HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ THỊ HỢP CẢI TIẾN KHÁNG MẶN CỦA ĐẬU TƯƠNG THÔNG QUA CHUYỂN GEN TĂNG THẢI LOẠI Na+ QUA MÀNG KHÔNG BÀO VÀ MÀNG TẾ BÀO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Hữu Tôn TS Quách Ngọc Truyền NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Vũ Thị Hợp i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phan Hữu Tôn TS Quách Ngọc Truyền người thầy, tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện Cây lương thực Cây thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Vũ Thị Hợp ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng .v Danh mục biểu đồ vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract .x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học .4 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .4 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung đậu tương ảnh hưởng mặn lên sinh trưởng phát triển đậu tương 2.1.1 Giới thiệu chung đậu tương 2.1.2 Đậu tương DT26 10 2.1.3 Ảnh hưởng mặn lên sinh trưởng phát triển đậu tương .13 2.2 Cơ chế kháng mặn trồng 16 2.2.1 Cơ chế chung 16 2.2.2 Các chế bảo vệ trồng trước stress mặn 17 2.3 Cơ chế chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 21 2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ứng dụng chuyển gen vào thực vật 21 2.3.2 Cơ chế xâm nhập lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens 22 iii 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 24 2.4 Chọn tạo giống cho chịu mặn 26 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 28 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị 28 3.3 Quy trình chuyển gen 29 3.4 Nghiên cứu chuyển gen 30 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu chuyển gen vào giông đậu tương ĐT26 30 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ AS (Acetosyringone) lên hiệu chuyển gen nhờ A tumefaciens vào đậu tương .30 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu chuyển gen nhờ A tumefaciens vào đậu tương 31 Phần Kết thảo luận 36 4.1 Thiết kế vector nhị phân mang gen cần chuyển ATAVP1 VÀ ATNHX1 36 4.2 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu chuyển GEN A.tumefaciens 37 4.3 Ảnh hưởng nồng độ as đến hiệu chuyển GEN 38 4.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 39 4.5 Kết chọn lọc chuyển GEN T1 41 4.6 Kết đánh giá chọn lọc đậu tương chuyển gen kháng mặn hệ T1 43 4.7 Năng suất chuyển GEN điều kiện mặn 46 Phần Kết luận kiến nghị 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 Tài liệu tham khảo 49 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Sản lượng đậu tương vùng nước gia đoạn 2010 – 2015 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng 100g hạt đậu nành Bảng 2.3 Thành phần acid amin protein đậu nành .9 Bảng 2.4 Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) ảnh hưởng trồng 14 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn A.tumefaciens khác đến hiệu chuyển gen vào đậu tương 37 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ AS bổ sung khác đến hiệu chuyển gen đậu tương 39 Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy tới chuyển gen AtAVP1 AtNHX1 nhờ vi khuẩn A tumefaciens 40 Bảng 4.5 Số chồi chuyển gen thu 41 Bảng 4.6 Khối lượng chất khô hai nồng độ 0mM 100mM 45 v DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.2 