình 4.2 Tế bào trước cấy chuyển (trái) lần cấy chuyển thứ (phải) 36 Hình 4.3 Tế bào phát triển thành mảng song song, cuộn xoắn gối lên 37 Hình 4.4 Tế bào mọc kín đĩa ni 38 Hình 4.5 Tế bào sau ủ với trypsin 0.25% phút 37 0C 39 Hình 4.6 Tế bào soi kính hiển vi sau nhuộm Trypan Blue 40 Hình 4.7 Nhiễm sắc thể (NST) lần cấy chuyển thứ 42 Hình 4.8 Điện di đồ tách chiết RNA tổng số 43 Hình 4.9 Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập 46 Hình 4.10 Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy tuần sau xử lý biệt hóa 47 Hình 4.11 Điện di đồ PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α 50 Hình 4.12 Kết kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank 52 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Trang thiết bị dụng cụ 23 Bảng 3.2 Hóa chất thí nghiệm 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi sử dụng đánh giá thị TBGTM 32 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α 33 Bảng 4.1 Kết đo mật độ quang (OD) mẫu RNA tách chiết 44 Bảng 4.2 Trình tự oligonucleotide mồi sử dụng 45 Bảng 4.3 Thống kê biểu thị phân tử tế bào gốc 46 Bảng 4.4 Trình tự đọc mồi vector (PacI–HNF-4α PacI–HNF-4α) 51 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tế bào gốc (TBG) tế bào tiềm thể Khả biệt hóa cho phép TBG phân chia phát triển thành tất loại tế bào chun hóa TBG dây rốn có đầy đủ tính chất TBG đa TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009) Gần đây, số nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan mở hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008) Tuy nhiên, nay, chế xác q trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan cần phải làm rõ Chúng tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả biểu HNF - 4α tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa yếu tố thị biệt hóa vừa tác nhân gây biệt hóa Trong đề tài này, chúng tơi sử dụng số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A.Petsa (2009)), phương pháp tách RNA tổng số (Kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN)), phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR) (thực theo Kary Mullis (1985)), phương pháp tách gel (Kit Gene Jet gel extraction), phương pháp tách plasmid (Kit Gene Jet plasmid miniprep), phương pháp điện di gel agarose (Thực theo Kirkpatrick (1990)) Sau thời gian thực đề tài, thu kết quả: nghiên cứu phân lập tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng tế bào gốc trung mơ như: dương tính CD90, CD73, CD105, âm tính với thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P Kết nghiên cứu cho thấy biểu gen HNF - 4α âm tính tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa Sau xử lý biệt hóa với DMSO, thị gen HNF - 4α biểu sau tuần nuôi cấy Nghiên cứu phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen kiểm tra genbank viii THESIS ABSTRACT Stem cells are the potential cells in the body The cell's ability to differentiate into other specialized cell types The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009) Recently a series of studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells, giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai et al., 2007; Cantz et al., 2008) However, the exact mechanism of the differentiation from umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified We conducted a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation In this thesis, we have used the following research methods: Cellular isolation (Applied by A.Petsa (2009)), total RNA extraction (Kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN)), The Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method (Kary Mullis, 1985), Kit Gene Jet Gel Extraction, Gene Gene Jet Plasmid Miniprep, Agarose gel electrophoresis (Follow Kirkpatrick (1990)) After the implementation of the project, we have obtained the following results: Research has isolated cord stem cells with characterized mesenchymal stem cells such as positive with the CD90, CD73, CD105 markers, negative with specific indicators for hepatocellular carcinoma are: ALB, HNF - 4α, G6P Results show that the expression of the HNF-4α gene is negative in cord blood stem cells prior to differentiation After DMSO treatment and weeks of culture, the HNF-4α gene expression was demonstrated The study successfully isolated the gene HNF - 4α with 100% compatibility with the gene sequence tested on Genbank ix 4.2.2 Tách chiết RNA tổng số Mẫu tế bào gan nghiền nhỏ dung dịch đệm PBS 10% trước cho qua màng lọc thu dịch chiết tế bào để tiến hành tách chiết thu nhận RNA tổng số Tương tự vậy, mẫu tế bào gốc trung mô cuống rốn phân lập nuôi cấy dựa theo số lượng tế bào đĩa nuôi cấy để bổ sung lượng ethanol 70% tương ứng để tách chiết thu nhận RNA tổng số Sản phẩm điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 4.8) Hình 4.8 Điện di đồ tách chiết RNA tổng số Ghi chú: 1: Tế bào gan; 2: Tế bào gốc trung mô cuống rốn Kết điện di đồ cho thấy hai mẫu xuất đầy đủ băng ứng với tiểu cầu 28S, 18S 5S RNA tổng số phù hợp với lý thuyết Các băng hiển thị rõ ràng, khơng có dấu hiệu đứt gãy hay nhiễm tạp chất, đủ điều kiện để tiến hành bước thí nghiệm 4.2.3 Định lượng RNA tổng số Sau tiến hành điện di kiểm tra, mẫu RNA tổng số đo mật độ quang OD bước sóng 260 nm 280 nm để xác định nồng độ kiểm tra độ tinh Các bazo nito hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm Giá trị mật độ 43 quang bước sóng 260 nm (A260 nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ RNA mẫu theo công thức nêu phần phương pháp Để kiểm tra độ tinh dung dịch, đo thêm giá trị mật độ quang bước sóng 280 nm (A280 nm) Bước sóng 280 nm bước sóng protein có mức hấp thu cao Một dung dịch DNA xem tỷ số A260 nm/A280 nm nằm khoảng 1,8 – Kết đo quang phổ, xác định hàm lượng độ tinh mẫu thể Bảng 4.1: Bảng 4.1 Kết đo mật độ quang (OD) mẫu RNA tách chiết Tên mẫu OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm Hàm lượng RNA (ng/µl) Tế bào gan Tế bào gốc 0,229 0,233 0,117 0,121 1,949 1,925 1145 1165 trung mô Kết đo quang phổ bước sóng 260 nm 280 nm cho thấy mẫu RNA tách chiết có độ tinh cao tỷ lệ OD260/OD280 đạt đến 1,9 Trong đó, từ kết đo quang phổ 260 nm xác định hàm lượng RNA