HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHUNG MỸ LOAN NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (RICE YELLOW STUNT VIRUS) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.01.12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Viết Cường tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm nghiên cứu Bệnh nhiệt đới- Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Chung Mỹ Loan iii MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract xii Phần Mở đầu .1 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu .4 2.1 Lịch sử phát bệnh .4 2.2 Triệu chứng bệnh .5 2.3 Lan truyền virus vàng lụi 2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh 2.5 Phân loại, hình thái đặc điểm gen virus RYSV 11 2.5.1 Phân loại 11 2.5.2 Hình thái phân tử virus (virion) tổ chức gen 12 2.6 Biến nạp dna plasmit vào tế bào E.coli phương pháp xung điện 14 2.7 Kỹ thuật biểu gen vi khuẩn 15 2.7.1 Hệ biểu gen E.coli 15 2.7.2 Hệ vector biểu pET28a 16 2.7.3 Cơ chế cảm ứng biểu IPTG 18 2.8 Phương pháp chẩn đoán virus ELISA 18 2.8.1 Nguyên lý phương pháp huyết học ứng dụng 18 2.9 Chẩn đoán virus RYSV 20 iv Phần Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu dụng cụ nghiên cứu .21 3.2.1 Dòng vi khuẩn E.coli 21 3.2.2 Chất kháng sinh 21 3.2.3 Hóa chất, dung dịch đệm 21 3.2.4 Kit thương mại 21 3.2.5 Môi trường 21 3.2.6 Các loại đệm thực kiểm tra ELISA 22 3.2.7 Dụng cụ nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 23 3.4 Các phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng 23 3.4.2 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 23 3.4.3 Phương pháp bảo quản mẫu 24 3.4.4 Phương pháp nuôi rầy 24 3.4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta xung điện 24 3.4.6 Kỹ thuật điện di gel agarose 25 3.4.7 Kiểm tra sản phẩm miniprep 26 3.4.8 Phương pháp SDS-PAGE 26 3.4.9 Phương pháp tinh chiết protein tái tổ hợp .27 3.4.1 Phương pháp PTA-ELISA 27 3.4.12 Phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc .28 Phần Kết thảo luận .29 4.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016 29 4.1.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2016 tỉnh Bắc Ninh 29 4.1.2 Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2016 Hiệp Hòa (Bắc Giang) 30 4.2 Biến nạp cấu trúc PET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (De3) đặc trưng phân tử gen G 31 4.2.1 Biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3) 31 v 4.2.2 Giải trình tự gen G 34 4.2.3 Đặc trưng phân tử gen G 36 4.2.4 So sánh trình tự phân tích phả hệ gen G 40 4.3 Biểu protein g tái tổ hợp vi khuẩn E.coli chủng rosetta (DE3) 43 4.4 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu lúa thu thập từ vùng khác năm 2013- 2014 44 4.4.1 Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus phận lúa từ mẫu thu thập 44 4.4.2 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu lúa thu thập từ vùng khác 46 4.5 Đánh giá điều kiện phản ứng ELISA 47 4.5.1 Đánh giá độ hịa lỗng kháng nguyên 47 4.5.2 Đánh giá độ hịa lỗng kháng huyết 48 4.5.3 Đánh giá độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp 49 Phần Kết luận đề nghị 53 5.1 Kết luận 53 Tài liệu tham khảo 54 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật ICTV Ủy ban phân loại danh pháp virus quốc tế IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M NNVN Nông nghiệp Việt Nam NST Nhiễm sắc thể OD Giá trị mật độ quang RTYV Rice transitory yellowing virus RXĐĐ Rầy xanh đuôi đen RYSV Rice yellow stunt virus Sở NN-PTNT Sở nông nghiệp phát triển nông thôn