Khối lượng chất khô, trọng lượng rễ, trọng lượng thân đậu tương chuyển gen hai nồng độ muối 0mM 100 mM 45 Biểu đồ 4.4 Cường độ quang hợp .46 Biểu đồ 4.5 Độ xanh 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Diện tích, suất sản lượng đậu tương giới từ 2003 đến 2013 .5 Hình 2.2 Sản lượng đậu tương nước giai đoạn 2000 – 2015 Hình 2.3 Diện tích trồng đậu tương Việt Nam Hình 2.4 Thử nghiệm giống đậu tương ĐT26 Giao Thủy – Nam Định vụ xuân 2013 10 Hình 2.5 Tóm tắt giai đoạn sinh trưởng phát triển đậu tương ĐT26 11 Hình 2.6 Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng 12 Hình 2.7 Giai đoạn sinh trưởng thực (R) 13 Hình 2.8 Cơ chế kháng mặn 16 Hình 2.9 Sơ đồ chế kháng mặn thực vật 17 Hình 2.10 Cấu tạo vùng T-Plasmid vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 21 Hình 2.11 Cơ chế gây bệnh Agrobacterium tumefaciens 22 Hình 2.12 Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 24 Hình 3.1 Minh họa phương pháp ống nhựa 34 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nảy mầm 34 Hình 4.1 Vecter nhị phân tăng cường biểu hai gen AtAVP1 AtNHX1 sử dụng để chuyển vào đậu tương……………………………39 Hình 4.2 Callus công thức (A) Gen AtNHX, (B) gen AtAVP 38 Hình 4.3 Một số hình ảnh chuyển gen đậu tương điều kiện nồng độ AS thêm vào 200uM, mật độ vi khuẩn OD=0,8, thời gian đồng ni cấy ngày 41 Hình 4.4 Cây chuyển gen đối chứng sơn 42 Hình 4.5 Kết chạy điện di với gen Avp1 42 Hình 4.6 Kiểm tra mức độ biểu phân tử chuyển gen 43 Hình 4.7 Đậu tương chuyển gen AtAVP1 (A2 ADN A3) AtNHX1 (N1 ADN N3) điều kiện đối chứng(nồng độ muối 0mM) điều kiện thí nghiệm (nồng độ muối 0mM 100) 44 Hình 4.8 Kết sử lý mặn sau tuần 47 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thị Hợp Tên luận văn: Cải tiến kháng mặn đậu tương thông qua chuyển gen tăng thải loại Na+ qua màng không bào màng tế bào Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 24.03.00.48 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Chuyển thành cơng hai gen AtAVP1 AtNHX1 có chức chứng minh điều khiển trình loại thải Na+ khỏi sinh chất nhằm tăng khả kháng mặn đậu tương - Xác định nồng độ vi khuẩn gây nhiễm, nồng độ AS thời gian đồng nuôi cấy tối ưu cho việc chuyển gen thành cơng - Phân tích hiệu quả, chọn lọc chuyển gen tốt hệ, To T1 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực theo phương pháp nuôi cấy mơ hành, thí nghiệm bố trí công thức với lần lặp lại, số mẫu/công thức 50 mẫu thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng lần lặp lại, số mẫu/công thức mẫu với yếu tố phân tích sinh lý Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2007, IRRISTAT 5.0 Kết kết luận: Bố trí thí nghiệm theo mục đích đề xác định được: i) Mật độ vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefasien giá trị OD = ),8 tương đương với mật độ vi khuẩn 192x109 Trong tỉ lệ chồi mang gen chuyển rễ cao chồi đạt 83,46% gen AtNHX1 87,6% với gen AtAVP1 ii) Nồng độ AS thích hợp cho chuyển gen 200ul Ở nồng độ tỷ lệ chồi mang gen chuyển rễ đạt gen AtNHX1 90,6% với gen AtAVP1 87,43 iii) Thời gian đồng nuôi cấy tối ưu ngày Tỉ lệ chồi rễ đạt gen AtNHX1 87,56% 88,43% với gen AtAVP1 iv) Đã thu tỉ lệ T0 gen AtAVP1 73,59 AtNHX1 80 Các T0 trồng nhà lưới, 100% hoa kết cho hạt Chọn ngẫu nhiễn hạt dòng 13 T0 đem gieo