cao, hoàn toàn đủ tiêu chuẩn làm khuôn mẫu cho RT – PCR 4.2.4 Đánh giá đặc tính TBGTM biểu gen HNF – 4a trước biệt hóa Các thị phân tử hay gọi marker nghiên cứu bao gồm protein, glycoprotein, yếu tố phiên mã, thụ thể,… bề mặt tế bào tham gia hoạt đọng chức tế bào Chúng chuyên biệt cho tế bào khác người ta dựa vào để nhận diện tế bào Từ việc thu RNA tổng số, tiến hành phản ứng RT – PCR xác định biểu gen đặc trưng TBGTM So sánh dựa sở nghiên cứu thị TBGTM công bố để đánh giá xem tế bào nuôi có phải TBGTM hay khơng Bên cạnh đó, thị số gen liên quan đến tế bào gan tiến hành kiểm tra để xem xét TBGTM sau phân lập có dạng tiền tế bào gan hay không 44 Mẫu RNA sau xác định nồng độ độ tinh cần thiết sử dụng để chạy RT – PCR với mồi đặc hiệu (bảng 4.2) Bảng 4.2 Trình tự oligonucleotide mồi sử dụng Mồi xuôi HNF-4α Mồi ngược 5’- CTAGCTAGCATGGTCAGCGTGAAC - 3’ 5’- GGAATTCGATAACTTCCTGCTTGGTG - 3’ CD34 5’ – AAAACGTGTTGCCTTGAACC – 3’ 5’ – AAGCCATGGAGATCAGAGGA – 3’ CD73 5’ – CCTGCTCAGCTCTGCATAAGTA – 3’ 5’ – CCCTATTTTACTGGCCAAGTGT – 3’ CD86 5’ – TCCTGGCTGAGAGAGGAAGA – 3’ 5’ – AGACTGCCCCATCCCTTAGT – 3’ CD90 5’ – TTTGGCCCAAGTTTCTAAGG – 3’ 5’ – AGATGCCATAAGCTGTGGTG – 3’ CD105 5’ – TCCAGCACTGGTGAACTGAG – 3’ 5’ – TGTCTCCCCTGCCAGTTAGT – 3’ Eras 5’ – GCAAGGTCCTGTAGGGAGAA – 3’ 5’ – GCAGCTTTGAAACCCAAAAC – 3’ Oct – 5’ – GCAACCCTGTTAGCTTGGTC – 3’ 5’ – CTCTCCTTTGCCCTCACAAC – 3’ GATA4 5’ – CCAGAGATTCTGCAACACGA – 3’ 5’ – ATTTTGGAGTGAGGGGTCTG – 3’ HNF-4α 5’ – ATGGTCAGCGTGAAC – 3’ 5’ – ACTTCCTGCTTGGTG – 3’ G6P 5’– GCTGGAGTCCTGTCAGGCATTGC–3’ 5’– TAGAGCTGAGGCGGAATGGGAG – 3’ TAT 5’– TGAGCAGTCTGTCCACTGCCT – 3’ 5’ – ATGTGAATGAGGAGGATCTGAG – 3’ ALB – CCAGAAGACACCCTCCAAAGGAC – 3’ 5’ – AACGATGTGGAGTTCACGG – 3’ (CDS) (chỉ thị) Vì giá trị Tm mồi xấp xỉ nên thực lần chạy RT – PCR Phản ứng phiên mã ngược khuếch đại thực phản ứng với hỗn hợp enzyme chuẩn bị theo kit QIAGEN ® OneStep RT – PCR Kit Sản phẩm RT – PCR kiểm tra, đánh giá điện di gel agarose 1,5% (Hình 4.9) kết biểu thị thống kê lại bảng 4.3 45 A B Hình 4.9 Điện di đồ RT-PCR mẫu TBGTM sau phân lập (A) đối chứng dương – tế bào gốc ung thư gan (B) 1: CD73; 2: CD34; 3: CD86; 4: CD90; 5: CD105; 6: Eras; 7: Oct – 1; GATA4; 9: ALB (albumin); 10: HNF – 4α; 11:G6P; M: Market DNA 100 bp (Thermo Scientific) Bảng 4.3 Thống kê biểu thị phân tử tế bào gốc Tên thị ALB HNF – 4α G6P GATA4 CD34 Oct – CD86 CD90 Eras CD105 CD73 Kích thước (bp) 136 350 379 290 367 297 290 265 315 179 308 Biểu + + + + + + + + Kết từ hình 4.9 bảng 4.3 cho thấy TBGTM sau phân lập, thị đặc trưng cho TBGTM CD90, CD73, CD105 biểu Ngoài ra, thị bổ sung khác biểu hiện, thị tế bào gốc phơi (Embryonic stem cells) như: Oct – 1, Eras Các yếu tố phiên mã tham gia vào trình phát triển quan có nguồn gốc từ nội bì hay trung bì như: GATA4 biểu Hơn nữa, có diện thị phân tử CD86 – 46 protein thể tế bào trình diện kháng nguyên, cung cấp tin hiệu costimulatory (đồng kích thích) cần thiết cho việc tế bào kích hoạt lympho T hệ thống miễn dịch thể Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu thị TBGTM cơng bố trước Bên cạnh đó, so sánh với đối chứng dương mẫu