ea nd Ph NGUYỄN HỮU THẮNG arm ac KHOA Y DƯỢC y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ici n NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR Sc ho ol of M ed HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 Co py rig h t@ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội – 2019 ea nd Ph NGUYỄN HỮU THẮNG arm ac KHOA Y DƯỢC y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ho ol of M ed ici n NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA t@ Sc KHÓA QH.2013.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN 2: PGS.TS LÊ THỊ LUYẾN Co py rig h NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1: PGS.TS PHẠM CẨM PHƯƠNG Hà Nội – 2019 y, VN U LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Cẩm Phương PGS.TS Lê Thị Luyến, người thầy, người hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa khóa luận tốt arm ac nghiệp Ph Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực đề tài hồn thành khóa luận M ed ici n ea nd Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến thầy cơ, đồng nghiệp, người tạo điều kiện, giúp đỡ em q trình thực khóa luận: GS.TS Mai Trọng Khoa, PGS.TS Trần Đình Hà (Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai), TS Nguyễn Thuận Lợi, ThS Nguyễn Tiến Lung, toàn thể bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai giúp đỡ em trình thu thập số liệu phục vụ cho nghiên cứu ho ol of Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè giúp đỡ ủng hộ em trình học tập Co py rig h t@ Sc Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận góp ý để khóa luận hồn thiện Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Nguyễn Hữu Thắng Ký hiệu/từ viết tắt Viết đầy đủ / ý nghĩa y, VN U DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT American Joint Committee on Cancer (Uỷ ban liên hiệp Ung thư Hoa Kỳ) ATP Adenosine triphosphate CEA Carcinoembryonic Antigen ctDNA arm ac AJCC Circulating tumor DNA (DNA khối u máu) Deoxyribonucleic acid EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) EMT Epithelial-mesenchymal transitions (Chuyển dạng biểu môtrung mô) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) kDa KiloDalton OS Overall survival (Thời gian sống thêm toàn bộ) ed Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) M PCR Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp phát xạ positron) Phosphatidylinositol-3-kinase Relative risk (Nguy tương đối) Sc RR Progression-free survival (Thời gian sống bệnh không tiến triển) ho ol PI3K of PET-CT PFS ici n ea nd Ph DNA t@ SCC SPECT Single-photon Emission Computed Tomography (Chụp cắt lớp điện toán xạ đơn photon) Tyrosine kinase inhibitor (Ức chế tyrosine kinase) TNM T: tumor; N: lymph node; M: metastasis rig h TKI UTPKTBN WHO Ung thư phổi không tế bào nhỏ World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Co py Squamos Cell Carcinoma (Ung thư biểu mô vảy) i y, VN U MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN) arm ac 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Yếu tố nguy 1.1.3 Triệu chứng Ph 1.1.4 Chẩn đoán 1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR) nd 1.2.1 Cấu trúc hoạt hoá EGFR ea 1.2.2 Đột biến EGFR 10 ici n 1.2.3 Điều trị UTPKTBN thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân tử nhỏ 12 ed 1.2.4 Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) 13 M 1.2.5 Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết tương UTPKTBN 16 ho ol of 1.2.6 Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương bệnh nhân UTPKTBN 21 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 Sc 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa 24 t@ 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24 rig h 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 24 Co py 2.2.2 Cỡ mẫu 24 2.2.3 Các biến số, số nghiên cứu 24 2.2.4 Thời gian nghiên cứu 24 ii y, VN U 2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 25 2.2.6 Các bước thực 25 2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 arm ac 3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 27 3.1.2 Đặc điểm mô bệnh học giai đoạn bệnh 27 Ph 3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 28 nd 3.