trồng thu hệ T1 qua phân tích phân tử thu có ¾ AtAVP1 có biểu gen 9/9 AtNHX có biểu gen chuyển v) Các có gen chuyển T1 đem trồng chậu cát theo phương pháp ống nhựa PVC có cải biến.kết viii thu cho thấy có khả kháng mặn nồng độ muối 100mm (tương đương với hàm lượng muối 5,8g/l) Khả quang hợp chuyển gen cao so với đối chứng hàm lượng chất khô độ xanh chiều cao chúng hạn chế so với đối chứng Sau tuần sử lý mặn chuyển gen có hoa kết khơng tạo hạt Như chuyển gen có khả chịu mặn nồng độ 100mM khả tạo hạt ix đối chứng Như tỷ lệ dương tính qua sàng lọc PCR gen AtAVP1 xấp xỉ 68% Đối với giả định chuyển gen AtNHX1 có 10/14 xuất vạch khoảng 2,3kp phù hợp với kích thước đoạn gen AtNHX1 thiết kế cấu trúc vector chuyển, băng không xuất trường hợp đậu tương đối chứng Như tỷ lệ dương tính qua sàng lọc PCR gen AtNHX1 xấp xỉ 71% 4.6 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHỌN LỌC CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG MẶN THẾ HỆ T1 Sau tiến hành tách ADN tổng số chạy Norther chúng tơi thu kết hình Hình 4.6 Kiểm tra mức độ biểu phân tử chuyển gen Kết Southern dòng đậu tương chuyển gen AtAVP1(dòng A2, A3, A4) AtNHX1(dòng N1, N2 N3) Đối chứng DT26 Kết cho thấy 13 dòng chọn ngẫu nhiên (4 dòng chuyển gen AtAVP1 dịng chuyển gen AtNHX1) có dòng A2.2, A3.7 A4.1 gen AtAVP1 có diện gen cịn gen AtNHX1 tất dịng có diện gen 43 Hình 4.7 Đậu tương chuyển gen AtAVP1 (A2 ADN A3) AtNHX1 (N1 ADN N3) điều kiện đối chứng(nồng độ muối 0mM) điều kiện thí nghiệm (nồng độ muối 0mM 100) Ảnh chụp sau tuần xử lý Sau bốn tuần sử lý mặn nồng độ 100mM sinh trưởng hẳn so với nồng độ đối chứng mật độ ít, màu xanh giảm thân không phát triển Tuy nhiên nồng độ 100mM so với đối chúng ĐT26, dịng chuyển gen có vượt trội hẳn Cụ thể A2.2, A3.7, N1.34 N3.10 có sinh trưởng, nguyên vẹn chiều cao có tăng trưởng, đối chứng ĐT26 ngược lại, sinh trưởng, héo vàng có biểu stress mặn: nước, chứng năng, héo úa khơng cịn khả sinh trưởng Bây tiến hành thu hoạch để xác đinh khác khối lượng chất khô hai nồng độ Các thu hoạch tránh làm đứt rễ rửa để riêng túi giấy có ghi tên mẫu Các túi mẫu sấy nhiệt độ 65oc ngày đem cân để xác dịnh tổng lượng Sau chúng cắt riêng thân rễ để xác định trọng lượng thân rẽ mẫu 44 Bảng 4.6 Khối lượng chất khô hai nồng độ 0mM 100mM Biểu đồ 4.2 Khối lượng chất khô, trọng lượng rễ, trọng lượng thân đậu tương chuyển gen hai nồng độ muối 0mM 100 mM Ở nồng độ 0mM khối lượng tương tự ĐT26 có phần vượt trội nhiên sau xử lý mặn ĐT26 có khối lượng giảm hẳn Qua ta thấy xử lý mặn phát triển bị rối loạn, hàm lượng chất tạo giảm đáng kể (gần 1/2) Các chuyển gen có tỉ lệ quang hợp cao hơn, độ ổn định màng tế bào cao hơn(dựa ước tính độ rị rỉ ion), hàm lượng chất diệp lục tăng cao 45 Biểu đồ 4.4 Cường độ quang hợp Biểu đồ 4.5 Độ xanh Duy trì tốt hoạt động quang hợp, ổn định hệ thống màng trì độ xanh cho dường yếu tố định để dịng chuyển gen có khả tăng trưởng tốt hơn, chuyển gen có chiều cao cao sinh khối cao hẳn Trung bình, chuyển gen có chiều cao vượt 27%, sinh khối chồi vượt 65% sinh khối rễ vượt 50% so với đối chứng ĐT26 Như so với đối chứng chuyển gen có khả chống chịu mặn tốt hơn, có khả sinh trưởng phát triển với nồng độ muối 100mM Đây hướng cho tạo giống đậu tương kháng mặn nước ta 4.7 NĂNG SUẤT CÂY CHUYỂN GEN TRONG ĐIỀU KIỆN MẶN Cây chuyển gen hệ T1 có thích nghi với điều kiện mặn 100mM Chúng tiếp tục xử lý mặn tuần tiếp để kiểm tra xuất chuyển gen so với đối chúng xem tỉ lệ giảm phần trăm Chúng trì nồng độ muối 100mM tháng lần lặp thí 46 nghiệm trước Tuy nhiên sau tuần tất chết trước hoa kết Như nồng độ muối 100mM cao so với đậu tương để chúng tồn tạo hạt Hình 4.7 Kết sử lý mặn sau tuần Sau tuần sử lý nồng độ 100mM bị héo vàng, thân bị khô khả sinh trưởng Ngưỡng chịu mặn đậu tương mức nồng độ muối hoà tan 0,3% (FAO) Khi chuyển gen kháng mặn giới hạn chịu mặn vượt ngưỡng lên 100mM (nồng độ muối hòa tan 0,58%, EC = 14,58 mS/cm tương đương với đất mặn) Tuy nhiên có khả thích nghi cá thể chuyển gen khơng có khả sinh trưởng phát triển để hoa tạo tạo hạt 47 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã chuyển thành công vector chuyển gene mang hai gen ATAVP1 AtXNH1 vào đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đã xác định OD tối ưu cho hiệu chuyển gen OD= 0,8 cho hiệu chuyển gen tốt Đã xác định nồng độ AS tối ưu cho hiệu chuyển gen 200ul cho hiệu chuyển gen tốt Đã xác định thời gian dồng nuôi tối ưu cho hiệu chuyển gen ngày Đã thu 13 T1 chuyển gen có khả kháng mặn, dầy hơn, chiều cao thấp so với đối chứng Khả quanh hợp cao hàm lượng ion Na cao so với đối chứng Tuy nhiên chưa đánh giá suất hàm lượng muối cao so với ngưỡng chịu đựng nên có hoa kết không đậu hạt 5.2 KIẾN NGHỊ Gieo hạt T1 điều kiện hàm lượng mối thấp để hình thành đời T2, đánh giá chọn lọc tiếp T2 đồng hợp tử gen chuyển 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Chí Bửu 2012 Phát triển trồng biến đổi gen làm thức ăn gia súc Việt Nam, tiềm thách thức Bùi Chí Bửu, Nguyễn Văn Chương, Trương Quốc Ánh, Nguyễn Thị Lang ctv 2010 Chọn tạo giống đậu tương suất cao, ngắn ngày, kháng bệnh Gỉ sắt cho tỉnh phía Nam Trong Kỷ yếu Khoa học 2005 – 2010, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam tr 40-68 Bùi Thị Thúy Hiền, 2010, Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen GUS vào giống đậu tương DT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, khóa luận tốt nghiệp Đào Quang Vinh, Chu Thị Viên, Nguyễn Thị Thanh (1994) Giống đậu tương VN-1, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học Nơng Nghiệp 1993 tr 60 - 64 Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn, 2014 Đánh giá khả chịu mặn số giống đậu nành, Tạp chí khoa học trường đâị học Cần Thơ tr 179 – 188 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Tài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999) Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, Tr 234 – 239, Tr 32,347-351 Nguyễn Quang Thạch, Bài giảng công nghệ sinh học thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng 2007 Kết chọn tạo giống lạc, đậu tương biện pháp kỹ thuật thâm canh để đạt suất cao năm 2006 VAAS Nguyễn Thị Thanh Nga, 2015, Nghiên cứu tạo dòng dưa hấu chuyển gen kháng bệnh virut đốm vòng PRSV, Luận văn tiến sĩ 10 Nguyễn Văn Phong, HongDi Chen, ChangYuan Ji, Wei Teng, JingWen Li, Ying Wang, XiaoWei Li, Waqas Ahmad, Phạm Văn Điền, QingYu Wang, 2014, Ảnh hưởng só nhân tố tới hiệu suất chuyển gen GmMYBI2A đậu tương, tạp chí khoa học công nghệ lâm nghiệp (2) 11 Phạm Văn Thiều 2000 Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm đậu tương NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 