RLT Rầy lưng trắng RN Rầy nâu VLDĐ Vàng di động ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay PTA-ELISA Plate-trapped antigen ELISA PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcription-PCR vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần điện di lớp cho gel (8 x 8,5 cm) 26 Bảng 4.1 Điều tra bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 tỉnh Bắc Ninh 29 Bảng 4.2 Diễn biến bệnh vàng lụi lúa virus RYSV Hiệp Hòa- Bắc Giang vụ mùa năm 2016 .30 Bảng 4.3 Điều tra bệnh vàng lụi lúa mùa năm 2016 số xã thuộc huyện Hiệp Hòa- Bắc Giang 30 Bảng 4.4 Biến nạp cấu trúc biểu pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta (DE3) phương pháp xung điện 32 Bảng 4.5 Kiểm tra vi khuẩn Rosetta (DE3) biến nạp PCR cắt enzyme cắt giới hạn 34 Bảng 4.6 Kết giải trình tự gen G virus RYSV từ dòng pET28-G6 35 Bảng 4.7 Các dấu hiệu motif chức protein G nucleorhabdovirus .39 Bảng 4.8 Danh sách loài virus thuộc họ Rhabdoviridae GenBank sử dụng phân tích 40 Bảng 4.9 So sánh trình tự gen mẫu virus RYSV Việt Nam với rhabdovirus khác .41 Bảng 4.10 Phân tích SDS-PAGE kiểm tra biểu protein G vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 44 Bảng 4.11 Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus phận lúa từ mẫu thu thập 45 Bảng 4.12 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu bệnh khô thu thập từ vùng bị bệnh khác 46 Bảng 4.13 Kiểm tra ELISA phát có mặt virus RYSV qua năm 2013, 2014 47 Bảng 4.14 Kiểm tra PTA- ELISA độ hịa lỗng kháng ngun 48 Bảng 4.15 Kiểm tra PTA- ELISA độ hịa lỗng kháng huyết 49 Bảng 4.16 Kiểm tra PTA-ELISA độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp khác 50 Bảng 4.17 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu cỏ thu thập Hiệp Hòa- Bắc Giang 2017 51 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bô dịch bệnh “vàng lụi” Viet Nam, bệnh “vàng lùn” phía Nam Trung Quốc “vàng tạm thời” Đài Loan (các hình tam giác đỏ) năm 60, 70 .5 Hình 2.2 Bệnh vàng lụi với triệu chứng lùn bệnh có gân xanh Hình 2.3 Hình thái lồi rầy xanh truyền RYSV Hình 2.4 Cấu trúc phân tử rhabdovirus (Viralzone, 2009) 13 Hình 2.5 Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata and Chen, 1969) vị trí hình thành phân tử virus RYSV phần ngoại vi nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985) 13 Hình 2.6 Sơ đồ tổ chức gen RYSV 14 Hình 2.7 Sơ đồ vector pET28a vùng chức quan trọng (pET system Manual, phiên 11, 2006) 17 Hình 2.4 Sơ đồ chế điều hịa T7 promotor .18 Hình 2.8 Các kỹ thuật ELISA khác (Hull, 2002) 20 Hình 3.1 Ni rầy xanh đen TTNC BC nhiệt đới phục vụ thí nghiệm 22 Hình 4.1 Điều tra bệnh vàng lụi lúa Hiệp Hòa- Bắc Giang 31 Hình 4.2 Kết biến nạp cấu trúc biểu biện pET28-G6 môi trường LB hai kháng sinh Kanamycin Chloramphenicol (trái) cấy chuyển khuẩn lạc chọn (phải) 33 Hình 4.3 Kiểm tra kết biến nạp cấu trúc pET28-G6 vào vi khuẩn Rosetta 34 Hình 4.4 Các dấu hiệu motif chức protein G mẫu RYSV Việt Nam 38 Hình 4.5 Vị trí sai khác (2 amino acid) vùng đầu C protein G dẫn tới có mặt dấu hiệu nhập nhân (KKKKK) mẫu Việt Nam 38 Hình 4.6 Phân tích phả hệ dựa trình tự tồn gen G rhabdovirus (A) trình tự nu (B) trình tự aa Thanh bar khoảng cách di truyền: (I) Các nucleorhabdovirus; (II) cytorhabdovirus; (III) rhabdovirus hại động vật 42 Hình 4.7 Phân tích SDS-PAGE kiểm tra biểu protein G vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 44 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Chung Mỹ Loan Tên Luận văn: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.01.12 