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 29 ici n ea 3.3.1 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 29 ed 3.3.2 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học giai đoạn bệnh 30 M 3.3.3 Đột biến T790M số yếu tố liên quan 31 CHƯƠNG – BÀN LUẬN 34 of 4.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 ho ol 4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 34 4.1.2 Đặc điểm mô bệnh học – giai đoạn bệnh 35 Sc 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 35 t@ 4.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 36 Co py rig h 4.3.1 Mối liên quan tình trạng dột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 36 4.3.2 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 38 4.3.3 Đột biến T790M số yếu tố liên quan 38 iii y, VN U KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - - arm ac PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG - PHỤ LỤC PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU .- - Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN - - iv y, VN U DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc hoạt động EGFR Hình 1.2 Các đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 10 Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR định tính đáp ứng với TKIs 11 Hình 1.4 Phân bố số chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase hệ ea nd Ph arm ac I,II 14 Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại phản ứng real-time PCR 18 Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn phản ứng real-time PCR 19 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 25 Hình 3.1 Đặc điểm giai đoạn bệnh đối tượng nghiên cứu 28 Hình 3.2 Tỷ lệ loại đột biến exon 18-21 gen EGFR 29 Hình 3.3 Ví dụ đột biến kháng thuốc thứ phát T790M 32 ici n DANH MỤC BẢNG Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng đối tượng nghiên cứu 27 Bảng 3.2 Đặc điểm mô bệnh học đối tượng nghiên cứu 28 Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương 28 Bảng 3.4 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 30 Bảng 3.5 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học giai đoạn bệnh 30 Bảng 3.6 Mối liên quan đột biến T790M đặc điểm bệnh nhân 31 Bảng 3.7 Mối liên quan đột biến T790M với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 32 v y, VN U ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phế quản phổi nguyên phát ung thư xuất phát từ niêm mạc phế quản, phế nang Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi khơng tế bào nhỏ ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85% Ung thư phế quản phổi ea nd Ph arm ac chẩn đoán sớm thường khó khăn tốn Phần lớn chẩn đoán giai đoạn muộn Chẩn đoán ung thư phế quản phổi cần phối hợp nhiều phương pháp: Lâm sàng, X – quang, chụp cắt lớp vi tính, nội soi, xét nghiệm tế bào, mơ bệnh học Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phổi phẫu thuật, hố trị, xạ trị, điều trị đích; nhiều nghiên cứu chứng minh thuốc ức chế tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor – TKI) giúp trì hoãn bệnh tiến triển cải thiện chất lượng sống tốt so với hoá trị bệnh nhân có đột biến EGFR [3] t@ Sc ho ol of M ed ici n Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) yếu tố ảnh hưởng đến phát triển ung thư, có ung thư phổi Đột biến vùng tyrosine kinase EGFR quan trọng cho việc xác định độ nhạy thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa mẫu mô ung thư xem tiêu chuẩn vàng phát đột biến gen EGFR Tuy nhiên, phương pháp không khả thi số trường hợp không đủ điều kiện cho phép sinh thiết, mẫu sinh thiết nhỏ, không đủ để giải trình tự gen, cần kiểm tra lại mẫu huyết tương tín hiệu đột biến thấp Phương pháp phát đột biến gen EGFR cách sử dụng ctDNA (circulating tumor DNA) có huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (mẫu “sinh thiết lỏng” – Liquid Biopsy) có nhiều ưu điểm vượt trội [23, 30] Điều cho Co py rig h phép bệnh nhân có thêm hội để làm xét nghiệm chẩn đốn, đồng thời làm xét nghiệm lặp lại nhiều lần để theo dõi điều trị mà không cần can thiệp sâu sinh thiết Bên cạnh đó, phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, giảm chi phí, thời gian cho bệnh nhân khơng gây biến chứng [8] Như vậy, việc phân tích đánh giá tình trạng đột biến EGFR mẫu huyết tương cần thiết giúp bác sĩ việc điều trị nhằm kéo dài thời gian sống nâng cao chất lượng sống bệnh nhân Do đó, đề tài nghiên cứu y, VN U “Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018” thực với mục tiêu sau: Mơ tả tình trạng đột biến EGFR phát mẫu huyết tương phân tích số yếu tố liên quan bệnh nhân ung thư phổi không tế bào Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac nhỏ Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018 19 20 21 y, VN U arm ac Ph t@ 24 Sc 23 ho ol of 22 nd 18 ea 17 ici n 16 ed 15 Bean J, Riely GJ, Balak M, et al (2008), "Acquired resistance to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors associated with a novel T854A mutation in a patient with EGFR-mutant lung adenocarcinoma", Clin Cancer Res, 14(22), 7519-25 Carey KD, Garton AJ, Romeo MS, et al (2006), "Kinetic analysis of epidermal growth factor receptor somatic mutant proteins shows increased sensitivity to the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, erlotinib", Cancer Res, 66(16), 8163-71 Carpenter G, King L Jr, and Cohen S (1978), "Epidermal growth factor stimulates phosphorylation in membrane preparations in vitro", Nature, 276(5686), 409-410 Ciardiello F, Tortora G (2008), "EGFR Antagonists in Cancer Treatment", New England Journal of Medicine, 358(11), 1160-1174 Kwapisz D (2017), "The first liquid biopsy test approved Is it a new era of mutation testing for non-small cell lung cancer?", Annals of Translational Medicine, 5(3) Engelman JA, Zejnullahu K,Mitsudomi T (2007), "MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling", Science, 316(5827), 1039-43 Fan W, Tang Z, Yin L, et al (2011), "MET-independent lung cancer cells evading EGFR kinase inhibitors are therapeutically susceptible to BH3 mimetic agents", Cancer Res, 71(13), 4494-505 FDA "List of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices (In Vitro and Imaging Tools)", from https://www.fda.gov/ Mountzios G (2018), "Making progress in epidermal growth factor receptor (EGFR)-mutant non-small cell lung cancer by surpassing resistance: third-generation EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFRTKIs)", Annals of translational medicine, 6(8), 140-140 Guo K, Zhang Z, Han L, et al (2015), "Detection of epidermal growth factor receptor mutation in plasma as a biomarker in Chinese patients with early-stage non-small cell lung cancer", OncoTargets and therapy, 8, 3289-3296 Heist RS, Christiani D (2009), "EGFR-targeted therapies in lung cancer: predictors of response and toxicity", Pharmacogenomics, 10(1), 59-68 Huang Z, Wang Z, Bai H, et al (2012), "The detection of EGFR mutation status in plasma is reproducible and can dynamically predict the efficacy of EGFR-TKI", Thorac Cancer, 3(4), 334-340 Kobayashi S, Boggon TJ, DayAram T, et al (2005), "EGFR Mutation and Resistance