12 Trần Thị Phương Liên (1998) “Chuyên đề 3: Cơ chế phân tử tính chịu hạn thực vật” 49 Tiếng Anh: 13 Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K ADN Yamaguchi-Shinozaki K (2003) “Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) ADN At MYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisis acid signaling”, Plant Cell, 15, pp 63-78 14 Abel G.H., MacKenzie A.J (1964) Salt tolerance of soybean varieties (Glycine max L Merrill) during germination and later growth Crop Science 4:157-161 15 Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997) Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant Plant Cell 9: 841-857 16 Allen G., Wyn Jones R., Leigh R (1995) Sodium transport measured in plasma membrane vesicles isolated from wheat genotypes with differing K+/Na+ discrimination traits Plant Cell Environ 18:105-115 17 Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., Blumwald E (1999) Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis Science 285:1256-1258 18 Asif M.A., Zafar Y., Iqbal J., Iqbal M.M., Rashid U., Ali G.M., Arif A., Nazir F (2011) Enhanced expression of AtNHX1, in transgenic groundnut (Arachis hypogaea L.) improves salt and drought tolerence Molecular biotechnology 49:250-256 19 Ashraf M., Wu L (1994) Breeding for salinity tolerance in plants Critical Reviews in Plant Sciences 13:17-42 20 Asif M.A., Zafar Y., Iqbal J., Iqbal M.M., Rashid U., Ali G.M., Arif A., Nazir F (2011) Enhanced expression of AtNHX1, in transgenic groundnut (Arachis hypogaea L.) 21 Atwell B.J., Kriedemann P.E., Turnbull C.G (1999) Plants in action: adaptation in nature, performance in cultivation Macmillan Education AU 22 Bhandal I., Malik C (1988) Potassium estimation, uptake, and its role in the physiology and metabolism of flowering plants International Review of Cytology 110:205-254 23 Bhaskaran S., Savithramma D.L (2011) Co-expression of Pennisetum glaucum vacuolar Na(+)/H(+) antiporter and Arabidopsis H(+)-pyrophosphatase enhances salt tolerance in transgenic tomato J Exp Bot 62:5561-70 DOI: 10.1093/jxb/err237 24 Bowdish D.A., Perlak K.S., Marrone F.J., MvCormick P.G., Niedermeyer S.M., 50 Dean J.G., Kusano-Kretzmer D.A., Mayer K., Rochester E.J., Rogers D.E., ADN Fraley S.G., 1987, Insect tolerant tomatoplants, BioTechnology 5:807-812 25 Breedam W.V., Gorp H.V., Zhang J.Q., Crocker P.R., Delputte P.L., Nauwynck H.J., 2010, The M/GP5 glycoprotein complex of porcine reproductive ADN respiratory syndrome virus binds the sialoadhesin receptor in a sialic aciddependent manner, PLoS Pathog 6:e1000730 26 Celebi-Toprak F., Behnam B., Serrano G., Kasuga M., Yamaguchi-Shinozaki K., Naka H., Watanabe JA., Yamanaka S ADN Watanabe KN (2005) “Tolerance to salt stress of the transgenic Tetrasomic Tetraploid Potato, Solanum tuberosum cv Desiree appears to be induced by the DREB1A gene ADN rd29A promoter of Arabidopsis thaliana” Breeding Sciences, 55, pp 311-319 27 Chang R., Chen Y., Shao G., Wan C (1994) Effect of salt stress on agronomic characters and chemical quality of seeds in soybean Soybean Sci 13:101-105 28 Citovsky V., Wong M.L., Zambryski P., 1989, Cooperative interaction of Agrobacterium ViE2 protein with single - strADNed DNA: implications for the T - DNA transfer process, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.86: 1193 – 1197 29 Cuin T.A., Bose J., Stefano G., Jha D., Tester M., Mancuso S., Shabala S (2011) Assessing the role of root plasma membrane and tonoplast Na +/H+ exchangers in salinity tolerance in wheat: in planta quantification methods Plant Cell Environ 34:947-61 DOI: 10.1111/j.1365-3040.2011.02296.x 30 Dahai Gao, Qian Wang, Yuxia Wu, Haiyan Xu, Qiushi Yu, Jiaquan Liu, 2007, Microsatelitte DNA loci from the typical halophyte Thellungiella salsuginea 31 Federici B.A., 1998, Broad-scale leaf pest-killing plants to be true test, California Agriculture 52:14-20 32 Flowers, Colmer, 2008, New phytologist 33 Guihua S., Jingzhi S (1986) Preliminary studies on the evaluation of salt tolerance in soybean varieties Scientia Agricultura Sinica 6:004 34 Gupta -ADNrade O., Loza-Rubio E., Olivera-Flores T., Fehervari-Bone T., Gomez-Lim M.A., 2006, Expression of the Newcastle disease virus fusion protein in transgenic maize ADN immunological studies, Transgenic Res 15:455–463 51 35 Hooykaas V.S., Hooykass P.J.J., Schilperoot R.A., 1984, Expression of Ti – plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens, Vol.311: 763 - 764 36 Kamachi S., Mochizuki A., Nishiguchi M., Tabei Y 2007 Transgenic Nicotiana benthamiana plant, Cell Rep, 26(8): 1283-8 37 Lang N.T., Yanagihara s., Bui C 2001 A microsatellite marker for a gene conferring salt tolerance on rice at the vegetative and reproductive stages Sabrao 33:1-10 38 Lenis J.M., Ellersieck M., Blevins D.G., Sleper D.A., Nguyen H.T., Dunn D., Lee J.D., Shannon J.G (2011) Differences in Ion Accumulation and Salt Tolerance among Glycine Accessions Journal of Agronomy and Crop Science 197:302-310 DOI: 10.1111/j.1439-037X.2011.00466.x 39 Li J., Yang H., Peer W.A., Richter G., Blakeslee J., Bandyopadhyay A., Titapiwantakun B., Undurraga S., Khodakovskaya M., Richards E.L., Krizek B., Murphy A.S., Gilroy S., Gaxiola R (2005) Arabidopsis H+-PPase AVP1 regulates auxin-mediated organ development Science 310:121-5 DOI: 10.1126/science.1115711 40 Li Z., Baldwin C.M., Hu Q., Liu H., Luo H (2010) Heterologous expression of Arabidopsis H+-pyrophosphatase enhances salt tolerance in transgenic creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.) Plant Cell Environ 33:272-89 DOI: 10.1111/j.1365-3040.2009.02080.x 41 Dr Mea-Wan Ho, Prof.Joe Cummins, 2009, Saline Agricultule to Feed and Fuel the World the typica halophyte Thellungiella salsuginea 42 Mansour M.M.F., Lee-Stadelmann O.Y., Stadelmann E.J (1993) Solute Potential and Cytoplasmic Viscosity in Triticum aestivum and Hordeum vulgare under Salt stress A Comparison of Salt Resistant and Salt Sensitive Lines and Cultivars J Plant Physiol 142:623-628 43 Marrs K.A (1996) The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants Annu Rev Plant Biol 47:127-158 44 Marschner H., Marschner P (2012) Marschner's mineral nutrition of higher plants Academic press 45 Mathieu M., Winters E.K., Kong F., Wan J., Wang S., Eckert H., Luth D., Paz M., Donovan C., Zhang Z., Somers D., Wang K., Nguyen H., Shoemaker R.C., Stacey G., Clemente T (2009) Establishment of a soybean (Glycine max Merr 52 L) transposon-based mutagenesis 10.1007/s00425-008-0827-9 46 repository Planta 229:279-89 