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Điều tra tình hình bệnh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016, nghiên cứu biến nạp tạo chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6, đồng thời kiểm tra, đánh giá xuất virus RYSV mẫu lúa cỏ Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp điều tra, thu thập bảo quản mẫu để nắm tình hình bệnh cung cấp mẫu cho nghiên cứu Biến nạp, kiểm tra sản phẩm tinh chiết gen để tạo chủng Rossetta mang cấu trúc pET28-G6 Kiểm tra ELISA để phát hiện, đánh giá tồn virus lúa cỏ Kết kết luận Qua điều tra bênh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 thấy tỉ lệ bệnh từ 3295% tùy giống lúa Trong có vùng Thái Sơn nhiễm nặng phổ biến giống lúa BC15 Diện tích ruộng bị nhiễm huyện Hiệp Hòa tăng nhanh vòng cuối tháng đầu tháng đến tháng có xu hướng chững lại Biến nạp nhân ni thành cơng dịng vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 Kết kiểm tra cắt kép cho thấy plasmid tái tổ hợp pET28-G6 Kiểm tra trình tự thu thấy trình tự gen G khơng bị lỗi vỡ khung sử dụng để biểu vi khuẩn Kiểm tra ELISA dùng kháng huyết đặc hiệu protein N (sản xuất từ trước) mẫu lúa thu thập từ vùng năm 2013-2014 thấy virus tồn tất phận lúa bệnh tập trung phần lớn đặc biệt phần thân (gần gốc) Các mẫu lúa bệnh cúa cho giá trị OD cao, lượng virus mẫu nhiều Thử nghiệm điều kiện phản ứng ELISA dùng kháng huyết đặc hiệu protein N cho thấy: Độ hịa lỗng dịch (kháng nguyên) tốt 1/30 x So với rhabdovirus khác (bảng 4.9) gen G mẫu RYSV Việt Nam có mức đồng trình tư thấp, mức nucleotide protein Mức đồng trình tự cao so sánh với nucleorhabdovirus với giá trị trung bình 38.9 % (nucleotide) 22.5 % (protein); với cytorhabdovirus với giá trị tương ứng 32.3 %, 12.5 %; thấp với rhabdovirus hại động vật (giá trị tương ứng 29% 8.7 % (Bảng 4.9) Để nghiên cứu mối quan hệ di truyền mẫu virus nghiên cứu rhabdovirus khác, tiến hành xây dựng phả hệ dựa tồn gen G Danh tính virus trình bày Bảng 4.8 Hình 4.6 Phân tích phả hệ dựa trình tự tồn gen G rhabdovirus (A) trình tự nu (B) trình tự aa Thanh bar khoảng cách di truyền (I) Các nucleorhabdovirus; (II) cytorhabdovirus; (III) rhabdovirus hại động vật Trước xây dựng quan hệ phả hệ, virus trình tự đa chuỗi phần mềm ClustalX Cây phả hệ xây dựng phương pháp Neighbor-Joining độ tin cậy mối quan hệ phả hệ tính tốn kỹ thuật “boostrap” với 1000 lặp (phần mềm MEGA6) Các phả hệ 42 trình bày Hình 4.6 Nhìn chung vị trí mẫu cây phù hợp với kết so sánh trình tự Ba mẫu RYSV từ Việt Nam, Trung Quốc Nhật hình thành cụm lồi RYSV riêng biêt với giá trị thống kê bootrap 100% Các virus thuộc chi Nucleorhabdovirus, Cytorhabdovirus rhabdovirus hại động vật hình thành nhóm riêng rẽ (lần lượt I, II, III) với giá trị boostrap cao, từ 99 đến 100% Mối quan hệ dựa trình tự protein rõ ràng trình tự nucleotide 4.3 BIỂU HIỆN PROTEIN G TÁI TỔ HỢP TRONG VI KHUẨN E.COLI CHỦNG ROSETTA (DE3) Mục tiêu thí nghiệm kiểm tra liệu gen G cấu trúc pET28-G6 có biểu vi khuẩn E.coli khơng Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng IPTG cho trình cảm ứng biểu gen G Ưu điểm sử dụng IPTG chúng không vi khuẩn sử dụng nên nồng độ khơng đổi q trình cảm ứng Dịng vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc biểu pET28-G6 nuôi đĩa môi trường LB chứa Chloramphenicol Kanamycin qua đêm Vi khuẩn nuôi tiếp mL môi trường LB lỏng chứa Chloramphenicol Kanamycin quan đêm Tiếp theo, 100 µL dịch vi khuẩn ni ống nghiệm chứa mL môi trường LB lỏng chứa Chloramphenicol Kanamycin (lắc 250 rpm, 37 oC giờ) Vi khuẩn cảm ứng