of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib", New England Journal of Medicine, 352(8), 786-792 Kumar A, Petri ET, Halmos B, et al (2008), "Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer", M 14 rig h 25 Co py 26 27 30 ea t@ 37 Sc 36 ho ol of 35 ici n 34 ed 33 M 32 nd Ph 31 y, VN U 29 arm ac 28 Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 26(10), 1742-1751 Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al (1977), "Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy", Cancer Res, 37(3), 646-50 Li X, Ren R, Ren S, et al (2014), "Peripheral blood for epidermal growth factor receptor mutation detection in non-small cell lung cancer patients", Translational oncology, 7(3), 341-348 Luo J, Shen L, and Zheng D (2014), "Diagnostic value of circulating free DNA for the detection of EGFR mutation status in NSCLC: a systematic review and meta-analysis", Scientific reports, 4, 6269-6269 Marmor MD, Skaria KB, and Yarden Y (2004), "Signal transduction and oncogenesis by ErbB/HER receptors", International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics, 58(3), 903-913 Nurwidya F, Takahashi F, Murakami A, et al (2014), "Acquired resistance of non-small cell lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors", Respiratory Investigation, 52(2), 82-91 Ohashi K, Maruvka YE, Michor F, et al (2013), "Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor–Resistant Disease", Journal of Clinical Oncology, 31(8), 1070-1080 Oser MG, Niederst MJ, Sequist LV (2015), "Transformation from nonsmall-cell lung cancer to small-cell lung cancer: molecular drivers and cells of origin", The Lancet Oncology, 16(4), e165-e172 Pao W, Miller VA (2005), "Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions", J Clin Oncol, 23(11), 255668 Pao W, Miller VA, Politi KA, et al (2005), "Acquired Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib Is Associated with a Second Mutation in the EGFR Kinase Domain", PLOS Medicine, 2(3), e73 Piperdi B, Perez-Soler R (2012), "Role of erlotinib in the treatment of non-small cell lung cancer: clinical outcomes in wild-type epidermal growth factor receptor patients", Drugs, 72 Suppl 1(0 1), 11-19 Pirker R, Filipits M (2016), "Personalized treatment of advanced nonsmall-cell lung cancer in routine clinical practice", Cancer and Metastasis Reviews, 35(1), 141-150 Pirker R (2015), "What is the best strategy for targeting EGF receptors in non-small-cell lung cancer?", Future Oncol, 11(1), 153-67 Ramalingam SS, Yang JC, Lee CK, et al (2015), "AZD9291, a mutantselective EGFR inhibitor, as first-line treatment for EGFR mutation- Co py rig h 38 39 40 ea t@ 49 Sc 48 ho ol of 47 ici n 46 ed 45 M 44 nd Ph 43 y, VN U 42 arm ac 41 positive advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): Results from a phase expansion cohort", Journal of Clinical Oncology, 33(15_suppl), 8000-8000 Reck M, Hagiwara K, Han B, et al (2016), "ctDNA Determination of EGFR Mutation Status in European and Japanese Patients with Advanced NSCLC: The ASSESS Study", J Thorac Oncol, 11(10), 1682-9 Robertson EG, Baxter G (2011), "Tumour seeding following percutaneous needle biopsy: the real story!", Clin Radiol, 66(11), 100714 Rosell R, Carcereny E, GERvais R, et al (2012), "Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase trial", The Lancet Oncology, 13(3), 239-246 Sakuma Y, Matsukuma S, Yoshihara M, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor gene mutations in atypical adenomatous hyperplasias of the lung", Modern Pathology, 20, 967 Sequist LV, Bell DW, Lynch TJ, et al (2007), "Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in non-smallcell lung cancer", J Clin Oncol, 25(5), 587-95 Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al (2011), "Genotypic and Histological Evolution of Lung Cancers Acquiring Resistance to EGFR Inhibitors", Science Translational Medicine, 3(75), 75-26 Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer", Nature Reviews Cancer, 7, 169 Shigematsu H, Lin L, Takahashi T, et al (2005), "Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers", J Natl Cancer Inst, 97(5), 339-46 Soria JC, Ohe Y, Vansteenkiste J, et al (2018), "Osimertinib in Untreated EGFR-Mutated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer", N Engl J Med, 378(2), 113-125 Suda K, Tomizawa K, Fujii M, et al (2011), "Epithelial to mesenchymal transition in an epidermal growth factor receptor-mutant lung cancer cell line with acquired resistance to erlotinib", J Thorac Oncol, 6(7), 1152-61 Takahama T, Sakai K, Takeda M, et al (2016), "Detection of the T790M mutation of EGFR in plasma of advanced non-small cell lung cancer patients with acquired resistance to tyrosine kinase inhibitors (West Japan oncology group 8014LTR study)", Oncotarget, 7(36), 58492-58499 rig h 50 Co py 51 57 58 y, VN U arm ac ho ol t@ 61 Sc 60 of M 59 Ph 56 nd 55 ea 54 ici n 53 Takezawa K, Pirazzoli V, Arcila ME, et al (2012), "HER2 amplification: a potential mechanism of acquired resistance to EGFR inhibition in EGFR-mutant lung cancers that lack the second-site EGFRT790M mutation", Cancer Discov, 2(10), 33-922 Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al (2009), "Epithelialmesenchymal transitions in development and disease", Cell, 139(5), 90871 Travis WD, Brambilla E, Nicholson AG, et al (2015), "The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification", Journal of Thoracic Oncology, 10(9), 1243-1260 Vossen RH, White SJ (2017), "Quantitative DNA Analysis Using Droplet Digital PCR", Methods Mol Biol, 1492, 167-177 WHO (2018) "GLOBOCAN 2018 Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2018", from http://gco.iarc.fr/today/fact-sheets-populations Wislez M, Kurie JM (2012), The intersection of EGFR and the Ras signaling pathway Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy 89-95 Wu SG, Shih JY (2018), "Management of acquired resistance to EGFR TKI–targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer", Molecular Cancer, 17(1), 38 Yamaguchi F, Fukuchi K, Yamazaki Y, et al (2014), "Acquired resistance L747S mutation in an epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor-naive patient: A report of three cases", Oncol Lett, 7(2), 357-360 Yasuda H, Park E, Yun CH, et al (2013), "Structural, Biochemical, and Clinical Characterization of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Exon 20 Insertion Mutations in Lung Cancer", Science Translational Medicine, 5(216), 177-216 Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al (2013), "Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers", Clin Cancer Res, 19(8), 7-2240 Yun CH, Mengwasser KE, Toms AV, et al (2008), "The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(6), 2070-2075 Zakowski MF, Ladanyi M, and Kris MG (2006), "EGFR mutations in small-cell lung cancers in patients who have never smoked", N Engl J Med, 355(2), 5-213 ed 52 Co py rig h 62 63 66 Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph 67 y, VN U 65 Zhang S, Zhu L, and Chen X (2018), "ctDNA assessment of EGFR mutation status in Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer in real-world setting", Journal of thoracic disease, 10(7), 41694177 Zhang Z, Lee JC, Lin L, et al (2012), "Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer", Nat Genet, 44(8), 852-60 Zhao X, Han RB,Zhao J, et al (2013), "Comparison of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Statuses in Tissue and Plasma in Stage