tế bào gốc ung thư gan, số thị đặc trưng cho tế bào gan HNF – 4a, G6P, ALB có biểu hiện, nhiên thị hồn tồn khơng biểu mẫu TBGTM sau phân lập Kết phân tích RT –PCR cho thầy mẫu TBGTM chúng tơi hồn tồn khơng có dấu hiệu đặc trưng tế bào gan Do đó, chúng tơi hồn tồn sử dụng mẫu TBGTM để tiến hành thí nghiệm biệt hóa 4.2.5 Đánh giá biểu gen HNF - 4α sau xử lý biệt hóa Nghiên cứu xử lý TBGTM sau phân lập yếu tố biệt hóa DMSO Tế bào lần cấy chuyển thứ xử lý biệt hóa với DMSO nồng độ 0,01%; 0,1%; 1% mơi trường ni bình thường vịng ngày, có đối chứng (+) (-) Sau đó, tế bào thay mơi trường ngày/1 lần Tế bào xử lý DMSO tách từ đĩa nuôi cấy trypsin/EDTA, 37 0C, phút tách RNA tổng số Tế bào sau xử lý biệt hóa kiểm tra biểu gen thị cặp mồi đặc hiệu cho thị tế bào gan HNF - 4α, ALB G6P Hình 4.10 Điện di đồ RT-PCR mẫu ni cấy tuần sau xử lý biệt hóa Ghi chú: G6P; ALB; HNF-4α; M: Marker DNA 100 bp 47 Trong số mốc thời gian (2 ngày, tuần, tuần tuần) nuôi cấy sau xử lý cho kết biểu thị âm tính Ở thời điểm tuần ni cấy, thị HNF - 4α biểu tế bào (hình 4.10) Kết thu nhận phù hợp với nghiên cứu xử lý biệt hóa, thị hồn tồn khơng biểu tế bào trước xử lý, nhiên sau tuần nuôi cấy sau thị gen HNF - 4α biểu Điều cho thấy yếu tố phiên mã HNF - 4α hoạt hóa tế bào gốc điều tiết biểu gen liên quan đến tế bào gan Từ đó, tế bào gốc cuống rốn có khả biệt hóa thành tế bào gan hồn chỉnh Bên cạnh đó, việc thị phân tử tế bào gan HNF - 4α biểu tế bào sau tuần nuôi cấy sau xử lý biệt hóa giải thích hiệu suất khơng cao q trình hoạt hóa biểu gen TBGTM Số lượng tế bào mà hoạt hóa gen HNF - 4α chưa nhiều Kết cho thấy hiệu việc hoạt hóa tế bào gốc nói riêng tế bào động vật nói chung cần có thời gian để đánh giá xác tối ưu yếu tố tác động chất hoạt hóa, nồng độ chất hoạt hóa Từ mở hướng nghiên cứu đặc trưng q trình hoạt hóa tế bào tương lai Trong số thị phân tử liên quan đến tế bào gan, ngoại trừ thị gen HNF - 4α có biểu tế bào sau xử lý, thị khác đặc trưng cho chức tế bào gan G6P ALB chưa biểu tế bào Nếu thị ALB đặc trưng cho loại protein có nhiều huyết máu sản sinh gan thị G6P (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) đặc trưng cho loại enzyme xúc tác chuyển hóa axit béo hoặc/và isoprenoid gan, tuyến vú, tuyến mỡ tuyến thượng thận Điều giải thích thời gian protein HNF - 4α biểu tế bào sau xử lý biệt hóa chưa đủ điều tiết kích hoạt biểu gen khác liên quan đến gan có gen liên quan đến chức gan nói Do đó, để thị biểu tế bào sau biệt hóa, chúng tơi cần tiếp tục tiến hành ni cấy tế bào kiểm tra RT-PCR với mốc thời gian dài tuần Trong nghiên cứu chúng tơi, ngồi việc khảo sát khả biểu gen HNF - 4α, tiến hành nghiên cứu phân lập gen tiến tới biểu 48 tế bào tế bào gốc cuống rốn Việc theo dõi, đánh giá phát triển hình thái tế bào, độ ổn định di truyền kính hiển vi hình thành tế bào gan hoàn chỉnh với đầy đủ chức chuyên biệt tế bào sau xử lý biệt hóa cần thiết Thêm vào đó, số thị đặc trưng cho tế bào gan cần chạy RT-PCR để kiểm tra biểu tế bào sau nuôi cấy từ tuần trở lên so sánh với đối chứng dương thị tương ứng tế bào gốc ung thư gan 4.3 PHÂN LẬP GEN HNF - 