biểu với IPTG nồng độ mM vòng - Dịch vi khuẩn ly tâm để kết tủa vi khuẩn pha cặn sử dụng để phân tích SDS-PAGE Kết kiểm tra SDS-PAGE (Bảng 4.10, hình 4.) cho thấy mẫu vi khuẩn cảm ứng với IPTG (giếng 1, 2) tạo băng với sản phẩm với kích thước ước lượng ~81.5 kDa, trùng với kích thước mong muốn protein tái tổ hợp (75.5 kDa protein G + 5.7 kDa vector) Trong mẫu khơng cảm ứng khơng biểu băng Tuy nhiên, băng hình thành mẫu cảm ứng IPTG mờ, chứng tỏ lượng protein hình thành thấp Để tạo lượng protein G đủ lớn cho gây miễn dịch, cần phải nuôi vi khuẩn lượng lớn tiến hành tinh chiết protein 43 Bảng 4.10 Phân tích SDS-PAGE kiểm tra biểu protein G vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 Giếng SDSPAGE Mẫu vi khuẩn Kết biểu IPTG mM, cảm ứng Có băng ~ 81.5 kDa (mờ) IPTG mM, cảm ứng Có băng ~ 81.5 kDa (mờ) Không cảm ứng Không Hình 4.7 Phân tích SDS-PAGE kiểm tra biểu protein G vi khuẩn Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 Ghi giếng trình bày Bảng 4.10 Băng khác biệt mũi tên M marker protein (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo) 4.4 KIỂM TRA ELISA PHÁT HIỆN VIRUS RYSV TRÊN CÁC MẪU LÚA THU THẬP TỪ CÁC VÙNG KHÁC NHAU TRONG NĂM 2013- 2014 Mặc dù kháng thể đặc hiệu protein G virus RYSV chưa tạo kháng huyết đặc hiệu protein N virus sản xuất thành công Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới năm 2015 Mục tiêu phần nghiên cứu đánh giá khả phát virus vàng lụi kháng huyết sản xuất 4.4.1 Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus phận lúa từ mẫu thu thập Để kiểm tra phân bố nồng độ virus bị bệnh phục vụ cho công tác lấy mẫu bệnh để chẩn đốn, chúng tơi tiến hành kiểm tra ELISA phận 44 lúa bị bệnh (Lá, thân, rễ) Lặp lại thí nghiệm với mẫu khác từ vùng Mẫu nghiền đệm với tỉ lệ 1/5 Bảng 4.11 Kiểm tra ELISA đánh giá mức độ nhiễm virus phận lúa từ mẫu thu thập Mẫu Địa điểm Thời gian Giống 56 Bắc Lý- HH-BG 23/7/2014 Khang dân 41 Hòa Sơn-HH-BG 23/7/2014 Khang dân 25 Hòa Sơn-HH-BG 23/7/2014 Khang dân 55 Ba Vì-HN 28/7/2014 TH47 87 Ba Vì-HN 28/7/2014 Hương thơm 84 Ba Vì-HN 28/7/2014 Hương thơm Bộ phận Lá thân rễ Lá thân rễ Lá thân rễ Lá thân rễ Lá thân rễ Lá thân rễ Ngưỡng Giá trị OD 1,395 1,617 0,559 0,244 1,424 0,697 0,357 2,120 0,418 2,056 0,855 0,590 0,522 0,669 0,945 1,028 0,552 1,481 0,227 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa lỗng mẫu bị bệnh 1/5, độ hịa lỗng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo cơng thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) Virus RYSV nhiễm hệ thống lúa, song phận có hàm lượng virus giống mà có khác phận Từ bảng 4.11 cho thấy, phận thân có hàm lượng virus cao (phần thân sát gốc) Kết đọc ELISA sau để 1giờ cho thấy giá trị OD phận tất mẫu bệnh cao đáng kể so với đối chứng mẫu khỏe tương ứng chứng tỏ virus có mặt vị trí Từ kết cho thấy lấy phận lúa để kiểm tra virus RYSV Trong đó, mẫu thân bệnh có giá trị OD cao (giá trị OD thân mẫu số 25: 2,120), cao gấp lần ngưỡng (trung bình 0,227) Điều chứng tỏ lấy mẫu thân bệnh làm thử nghiệm tốt để phát virus RYSV 45 4.3.2 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu lúa thu thập từ vùng khác Liên tục vụ mùa từ 2014 đến 2016, Trung tâm Nghiên cứu bênh nhiệt đới thu thập mẫu lúa bị bệnh vàng lụi nhiều địa điểm khác miền Bắc Tất mẫu làm khơ bảo quản nhiệt độ phịng Để đánh giá liệu kháng huyết đặc hiệu phát virus bảo quản qua thời gian lâu (3 năm) hay không, tiến hành kiểm tra ELISA mẫu thu thập tỉnh miền Bắc Bảng 4.12 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu bệnh khô thu