I–IV Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Respiration, 85(2), 119-125 Zhou C, Wu YL, Chen G, et al (2011), "Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutationpositive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase study", The Lancet Oncology, 12(8), 735-742 arm ac 64 y, VN U PHỤ LỤC PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Trong việc kiểm tra đột biến EGFR huyết tương, sử dụng kit cobas® Sample Preparation (Roche) để tách DNA kit cobas® EGFR arm ac mutation Test v2 để khuếch đại DNA phát đột biến + Chuẩn bị ici n ea nd Ph Để xét nghiệm đột biến EGFR mẫu huyết tương, cần chuẩn bị 5ml mẫu máu bệnh nhân thu thập ống EDTA, sau ly tâm 4000xg 10 phút để tách huyết tương khỏi máu, khoảng 2ml huyết tương thu thập phải lưu trữ nhiệt độ -80oC xử lý thêm sử dụng Thử nghiệm bao gồm giai đoạn chính: Tách DNA khuếch đại DNA + Tách DNA of M ed Chuẩn bị ống falcon 15ml có dán nhãn dành cho mẫu huyết tương chứng âm (dùng nước) Vortex mẫu huyết tương sau chuyển 2ml (thể tích nhỏ nhất) huyết tương chứng âm sang ống falcon 15ml có dán nhãn tương ứng ho ol Tiến hành loại bỏ protein cách bổ sung 250 µl Protein Kinase (PK) vào ống để phân giải protein, đồng thời thêm 2ml DNA PBB vào Sc ống nhằm tăng khả bám dính tăng tương tác DNA với cột lọc Trộn ống falcon 3-5 lần cách đảo ngược ủ nhiệt độ phòng 15-30oC 30 phút Co py rig h t@ Trong trình ủ chuẩn bị số lượng cột lọc HPEA FT (HPEA filter tube) có dán nhãn nắp cột cột thu (CT – collection tube) đủ dùng cho mẫu chứng âm Mỗi mẫu cần HPEA FT, CT elution tube (ống 1,5 ml) Sau 30 phút ủ, tiến hành tủa thu DNA Bổ sung 500 µl Isopropanol để kết tủa DNA, trộn ống falcon 3-5 lần cách đảo ngược Sau chuyển tồn dung dịch ống qua HPEA FT ly tâm 4000×g -1- y, VN U phút Ly tâm xong tiến hành lấy HPEA khỏi FT, loại bỏ phần dung dịch bên chảy qua HPEA FT đặt FT vào ống CT Thêm 500 µl WBI (Wash Buffer I) pha ethenol vào FT ly tâm 8000×g phút để rửa tủa, loại bỏ muối, tạp chất Sau tiếp tục đặt FT vào ống CT rửa lần WBII pha ethanol, ly tâm 8000×g phút Lại nd Ph arm ac đặt FT vào CT mới, ly tâm 16000-20000×g/1 phút để làm khơ màng lọc làm bay ethanol ethanol làm hạn chế mồi Taqman phản ứng real-time PCR Tiến hành thu DNA cách đặt FT vào elution tube, sau hồ tan tủa cách cho thêm 100 µl DNA EB (elution buffer) vào FT cho không đụng vào màng FT ủ 15oC đến 30oC/15 phút Ly tâm 8000×g/1 phút Loại bỏ FT, thu dung dịch DNA stock cách hút chậm 80µl từ ống DNA stock sang ống elution tube thứ Hút cẩn thận ea để tránh hút lên pellet Dung dịch ống sẵn sàng cho phản ứng PCR ed ici n Chú ý: hút phải pellet hút DNA stock ngược trở lại ống elution tube Ly tâm 8000×g/1 phút Sau làm lại bước chuyển 80µl sang ống thứ M + Phát khuếch đại DNA Vortex ống hoá chất giây (dùng pipette) ho ol of Chuẩn bị ống PCR, dán nhãn tương ứng với MMX1, MMX2, MMX3, pha loại Master mix cơng thức: tổng thể tích mẫu = Co py rig h t@ Sc (tổng số mẫu +2 mẫu chứng +1) ì 20àl Cụng thc tớnh th tớch ca MgAc cho MMX tính theo cơng thức sau: thể tích MgAc cần thiết = (tổng số mẫu + mu chng + 1) ì 5àl Trn mi th tích MMX1,2,3 với thể tích MgAc để mẫu MMX hoạt động Thêm 25µl MMX, chứng âm dương, mẫu theo bảng sau: -2- C D E F G H 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 PC MMX1 NC MMX1 S1 MMX1 S2 MMX1 S3 MMX1 S4 MMX1 S5 MMX1 S6 MMX1 PC MMX2 NC MMX2 S1 MMX2 S2 MMX2 S3 MMX2 S4 MMX2 S5 MMX2 S6 MMX2 PC MMX3 NC MMX3 S1 MMX3 S2 MMX3 S3 MMX3 S4 MMX3 S5 MMX3 S6 MMX3 S7 MMX1 S8 MMX1 S9 MMX1 S10 MMX1 S11 MMX1 S12 MMX1 S13 MMX1 S14 MMX1 S7 MMX2 S8 MMX2 S9 MMX2 S10 MMX2 S11 MMX2 S12 MMX2 S13 MMX2 S14 MMX2 S7 MMX3 S8 MMX3 S9 MMX3 S10 MMX3 S11 MMX3 S12 MMX3 S13 MMX3 S14 MMX3 S15 MMX1 S16 MMX1 S17 MMX1 S18 MMX1 S19 MMX1 S20 MMX1 S21 MMX1 S22 MMX1 S15 MMX2 S16 MMX2 S17 MMX2 S18 MMX2 S19 MMX2 S20 MMX2 S21 