4α 4.3.1 Khuếch đại trình tự mã hóa gen HNF - 4α Trình tự mã hóa (coding sequence – CDS) gen HNF - 4α khuếch đại kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi đặc hiệu từ mẫu RNA tổng số tách chiết từ mẫu tế bào gan Ở thí nghiệm này, chúng tơi chọn cặp mồi PacI – HNF4 - 4α (Mồi xuôi) NsiI – HNF - 4α (Mồi ngược) Tất thành phần chu trình phản ứng PCR tính tốn cho nồng độ gen thu tối ưu nhất, tránh xuất đoạn băng phụ thành phần bị dư Số chu kì phản ứng PCR thường 25 – 35, tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu Số chu kì thường khơng vượt q 40 lúc hiệu khuếch đại bị giảm cạn kiệt thành phần phản ứng xuất sản phẩm phụ, ức chế phản ứng Trong nghiên cứu này, với lượng RNA khuôn mẫu đưa vào 1-2 µg RNA tổng số, 30 chu kì PCR thiết lập Tính xác hiệu suất enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng Một thành phần quan trọng hệ đệm Mg 2+ Thành phần giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính polymerase Nồng độ Mg2+ cao làm DNA khơng biến tính hồn tồn, sản phẩm bị Tuy nhiên nồng độ Mg2+ lại làm xấu trình kéo dài chuỗi DNA Với DNA polymerase hãng Dream Taq, Mg2+ bổ sung vào dung dịch buffer với nồng độ tối ưu, phù hợp với DNA polymerase Kết thúc chu trình nhiệt, sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 4.11) 49 Hình 4.11 Điện di đồ PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α Ghi chú: M: Market DNA kb (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm RT – PCR Hình ảnh điện di cho thấy băng DNA có kích thước vào khoảng gần 1,4 kb với kích thước tính tốn CDS gen HNF - 4α thiết kế mồi Đồng thời, băng DNA rõ nét, đặc hiệu khơng có dấu hiệu đứt gãy, hoàn toàn phù hợp để tiến hành bước nghiên cứu 4.3.2 Tinh đoạn DNA sau khuếch đại Sản phẩm HNF - 4α thu từ trình khuếch đại trình tự kỹ thuật PCR thực trình tinh gel agarose 0,8% sử dụng kit GeneJET Gel Extraction kit (Hãng Thermo Fisher Scientific) Sản phẩm thu sau tách gel kit GeneJET Gel Extraction kit tiến hành điện di kiểm tra gel agarose Hình ảnh điện di cho thấy băng DNA có vị trí trùng với băng đối chứng Đồng thời, băng DNA rõ nét, đặc hiệu khơng có dấu hiệu đứt gãy Có thể kết luận q trình tinh loại hết thành phần tạp sản phẩm PCR 50 Trình tự mã hóa (coding sequence – CDS) gen HNF - 4α sau khuếch đại kỹ thuật PCR đưa vào phần mềm phân tích để có sơ đồ tổng thể vị trí gen nhận biết enzyme cắt giới hạn Trình tự CDS gen HNF - 4α đọc mồi vector phân tích phần mềm BioEdit, thu kết Bảng 4.4 ATGAGCTAGCATGGTCAGCGTGAACGCGCCCCTCGGGGCTCCAGTGGAGA GTTCTTACGACACGTCCCCATCAGAAGGCACCAACCTCAACGCGCCCAACAGC CTGGGTGTCAGCGCCCTGTGTGCCATCTGCGGGGACCGGGCCACGGGCAAACA CTACGGTGCCTCGAGCTGTGACGGCTGCAAGGGCTTCTTCCGGAGGAGCGTGC GGAAGAACCACATGTACTCCTGCAGATTTAGCCGGCAGTGCGTGGTGGACAAA GACAAGAGGAACCAGTGCCGCTACTGCAGGCTCAAGAAATGCTTCCGGGCTGG CATGAAGAAGGAAGCCGTCCAGAATGAGCGGGACCGGATCAGCACTCGAAGG TCAAGCTATGAGGACAGCAGCCTGCCCTCCATCAATGCGCTCCTGCAGGCGGA GGTCCTGTCCCGACAGATCACCTCCCCCGTCTCCGGGATCAACGGCGACATTCG GGCGAAGAAGATTGCCAGCATCGCAGATGTGTGTGAGTCCATGAAGGAGCAGC TGCTGGTTCTCGTTGAGTGGGCCAAGTACATCCCAGCTTTCTGCGAGCTCCCCC TGGACGACCAGGTGGCCCTGCTCAGAGCCCATGCTGGCGAGCACCTGCTGCTC