thập từ vùng bị bệnh khác Mẫu Địa điểm Thời gian Giống Giá trị OD Hòa Sơn-HH-BG 23/07/2014 TH33 0,654 16 Hòa Sơn-HH-BG 23/07/2014 TH33 2,529 Hòa Sơn-HH-BG 23/07/2014 TH33 0,830 17 Hòa Sơn-HH-BG 23/07/2014 TH33 0,155 11 Hịa Sơn-HH-BG 23/07/2014 TH33 2,492 45 Ba Vì-HN 28/07/2014 TH47 1,014 48 Ba Vì-HN 28/07/2014 TH47 1,669 46 Ba Vì-HN 28/07/2014 TH47 0,843 61 Ba Vì-HN 28/07/2014 TH47 1,000 44 Ba Vì-HN 28/07/2014 TH47 0,834 26 Thanh Hóa 30/07/2014 Q5 2,156 12 Thanh Hóa 30/07/2014 Nâu 69 2,188 18 Thanh Hóa 30/07/2014 Q5 0,094 17 Thanh Hóa 30/07/2014 Q5 0,113 16 Thanh Hóa 30/07/2014 Q5 0,284 A85 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,647 A86 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 1,057 A83 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,526 A88 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 1,243 A84 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,242 Ngưỡng 0,227 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa lỗng mẫu bị bệnh 1/5, độ hịa lỗng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) 46 Kết cho thấy 17/20 mẫu kiểm có giá trị OD cao ngưỡng, chí có nhiều mẫu cao nhiều so với mẫu đối chứng khỏe (gấp 10 lần) Điều cho thấy tất vùng Bắc giang, Hà Nội, Thanh Hóa, Hải phịng nhiễm bệnh vàng lụi lúa có nhiều nơi nhiễm bệnh nặng Ngoài ra, mẫu bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng tới năm cho phản ứng tốt Bảng 4.13 Kiểm tra ELISA phát có mặt virus RYSV qua năm 2013, 2014 Mẫu Địa điểm Thời gian Giống Giá trị OD A85 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,647 A86 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 1,057 A83 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,526 A88 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 1,243 A84 Thắng Thúy- HP 07/2014 BC15 0,242 Hải Phòng 04/09/2013 0,304 Hải Phòng 04/09/2013 0,156 Hải Phòng 04/09/2013 0,141 Hải Phòng 04/09/2013 0,115 Hải Phịng 04/09/2013 0,142 Ngưỡng 0,227 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa lỗng mẫu bị bệnh 1/5, độ hịa lỗng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) 4.4 ĐÁNH GIÁ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG ELISA 4.4.1 Đánh giá độ hịa lỗng kháng ngun Thơng thường, phản ứng PTA-ELISA, độ hịa lỗng kháng ngun (dịch cây) sử dụng 1/10 Để đánh giá khả phát virus vàng lụi độ hịa lỗng kháng nguyên khác nhau, tiến hành thí nghiệm mức hịa lỗng 1/5, 1/10, 1/20 1/30 Kết kiểm tra ELISA (Bảng 4.14, Hình 4.8) cho thấy độ hịa lỗng kháng ngun cho kết tốt giá trị OD gấp lần mẫu khỏe; đặc biệt độ hịa lỗngcàng cao thu kết giá trị OD cao độ hịa lỗng 1/30 cho giá trị OD cao 1,833 47 Hình 4.8 PTA-ELISA đánh giá ảnh hưởng độ hòa lỗng Bảng 4.14 Kiểm tra PTA- ELISA độ hịa lỗng kháng ngun Mẫu Độ hịa lỗng kháng ngun 1/5 1/10 1/20 1/30 Mẫu bệnh 1,192 1,392 1,537 1,510 Mẫu bệnh 1,530 1,797 1,689 1,833 Mẫu bệnh 1,277 1,336 1,588 1,748 Mẫu khỏe 0,149 Mẫu khỏe 0,164 Mẫu khỏe 0,180 Mẫu khỏe 0,200 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa lỗng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) 4.4.2 Đánh giá độ hịa lỗng kháng huyết Kháng huyết sản xuất được chứng minh có hiệu để chẩn đoán virus vàng lụi Để đánh giá mức độ hịa lỗng KHT đến khả phát virus, tiến hành thí nghiệm độ hịa lỗng 1/1000, 1/2000, 1/5000 1/10000 Kết kiểm tra ELISA (Bảng 4.15) cho thấy độ hịa lỗng kháng huyết cho kết dương Thậm chí độ hịa loãng 1/10000, KHT 48 cho giá trị OD cao ~ lần mẫu khỏe Kết ELISA cho thấy độ hịa lỗng 1/1000 cho kết tốt nhất, gía trị OD mẫu bệnh cao (1,578) Từ rút kết luận độ hịa loãng kháng huyết tỉ lệ 1/1000 tốt Bảng 4.15 Kiểm tra PTA- ELISA độ hịa lỗng kháng huyết Mẫu Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000 1/2000 1/5000 1/10000 Mẫu bệnh 1,578 1,240 0,698 0,413 Mẫu bệnh 1,321 1,170 0,583 0,466 Mẫu bệnh 0,822 0,960 0,535 0,410 Mẫu khỏe 0,149 Mẫu khỏe 0,164 Mẫu khỏe 0,180 Mẫu khỏe 0,200 Ghi chú: Độ hịa lỗng mẫu bị bệnh 1/5, độ hịa lỗng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo cơng thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) 4.4.3 Đánh giá độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp Phản ứng PTA-ELISA sử dụng KHT đặc hiệu virus vàng lụi cần phải sử dụng kháng thể thứ cấp liên kết enzyme AP Loại kháng thể không tự sản xuất phải mua với giá đắt Việc sử dụng lượng kháng thể thứ cấp phù hợp giúp tiết kiệm kinh phí chẩn đốn Do vậy, cần tiến hành thử phản ứng PTA-ELISA với độ hòa loãng kháng thể thứ cấp khác Kết kiểm tra ELISA (Bảng 4.16) cho thấy OD mẫu sử dụng độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp tỉ lệ 1/5000 cho giá trị cao (2,073 1,019) cịn độ hịa lỗng 1/10000, 1/20000 1/40000 cho giá trị OD thấp không cao giá trị OD lúa khỏe Vậy kết kiểm tra ELISA tốt cần phải sử dụng độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp 1/5000 49 Bảng 4.16 Kiểm tra PTA-ELISA độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp khác Mẫu Độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp 1/5000 1/10000 1/20000 1/40000 Mẫu bệnh 2,073 0,212 0,188 0,135 Mẫu bệnh 1,019 0,181 0,132 0,110 Mẫu bệnh 0,169 0,100 0,094 0,089 Mẫu khỏe 0,149 Mẫu khỏe 0,164 Mẫu khỏe 0,180 Mẫu khỏe 0,200 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa loãng mẫu bị bệnh 1/5, Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe mẫu) 4.5 Phát virus vàng lụi cỏ dại Hình 4.9 Kiểm tra ELISA phát có mặt virus RYSV mẫu cỏ thu thập Hiệp Hịa- Bắc Giang Trong q trình điều tra, nhận thấy bệnh vàng lụi ruộng thường xuất từ lúa, dảnh lúa gần bờ ruộng sau lan dần vào ruộng Quan sát gợi ý có khả bệnh bắt nguồn từ kí chủ phụ rầy xanh bờ ruộng Cho tới nay, lúa biết ký chủ tự nhiên virus vàng lụi Chính vậy, xác định ký chủ phụ cỏ dại virus vàng lụi có ý nghĩa lớn nhằm phòng chống bệnh Do tầm quan trọng việc xác định ký chủ virus vàng lụi, 50 tiến hành thu 48 mẫu cỏ dại thuộc loài (cỏ gừng, cỏ chỉ, cỏ gấu, cỏ đuôi phụng, cỏ chân vịt) ruộng bị bệnh vàng lụi 100% thuộc huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang để kiểm tra ELISA Kết kiểm tra ELISA (Bảng 4.17) cho thấy mẫu cỏ gấu vùng có giá trị OD cao ngưỡng mẫu cỏ gấu Thái sơn (2,902), mẫu cỏ gấu Bắc Lý (1,205) Đặc biệt mẫu cỏ gấu số Thái Sơn có giá trị OD cao đáng kể so với ngưỡng (gấp 10 lần) Vậy có khả cỏ gấu kí chủ phụ virus RYSV gây bệnh vàng lụi lúa Tuy nhiên để có kết luận xác có mặt virus loại cỏ cần tiến hành phản ứng RT-PCR Bảng 4.17 Kiểm tra ELISA phát virus RYSV mẫu cỏ thu thập Hiệp Hòa- Bắc Giang 2017 Mẫu LG1 LG2 LG3 C1 C2 C3 G1 G2 G3 ĐP1 ĐP2 ĐP3 C1 C2 C3 G1 G2 G3 ĐP1 ĐP2 ĐP3 CV1 CV2 CV3 LG1 LG2 Địa điểm Thái Sơn Bắc Lý Hùng Sơn Thời gian Loại cỏ 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Lá gừng 51 Giá trị OD 0,124 0,175 0,242 0,236 0,443 0,243 1,752 1,227 2.902 0,241 0,574 0,338 0,240 0,277 0,195 1,139 1,205 0,818 0,237 0,433 0,197 0,162 0,223 0,160 0,115 0,115 Mẫu LG3 G1 G2 G3 ĐP1 ĐP2 ĐP3 CV1 CV2 CV3 CV1 CV2 CV3 G1 G2 G3 C1 C2 C3 LG1 LG2 LG3 Ngưỡng Địa điểm Hòa Sơn Thời gian Loại cỏ 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ đuôi phụng 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ chân vịt 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ gấu 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Cỏ 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Lá gừng 10/04/2017 Lá gừng Giá trị OD 0,113 0,851 0,140 0,105 0,199 0,318 0,210 0,425 0,183 0,274 0,123 0,235 0,215 0,658 0,771 0,975 0,139 0,269 0,400 0,171 0,175 0,245 0,219 Ghi chú: Độ hịa lỗng kháng huyết 1/1000, độ hịa lỗng mẫu bị bệnh 1/5, độ hịa lỗng kháng thể thứ cấp 1/5000 Cơ chất 1mg/mL Ngưỡng xác định theo cơng thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng cỏ khỏe mẫu) 52 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua điều tra bênh vàng lụi lúa vụ mùa năm 2016 thấy tỉ lệ bệnh từ 32-95 % tùy giống lúa Trong có vùng Thái Sơn nhiễm nặng phổ biến giống lúa BC15 Diện tích ruộng bị nhiễ huyện Hiệp Hịa tăng nhanh vong cuối tháng đầu tháng đến tháng có xu hướng chững lại Biến nạp nhân ni thành cơng dịng vi khuẩn E.coli chủng Rosetta (DE3) mang cấu trúc pET28-G6 Kết kiểm tra cắt kép cho thấy plasmid tái tổ hợp pET28-G6 Kiểm tra trình tự thu thấy trình tự gen G không bị lỗi vỡ khung sử dụng để biểu vi khuẩn Kiểm tra ELISA dùng kháng huyết đặc hiệu protein N (sản xuất từ trước) mẫu lúa thu thập từ vùng năm 2013-2014 thấy virus tồn tất phận lúa bệnh tập trung phần lớn đặc biệt phần thân (gần gốc) Các mẫu lúa bệnh cúa cho giá trị OD cao, lượng virus mẫu nhiều Thử nghiệm điều kiện phản ứng ELISA dùng kháng huyết đặc hiệu protein N cho thấy: Độ hòa loãng dịch (kháng nguyên) tốt 1/30 Độ hịa lỗng kháng huyết tốt 1/1000 Độ hịa lỗng kháng thể tốt 1/5000 Kiểm tra ELISA cỏ cho thấy mẫu cỏ gấu vùng có giá trị OD cao so với ngưỡng, cỏ gấu kí chủ phụ virus RYSV nguồn lây nhiễm bệnh từ vụ sang vụ khác từ vùng sang vùng khác 5.2.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu để sản xuất kháng huyết virus RYSV, phục vụ cho nghiên cứu chẩn đoán ứng dụng để phát sớm bệnh vàng lụi lúa đồng ruộng Tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu kí chủ phụ RYSV đồng thời kí chủ phụ rầy xanh đuôi đen để xác định rõ khả tồn lan truyền bệnh Từ đưa cách khắc phục phòng chống bệnh hợp lý 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Báo Bắc Giang (2011) Tập trung chăm sóc vụ mùa Báo KTNT (15/9/2010) Miền Bắc nguy xuất bệnh vàng lụi lúa tác giả Hữu Nguyên Báo NNVN (2010) Bệnh lạ công vụ mùa sớm Bắc Giang Hà Minh Trung (1984) Các bệnh virus hại lúa Việt nam Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp 12 tr 540 - 546 Hà Viết Cường, Lê Văn Hải, Nguyễn Viết Hải Vũ Triệu Mân (2010) Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lùn lúa tỉnh Bắc Giang vụ mùa – 2010 http://www.bacgiang.gov.vn/diem-bao/17817/%3ETong-hop-tin-tuc-tren-bao-chitu-ngay-01/8/2016-%E2%80%93-7/8/2016.html Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Tiếng Anh: Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Current opinion in biotechnology 10(5) pp 411-421 Chen C.C and R.J.Chiu, (1980) Factors affecting transmission of rice transitory yellowing virus by green leafhoppers Plant Protection Bulletin, Taiwan 22(3) pp 297-306 10 Chen C.C., W.H Ko, E.S Wang, S.M Yu, and D.Q Hu, (1980) Epidemiological studies on the rice transitory yellowing with special reference to its transmission by the rice green leafhoppers, (In Chinese) Bulletin of Taichung District Agriculture Improvement Station, New Series (4) pp.61 11 Chen R (2012) Bacterial expression systems for recombinant protein production E.coli and beyond Biotechnology advances 30 pp 1102-1107 12 