MMX2 S22 MMX2 S15 MMX3 S16 MMX3 S17 MMX3 S18 MMX3 S19 MMX3 S20 MMX3 S21 MMX3 S22 MMX3 S23 MMX1 S24 MMX1 S25 MMX1 S26 MMX1 S27 MMX1 S28 MMX1 S29 MMX1 S30 MMX1 S23 MMX2 S24 MMX2 S25 MMX2 S26 MMX2 S27 MMX2 S28 MMX2 S29 MMX2 S30 MMX2 S23 MMX3 S24 MMX3 S25 MMX3 S26 MMX3 S27 MMX3 S28 MMX3 S29 MMX3 S30 MMX3 y, VN U B 01 arm ac Hàng/ Cột A Ph PC: posive control: chứng dương; NC: negative control: chứng âm, S#: Sample #: mẫu # nd Sau hoàn thành việc thêm mẫu vào đĩa theo hướng dẫn, đĩa ea dán lại ici n Thiết lập máy phân tích cobas z khởi động PCR Việc kiểm tra xác nhận mẫu chạy phần mềm cobas® 4800 of M ed Việc khuếch đại DNA thực cách sử dụng realtime PCR có nhiều ưu điểm so với PCR thông thường Realtime PCR nhạy hơn, xác hơn, tốn thời gian địi hỏi cơng sức so với PCR truyền thống Ngoài ra, realtime PCR hiển thị liệu sau chu kỳ PCR thông thường cho kết kết thúc phản ứng Nhưng tính ho ol quan trọng realtime PCR thực nghiệm đo lường định lượng sản phẩm Tính định giúp xác định số bán Sc định lượng (SQI) đột biến SQI phép đo bán định lượng ctDNA (DNA khối u lưu hành máu) sử dụng để theo dõi diện đột biến EGFR theo thời gian Theo dõi số đột biến Co py rig h t@ EGFR quan trọng để quan sát tiến triển bệnh bệnh nhân xác định hướng điều trị tương lai -3- y, VN U PHỤ LỤC PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU I THÔNG TIN CHUNG Họ tên bệnh nhân: Mã số bệnh nhân: arm ac Tuổi: Giới tính: □ Nam □ Nữ Lý vào viện: Ph □ Triệu chứng hô hấp nd □ Nổi hạch ea □ Triệu chứng quan di □ Triệu chứng toàn thân ici n □ Khám sức khoẻ phát u phổi ed Tiền sử hút thuốc lá: M □ Không □ Đã hút thuốc Số lượng thuốc lá: (bao.năm) of Tiền sử điều trị thuốc đích TKIs ho ol □ Khơng □ Đã điều trị thuốc TKIs Sc Nếu có, ghi rõ loại thuốc: t@ II ĐẶC ĐIỂM KHỐI U PHỔI VÀ DI CĂN Mô bệnh học: rig h □ Ung thư biểu mô tuyến □ Ung thư biểu mô vảy Co py Giai đoạn T: □ Tx □ T1 □ T2 □ T3 □ T4 Giai đoạn N: -4- □ Khác □ N1 □ N2 □ N3 y, VN U □ Nx Di căn: □ Có □ Khơng Kết đột biến gen mẫu mơ: □ Có □ Khơng arm ac Nếu có, ghi rõ vị trí di căn: Nếu có, ghi rõ vị trí đột biến: III XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG □ Khơng nd □ Có Ph Kết đột biến EGFR huyết tương: ea Vị trí đột biến: Co py rig h t@ Sc ho ol of M ed ici n Chỉ số SQI: -5- STT Mã bệnh án Đinh Thị C 65 Nữ 180001820 Nguyễn Sỹ N 57 Nam 180003249 Lê Văn T 57 Nam 170014106 Nguyễn Thị Bích L 170022573 Trần Văn Đ 180000319 Nguyễn Thị T 170050340 Nguyễn Công L 180000772 Vũ Tiến M 170050081 10 Nữ 62 Nam 67 Nữ 39 Nữ 61 Nam Hoàng Quốc H 63 Nam 180008338 Nguyễn Văn T 54 Nam 11 170231665 Lương Đức H 64 Nam 12 170046209 Lê Anh H Nam 13 180010923 ici n 71 Nguyễn Thị Bích H 71 Nữ 14 170046522 Phạm Vũ H Nữ 15 180011830 ed 37 Lô Thị D 46 Nữ 16 180001265 Hoàng Thị T 74 Nữ 17 170040322 Nguyễn Thị U 76 Nữ 18 160041384 Ngô Văn M 63 Nam 160039627 Đỗ Hiển V 70 Nam 160043968 Vũ Hữu L 83 Nam 21 170237483 Nguyễn Văn M 68 Nam 22 180001509 Đồn Quốc T 66 Nam 23 180000558 Lê Đình T 47 Nam 24 170050081 Hoàng Quốc H 63 Nam 25 170004455 Nguyễn Đình Q 58 Nam 26 170023344 Bùi Gia H 54 Nam 27 170021757 Bùi Thị M 72 Nữ 28 170239991 Đỗ Viết T 58 Nam nd ea M of ho ol Sc Ph 58 t@ rig h arm ac 170046645 20 py Tuổi Giới tính 19 Co Họ tên y, VN U PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN -6- 170237480 Nguyễn Thị H 57 Nữ 30 170050165 Nguyễn Thị M 59 Nữ 31 170046755 Nguyễn Đình Q 57 Nam 32 170046693 Lê Đình T 65 Nam 33 170046664 Lê Thị Thu H 52 Nữ 34 180002056 Nguyễn Thị T 71 Nữ 35 180003120 Nguyễn Thị T 63 Nữ 36 180000084 Lê Thị X 59 Nữ 37 180000438 Lâm Thị A 74 Nữ 38 180000556 Nguyễn Vũ P 67 Nam 39 180000504 Nguyễn Thị T 69 Nữ 40 180000110 Lê Thị Kim X 69 Nữ 41 170050026 Trịnh Tiến L 77 Nam 42 180000429 Nguyễn Tiến N 61 Nam 43 170204492 Hà Thị Q 81 Nữ 44 170015096 