DOI: Mengeling W.L, Lager K.M., ADN Vorwald AC, 1996a, “An overview on vaccination for porcine reproductive ADN respiratory syndrome”, In Proc 23d Allen D, Leman Swine Conf, pp, 139- 142 47 Meulenberg J.J et al, 1998, Localization ADN fine mapping of antigeneic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive ADN respiratory syndrome virus with monoclonal anti- bodies.Virology 252, pp.106–11 48 Nataga et al, 2004, Tobaco BY-2 cells: The present ADN beyond, In Vitro Celllular & Developmental Biology PlantVol.40, No.2, pp.163-166 49 Olhoft PM, Flagel LE, Christopher MD and Somers DA 2003 Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method Planta 216: 723-735 50 Pasapula V., Shen G., Kuppu S., Paez-Valencia J., Mendoza M., Hou P., Chen J., Qiu X., Zhu L., Zhang X., Auld D., Blumwald E., Zhang H., Gaxiola R., Payton P 2011 Expression of an Arabidopsis vacuolar H+-pyrophosphatase gene (AVP1) in cotton improves drought- and salt tolerance and increases fibre yield in the field conditions Plant Biotechnol J 9:88-99 DOI: 10.1111/j.14677652.2010.00535.x 51 Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K.B., Wang K., 2004 Assessment of conditions affecting Agrobacterium – mediated soybean tranfomation, Plant cell Rep, 25, pp, 206 - 213 52 Perlak F.J., Stone T.B., Muskopf Y.N., Petersen L.J.,Parker G.B., McPherson S.A., Wyman J., Love S., Reed G., Biever D ADN Fischhoff D.A., 1993, Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles, Plant Molecular Biology 22:313-321 53 Phang T.H., Shao G., Lam H.M (2008) Salt tolerance in soybean J Integr Plant Biol 50:1196-212 DOI: 10.1111/j.1744-7909.2008.00760.x 54 Schilling R.K., Marschner P., Shavrukov Y., Berger B., Tester M., Roy S.J., Plett D.C (2014) Expression of the Arabidopsis vacuolar H(+) -pyrophosphatase gene (AVP1) improves the shoot biomass of transgenic barley and increases grain yield in a saline field Plant Biotechnol J 12:378-86 DOI: 10.1111/pbi.12145 53 55 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai, La Cao Thang, 2008, Tranfomation effciencies ò the soybean Variety PC 19 using Agrobacteriumtumefasien and the cotyledonary node method, Omerice, 16 pp 1-8 56 Wan C., Shao G., Chen Y., Yan S (2001) Relationship between salt tolerance and chemical quality of soybean under salt stress Chinese journal of oil crop sciences/Zhongguo nong ye ke xue yuan you liao zuo wu yan jiu suo zhu ban 24 pp 67-72 57 Wang J., Van Ginkel M., Podlich D., Ye G., Trethowan R., Pfeiffer W., DeLacy I.H., Cooper M., Rajaram S (2003) Comparison of two breeding strategies by computer simulation Crop Science 43 pp 1764-1773 58 Xiong L., Zhu J.K (2002) Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress Plant Cell Environ 25 pp 131-139 59 Yang L., Frey M.L., Yoon K.J., Zimmerman J.J., Platt K.B., 2000, Categorization of North American porcine ADN reproductive ADN respiratory syndrome viruses: epitopic profiles of the N, M, GP5 ADN GP3 proteins ADN susceptibility to neutralization, Arch Virol 2000,145 pp.1599–619 60 Yeo A (1998) Molecular biology of salt tolerance in the context of whole-plant physiology J Exp Bot 49 pp 915-929 61 Zeng P, Vadnais DA, Zhang Z, Polacco JC 2004 Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] 62 Zhou Y.J., Yu H., Tian