GGAGCCACCAAGAGATCCATGGTGTTCAAGGACGTGCTGCTCCTAGGCAATGA CTACATTGTCCCTCGGCACTGCCCGGAGCTGGCGGAGATGAGCCGGGTGTCCA TACGCATCCTTGACGAGCTGGTGCTGCCCTTCCAGGAGCTGCAGATCGATGACA ATGAGTATGCCTACCTCAAAGCCATCATCTTCTTTGACCCAGATGCCAAGGGGC TGAGCGATCCAGGGAAGATCAAGCGGCTGCGTTCCCAGGTGCAGGTGAGCTTG GAGGACTACATCAACGACCGCCAGTATGACTCGCGTGGCCGCTTTGGAGAGCT GCTGCTGCTGCTGCCCACCTTGCAGAGCATCACCTGGCAGATGATCGAGCAGA TCCAGTTCATCAAGCTCTTCGGCATGGCCAAGATTGACAACCTGTTGCAGGAGA TGCTGCTGGGAGGGTCCCCCAGCGATGCACCCCATGCCCACCACCCCCTGCACC CTCACCTGATGCAGGAACATATGGGAACCAACGTCATCGTTGCCAACACAATG CCCACTCACCTCAGCAACGGACAGATGTGTGAGTGGCCCCGACCCAGGGGACA GGCAGCCACCCCTGAGACCCCACAGCCCTCACCGCCAGGTGGCTCAGGGTCTG AGCCCTATAAGCTCCTGCCGGGAGCCGTCGCCACAATCGTCAAGCCCCTCTCTG CCATCCCCCAGCCGACCATCACCAAGCAGGAAGTTATCTAG Bảng 4.4 Trình tự đọc mồi vector (PacI–HNF-4α PacI–HNF-4α) 51 Trình tự CDS gen HNF - 4α so sánh với trình tự CDS gen HNF - 4α cơng cố Genbank (Hình 4.12) Kết cho thấy CDS gen HNF - 4α có độ tương đồng 99% so với CDS gen HNF - 4α người có mã số truy cập NM_001030003.2 Từ kết so sánh trình tự nucleotide, trình tự acid amin phân tích phần mềm Expasy (www.expasy.org) cho thấy CDS gen HNF - 4α nhân dịng từ mẫu tế bào gan mã hóa cho protein – Yếu tố phiên mã HNF - 4α Do vậy, sử dụng trình tự mã hóa để đưa vào vector biểu tế bào động vật Hình 4.12 Kết kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank 52 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Nghiên cứu phân lập tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng tế bào gốc trung mơ như: dương tính CD90, CD73, CD105 âm tính với thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P - Kết nghiên cứu cho thấy biểu gen HNF - 4α âm tính tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa sau xử lý biệt hóa với DMSO Chỉ thị gen HNF 4α biểu sau tuần nuôi cấy - Nghiên cứu phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen kiểm tra genbank 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng gen HNF - 4α hướng nghiên cứu tạo tế bào gan từ tế bào gốc cuống rốn 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt: Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo Dục, 556 trang Tiếng Anh: Argyrokastritis A., Kamakari S., Kapsetaki M., Kritis A., Talianidis I., et al (1997) Human hepatocyte nuclear factor-4 (hHNF-4) gene maps to 20q12-q13.1 between PLCG1 and D20S17 Hum Genet 99: pp 233-236 Batsali AK., Kastrinaki MC., Papadaki HA., Pontikoglou C (2013) Mesenchymal stem cells derived from Wharton's Jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications Curr Stem Cell Res Ther 8: pp 144-155 Bin Zhang (2010) CD73: A novel target for cancer immunotherapy Cancer Res Vol 70(16) pp 6407–6411 Bolotin E., H Liao, T C Ta, Yang C and W Hwang-Verslues, et al (2010) Integrated approach for the identification of human hepatocyte nuclear factor 4alpha target genes using protein binding microarrays Hepatology Vol 51 (2).pp 642-653 Bongso A., and C Y Fong (2013).The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Wharton's jelly of the human umbilical cord Stem Cell Rev Vol 9(2) pp 226-240 