Chiu R.J., T.C Lo, C.T Pi, and M.H Chen (1965) Transitory yellowing of rice and its transmission by the leafhoppers Nephotettix apicalis (Motsch.) Bot Bull Acad Sin 13 Demain, A L., and P Vaishnav, (2009) Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms Biotechnology advances 27(3) pp 297-306 14 Fang R X., Q Wang, B Y Xu, Z Pang, H T Zhu, K Q Mang, D M Gao, W S 54 Qin, and N H Chua, (1994) Structure of the nucleocapsid protein gene of rice yellow stunt rhabdovirus Virology 204 pp 367-375 15 Gibb A., B Harrison, (1980), Plant virology, The principles Edword Arnold press England pp 153-156; pp 159-167; pp 187-191; pp 208-210 16 Hibino H (1996) Biology and epidemiology of rice viruses Annual Review of Phytopathology 34 pp 249-274 17 Hiraguri A., H Hibino, Hayashi, T.T Shimizu, T.U Ichiki, T Omura, and T Sasaya, (2009) Complete sequence analysis of rice transitory yellowing virus and its comparison to rice yellow stunt virus Archives of Virology 155 pp 243–245 18 Hsieh S.P.Y., (1966) Accumulation of starch in rice leaves infected with transitory yellowing and its application to differentiate transitory yellowing from suffocating disease Plant Protection Bulletin pp 205-210 19 Huang Y., H Zhao, Z Luo, X Chen, and R.X Fang (2003) Novel structure of the genome of Rice yellow stunt virus: identification of the gene 6-encoded virion protein J Gen Virol 84 pp 2259–2264 20 Hull R., (2002) Matthews's Plant Virology Fourth edition Academic Press 21 Le D T., O Netsu, T Uehara-Ichiki, T Shimizu, I R Choi, T Omura, and T Sasaya, (2010) Molecular detection of nine rice viruses by a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay Journal of virological methods 170 pp 90-93 22 Luo Z L and R X Fang (1998) Structure analysis of the rice yellow stunt rhabdovirus glycoprotein gene and its mRNA Archives of virology 143 pp 24532459 23 Makrides S C., (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli Microbiological reviews 60(3) pp 512-538 24 Ou S H., (1985) Rice yellow stunt virus Rice Diseases Second Edition, Commonwealth Mycological Institute Publication Kew, Surrey, UK pp 23-25 and pp 48-49 25 Pugsley A P., (1993) The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria Microbiological reviews 57(1) pp 50-108 26 Shikata E and M J Chen, (1969) Electron microscopy of rice transitory yellowing virus Journal of virology pp 261-264 27 Shikata E., (1972) Rice transitory yellowing virus Description of Plant 28 Takahashi Y., T Omura, T Hayashi, K Shohara, and T Tsuchizaki, (1988) 55 Detection of rice transitory yellowing virus (RTYV) in infected rice plants and insect vectors by simplified ELISA Annals of the Phytopathological Society of Japan 54 pp 217-219 29 Terpe K., (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Applied microbiology and biotechnology 72(2) pp 211-222 30 W P Mowat and S Dawson (1987) Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera 31 Yin S., F Ding, and Dokholyan, N V (2007) Eris: an automated estimator of protein stability Nature methods 4(6) pp 466-467 56 ... văn: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.01.12 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Điều tra tình hình bệnh vàng. .. lụi lúa (Rice yellow stunt virus)? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Đánh giá tình hình bệnh vàng lụi vụ mùa năm 2016 1.2.2 Mục tiêu cụ thể  Điều tra tình hình bệnh vàng lụi. .. virus lúa, có RYSV (Le et al., 2010) 20 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh vàng lụi lúa (bệnh vàng