Z.J., Li G.X., Hao X.F., Yan L.P., Peng J.M., An T.Q., Xu A.T., Wang Y.X., Wei T.C., Zhang S.R., Cai X.H., Feng L., Li X., Zhang G.H., Zhou L.J., Tong G.Z., 2009, Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive ADN respiratory syndrome virus isolates in China from 2006 to 2008, Virus Res, 144, 136–144 63 Zhu J.K (2001) Plant salt tolerance Trends Plant Sci pp 66-71 Trang web: 64 http://www.blogsinhhoc.com/2013/01/cau-tao-va-chuc-nang-khong-bao.html 65 http://www.egohabitat.com/ 66 Vinasoy (2012) Tác dụng chống lão hóa da Isoflavones đậu nành, truy cập ngày 3/3/2017 http://suckhoe.vnexpress.net/tin-tuc/khoe-dep/tham-my/tacdung-chong-lao-hoa-da-cua-isoflavones-dau-nanh-2325175.html 54 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh Loại mơi trường Kí hiệu Môi trường cảm ứng GM Thành phần 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8 Phụ lục 2: Thành phần môi trường dùng cho chuyển gen đậu tương Agrobacterium tumefaciens Môi trường Thành phần nẩy mầm (GM) Môi trường lây Môi trường Môi trường Môi nhiễm (CCM) tạo chồi (SIM) kéo dài lóng trường tạo (SEM) rễ (RM) 1X (4,3g) 1X(4,3g)) MS Salts (Duchefa) - - - B5 salts (Duchefa) 1X (3,05g) 1/10X (0,3g) 1X (3,05g) - - 1X 1X 1X 1X 1X - 20 mM mM mM mM 2% 3% 3% 3% 2% - 0,35% - - - 0,3% - 0,3% 0,3% 0,3% 5,8 5,4 5,7 5,7 B5 vitamins (Duchefa) MES (Duchefa ) Sucrose (Duchefa,w/v) Agar, (Sigma, w/v) Phytagel (Sigma, w/v) pH 5,7 -1 50 mg l-1 Asparagine (Sigma, w/v) - - - 50 mg l Glutamine (Sigma, w/v) - - - 50 mg l-1 50 mg l-1 Indole-3-acetic acid (Sigma) - - - 0,1 mg l-1 - Zeatin riboside (Duchefa) 6-benzyl- aminopurine (Sigma) Gibberrellic acid (Sigma) - 1,67 mg l 0,25 mg l L-Cysteine (Sigma) 2,2 mM Sodium thiosulfate (Sigma) 1,0 mM DTT (Invitrogen) 1,0 mM mg l -1 1,67 mg l -1 -1 -1 0,5 mg l - -1 Ticarcillin (Duchefa ) 60 mg l-1 60 mg l-1 Cefotaxime (Duchefa) 100 mg l-1 100 mg l-1 100 mg l-1 Biotech/Duchefa) 50 mg l-1 50 mg l-1 Glufosinate-ammonium (Sigma) 10 mg l-1 mg l-1 Vancomycine 60 mg l-1 (Gold50 mg l-1 mg l-1 Indole-3-butyric acid (Sigma) 55 Phụ lục Thành phần môi trường nuôi tạo dịch huyền phù vi khuẩn Môi trường Thành phần g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l YEP đặc agar, pH = YEP lỏng g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = Phụ lục 4: Thành phần dung dịch Hoagland Thành Phần Dung dịch gốc mL dung dịch gốc/1L Đa lượng 2M KNO3 202 g/L 2.5 2M Ca(NO3)2•4H2O 472 g/L 2.5 Iron (Sprint 138 iron chelate) 15 g/L 1.5 2M MgSO4•7H2O 493 g/L 1M NH4NO3 80 g/L H3BO3 2.86 g/L MnCl2•4H2O 1.81 g/L ZnSO4•7H2O 0.22 g/L Vi lượng 56 CuSO4•5H2O 0.051 g/L H2MoO4•H2O 0.09 g/L Na2MoO4•2H2O 0.12 g/L 136 g/L Phosphate 1M KH2PO4 57 ... sử lý mặn sau tuần 47 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thị Hợp Tên luận văn: Cải tiến kháng mặn đậu tương thông qua chuyển gen tăng thải loại Na+ qua màng không bào màng tế bào Ngành:... thông qua chuyển gen tăng thải loại Na+ qua màng không bào màng tế bào? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích - Tạo chuyển gen AtAVP1 AtNHX1 có chức chứng minh điều khiển trình loại thải Na+ khỏi... kháng mặn thực vật Nguồn: thucvathoc.com 2.2.2 Các chế bảo vệ trồng trước stress mặn 2.2.2.1 Vận chuyển Na vào không bào Không bào bào quan tế bào chất “túi” chứa nước chất tan tích nước tế bào