Cai J., Y Zhao, Y Liu, F Ye, Z Song, H Qin, S Meng, Y Chen, R Zhou, X Song, Y Guo, M Ding and H Deng (2007) Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells Hepatology Vol 45(5) pp 1229-1239 Campard D., P A Lysy, M Najimi and E M Sokal (2008) Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells Gastroenterology Vol 134(3) pp 833-848 Cantz T., Manns M.P., Ott M (2008) Stem cells in liver regeneration and therapy Cell Tissue Res 331: pp 271-282 10 Chartier FL., Bossu J.P., Laudet V., Fruchart JC., Laine B (1994) Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor indicate the presence of two isoforms in human liver Gene 147: pp 269-272 54 11 Chen ML., Lee KD., Huang HC., Tsai YL., Wu YC., et al (2010) HNF-4alpha determines hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells from bone marrow World J Gastroenterol 16: pp 5092-5103 12 Fonsatti E., L Sigalotti, P Arslan, M Altomonte and M Maio (2003) Emerging role of endoglin (CD105) as a marker of angiogenesis with clinical potential in human malignancies Curr Cancer Drug Targets Vol 3(6) pp 427-532 13 Garrison W.D., Battle M.A., Yang C., Kaestner K.H., Sladek F.M., et al (2006) Hepatocyte nuclear factor 4alpha is essential for embryonic development of the mouse colon Gastroenterology 130: pp 1207-1220 14 Gerald J.S (2003), “Stem cells and tissue regeneration when is a stem cell really a stem cell?”, Bone Marrow Transplantation 32, pp S7 – S11 15 Ishige I., Nagamura-Inoue T., Honda M.J., Harnprasopwat R., Kido M., et al (2009) Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord Int J Hematol 90: pp 261-269 16 Ishii K., Yoshida Y., Akechi Y., Sakabe T., Nishio R., et al (2008) Hepatic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by tetracycline-regulated hepatocyte nuclear factor 3beta Hepatology 48: pp 597-606 17 Kai Liu., Ming – Gao Guo., Xiao – Li Lou., Xiao – Ya Li., Yang Xu., Wei – Dan Ji., Xuan – Dong Huang., Jia – He Yang., Ji – Cheng – Duan (2015) Hepatocyte nuclear factor 4α induces a tendency of differentiation and activation of rat hepatic stellate cells World J Gastroenterol Vol 21(19): pp 5856 - 5866 18 Karen K.H., David A.I., Mervin C.Y., (2008), “Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells”, Arterioscler Thromb Vasc Bio 28, pp 1584 – 1595 19 Kim D.W., Staples M., Shinozuka K., Pantcheva P., Kang S.D., et al (2013) Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: Phenotypic Characterization and Optimizing Their Therapeutic Potential for Clinical Applications Int J Mol Sci 14: pp 1169211712 20 F H Kirkpatrick., et al Electrophoresis, 14(4), 349-354 (1993) 21 Liu S., Hou K.D., Yuan M., Peng J., Zhang L., et al (2014) Characteristics of mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of human umbilical cord and for fabrication of non-scaffold tissue-engineered cartilage J Biosci Bioeng 117: pp 229-235 55 22 Mong-Liang Chen., Kuan – Der Lee., Huei – Chun., Yue -Lin Tsai., Yi – Chieh Wu., Tzer – Min Kuo., Cheng – Po Hu., and Chung – Ming Chang (2010) HNF - 4α determines hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells from bone marrow Hepatology 56: pp 323 – 333 23 Nair S., Jun R (2007), Vascular biology protocols, Humana Press Inc, USA 24 Odom D.T., Zizlsperger N., Gordon D.B., Bell G.W., Rinaldi N.J., et al (2004) Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors Science 303: pp 1378-1381 25 Petsa A., Gargani S., Felesakis A., Grigoriadis N and Grigoriadis I (2009) Effectiveness of protocol for the isolation of Wharton’s jelly stem cells in large-scale applications Vitro Cell Dev Biol Anim 45 (573–576) 26 Ren H.Y., Zhao Q.J., Xing W., Yang S.G., Lu S.H., et al (2010) Differentiation of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells into low immunogenic and functional hepatocyte-like cells in vitro] Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao 32: pp 190-194 27 Sadettin S Ozturk., Wei – Shou Hu., (2006), Cell culture technology for pharmaceutical and cell – based therapies, Taylor and Fransis, USA 28 Salehinejad P., Alitheen N.B., Ali A.M., Omar A.R., Mohit M., et al (2012) Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly In Vitro Cell Dev Biol Anim 48: pp 75-83 29 Sercin K., Ozgur C., Emine K., Fadil K and Guvem GA (2007) Biology of Stem Cells in Human Umbilical Cord Stroma: In Situ and In Vitro Surveys Stem cells 25: pp 319-331 30 Shaer A., Azarpira N., Aghdaie M.H., Esfandiari E (2014) Isolation and characterization of Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Placental Decidua Basalis; Umbilical cord Wharton's Jelly and Amniotic Membrane Pak J Med Sci 30: pp 1022-1026 31 Sladek F.M., Dallas-Yang Q., Nepomuceno L (1998) MODY1 mutation Q268X in hepatocyte nuclear factor 4alpha allows for dimerization in solution but causes abnormal subcellular localization Diabetes 47: pp 985-990 56 32 Teresa L R., I S Luis, M Sandra, P Silvia, P Noemí, L Guillermo, H Ángel, R Alba, O C R Rebeca, S Fermín and Consuelo del Cizo (2016) MSC surface markers (CD44, CD73, and CD90) can identify human MSC-derived extracellular vesicles by conventional flow cytometry Cell Communication and Signaling Vol 14(2): pp.553 – 563 33 Yoon HH., Jung BY., Seo YK., Song KY and Park JK (2010) In vitro hepatic differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell Process Biochemistry 45: pp 1857-1864 34 Zhang Y.N., Lie P.C., Wei X (2009) Differentiation of mesenchymal stromal cells derived from umbilical cord Wharton's jelly into hepatocyte-like cells Cytotherapy 11: pp 548-558 57 ... bào gốc cuống rốn người - Đánh giá biểu gen HNF - 4α tế bào gốc cuống rốn người trước sau xử lý biệt hóa - Phân lập gen HNF - 4α PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TẾ BÀO GỐC 2.1.1 Định nghĩa tế bào gốc. .. tế bào biệt hóa, ta chia tế bào gốc thành nhóm tế bào khác - Dựa vào khả biệt hóa: tế bào tồn năng, tế bào vạn năng, tế bào đa năng, tế bào vài tiềm năng? ?? - Dựa vào vị trí thu nhận: tế bào gốc. .. bào gốc phôi, tế bào mầm, tế bào gốc ung thư biểu mô phôi, tế bào gốc trưởng thành - Dựa vào kiểu tế bào biệt hóa: tế bào gốc tim, tế bào gốc xương 2.1.2.3 Các marker bề mặt tế bào gốc Nghiên cứu