Lê Thị B Nữ 45 170006551 ed 68 Trương Quốc T 65 Nam 46 180002150 Hoàng Lệ H 42 Nữ 47 180000013 Nguyễn Thị M 71 Nữ 48 180041789 Nguyễn Văn T 61 Nam 180001820 Nguyễn Sỹ N 58 Nam 180000155 Phan Lê Đ 48 Nam arm ac Ph nd ea 51 180001512 Nguyễn Thị D 60 Nữ 52 170027234 Đặng Ngọc B 64 Nam 53 180049858 Nguyễn Trung T 50 Nam 54 180000743 Tống Quang S 69 Nam 55 180011854 Nguyễn Thị L 66 Nữ 56 180000450 Trần Quốc L 48 Nam 57 180004844 Hoàng Ngọc K 73 Nam 58 180011220 Đặng Văn K 56 Nam t@ rig h py Co ici n M of Sc 50 ho ol 49 y, VN U 29 -7- 170050081 Hoàng Quốc H 64 Nam 60 180002926 Phan Xuân T 62 Nam 61 180239963 Nguyễn Thị Đ 60 Nữ 62 180001936 Nguyễn Minh H 60 Nam 63 180008153 Hà Văn N 75 Nam 64 180001241 Phạm Quang C 58 Nam 65 180014987 Đinh Quang M 59 Nam 66 180001011 Khuất Quang L 64 Nam 67 180007378 Ngô Xuân Đ 62 Nam 68 180006551 Nguyễn Trọng Đ 62 Nam 69 180000190 Vũ Ngọc B 47 Nam 70 180003738 Nguyễn Trung V 66 Nam 71 180008333 Bùi Tiến D 59 Nam 72 180011096 Đặng Văn R Nam 73 180204493 ici n 70 Trương Thị T 84 Nữ 74 180010529 Nguyễn Văn T Nam 75 180002439 ed 47 Nguyễn Thị A 62 Nữ 76 180007147 Ngơ Thanh L 60 Nam 77 180008867 Tạ Đình Ch 63 Nam 78 180013556 Phạm Văn S 57 Nam 180001509 Đoàn Quốc T 67 Nam 180012129 Đỗ Thị D 61 Nữ arm ac Ph nd 81 180002900 Phạm Xuân H 69 Nam 82 180013519 Phan Thị M 61 Nữ 83 180046759 Trần Thị Thu T 60 Nữ 84 180017635 Hoàng Xuân H 67 Nam 85 180012200 Lương Tuấn T 56 Nam 86 180005565 Nguyễn Văn M 82 Nam 87 180002056 Nguyễn Thị T 72 Nữ 88 180305827 Trần Thị Thanh H 44 Nữ t@ rig h py Co ea M of Sc 80 ho ol 79 y, VN U 59 -8- 180011830 Lô Thị D 47 Nữ 90 180015201 Đặng Văn P 56 Nam 91 180018222 Trịnh Minh T 53 Nam 92 180010721 Trần Thị H 45 Nữ 93 1803008900 Nguyễn Thị B 81 Nữ 94 180039647 Nguyễn Hồ T 69 Nam 95 180023348 Phùng Thị V 62 Nữ 96 180008608 Nguyễn Thị H 43 Nữ 97 180011688 Dỗ Văn C 55 Nam 98 180012456 Lê Đức H 60 Nam 99 180004844 Hoàng Ngọc K 73 Nam 100 180019674 Nguyễn Thị Bích H 72 Nữ 101 180001512 Nguyễn Quang T 30 Nam 102 180019834 Nguyễn Văn H Nam 103 180004399 ici n 58 Cù Xuân B 62 Nam 104 180010850 Lê Thị C Nữ 105 180043948 ed 69 Lê Thị B 68 Nữ 106 180000556 Nguyễn Vũ P 67 Nam 107 180040862 Ngô Thị V 56 Nữ 108 180019550 Phan Thị Bạch M 67 Nữ 109 180002825 Nguyễn Văn C 64 Nam 110 180000637 Nguyễn Thị N 40 Nữ arm ac Ph nd ea M of Sc ho ol 111 180011236 Nguyễn Văn Q 64 Nam 112 180001619 Trương Như T 62 Nam 113 180021335 Phùng Hồng Q 66 Nữ 114 180020865 Trần Thị H 88 Nữ 115 180018800 Nguyễn Thị D 59 Nữ 116 180003217 Nguyễn Thị Thanh T 55 Nữ 117 180016397 Vũ Ngọc N 68 Nam 118 180046822 Nguyễn Quang T 30 Nam t@ rig h py Co y, VN U 89 -9- 180046310 Lương Văn L 70 Nam 120 180231865 Nguyễn Thị V 46 Nữ 121 180050452 Nguyễn Thị D 61 Nữ 122 180046649 Nguyễn Hứu V 62 Nam 123 180014106 Nguyễn Thị T 71 Nữ 124 180031464 Nguyễn Thị M 71 Nữ 125 180002872 Hà Thị Q 80 Nữ 126 180002991 Đào Thị H 62 Nữ 127 180000192 Lê Xuân Đ 69 Nam 128 180200482 Nguyễn Thị H 70 Nữ 129 180006680 Phan Lê Đ 48 Nam 130 180000013 Trương Thị N 70 Nữ 131 180014987 Phạm Ngọc T 55 Nam 132 180027360 Nguyễn Thị L Nữ 133 180010721 ici n 66 Nguyễn Thị S 75 Nữ 134 180002970 Đỗ Thị T Nữ 135 180010923 ed 51 Nguyễn Văn V 60 Nam 136 180008333 Đoàn Quốc T 67 Nam arm ac Ph nd ea M of ho ol Sc t@ rig h py Co - 10 - y, VN U 119 ... Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư phổi khơng tế bào nhỏ chiếm 85% Ung thư phế quản phổi ea... gian sống nâng cao chất lượng sống bệnh nhân Do đó, đề tài nghiên cứu y, VN U ? ?Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018”... TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Sc Kết phân tích đột biến gen EGFR huyết tương 136 bệnh nhân trình bày theo Bảng 3.3: Co py rig h t@ Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương Đặc điểm