BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN THỊ MAI HƯƠNG XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY NHIỄM VI SINH GÂY BỆNH VÀ ĐỘC HẠI TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT TƯƠNG TRUYỀN THỐNG ĐỂ NÂNG CAO VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA SẢN PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hà Nội - 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *********♦********* TRẦN THỊ MAI HƯƠNG XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY NHIỄM VI SINH GÂY BỆNH VÀ ĐỘC HẠI TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT TƯƠNG TRUYỀN THỐNG ĐỂ NÂNG CAO VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM CỦA SẢN PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS T.S LÊ THANH MAI HÀ NỘI 2008 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập trường Đại Học Bách Khoa – Hà Nội, nhận dạy dỗ bảo ân cần thầy giáo trường Điều giúp trưởng thành không học tập mà cịn q trình cơng tác Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô giáo dậy bảo suốt thời gian qua Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thầy giáo Bộ Môn Công Nghệ Các Sản Phẩm Lên Men – Viện CN Sinh Học-CN Thực Phẩm Quá trình nghiên cứu luận văn, tơi thực phịng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Đồ Uống – Viện Cơng Nghiệp Thực Phẩm Trong q trình làm đồ án nhận bảo, hướng dẫn, giúp đỡ từ thầy cô giáo cán phịng thí nghiệm Nhân dịp cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS T.S Lê Thanh Mai – Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, T.S Đặng Hồng Ánh cán Bộ Môn Công Nghệ Đồ Uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, người trực tiếp bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình tơi thực luận văn Tơi muốn nói lời cảm ơn đến gia đình tất người bạn – người bên cạnh, động viên chia sẻ khó khăn tơi gặp phải quỏ trỡnh lm nghiờn cu Trường ĐHBK - Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm mốc (Koji) để ứng dụng sản xuất nước tương Kết thu cho thấy: chủng nấm mốc Aspergillus oryzae No1, chủng có khả thuỷ phân casein tinh bột cao số chủng nấm mốc nghiên cứu chủng sử dụng để làm chế phẩm mốc Hai loại công thức phối trộn nguyên liệu chọn lựa phù hợp với q trình ni mốc Koji là: đậu tương hấp lúa mì rang tỉ lệ 1:1; đậu tương hấp đậu tương rang tỉ lệ 1:1 Điều kiện thích hợp cho q trình ni tạo mốc Koji có hoạt lực enzim proteaza α-amylaza cao : độ ẩm ban đầu khối ủ 42-45%, có bổ sung ẩm bão hịa suốt q trình ni, nhiệt độ 33-35oC 24 đầu thích hợp cho nấm mốc phát triển hệ sợi 25-280C 48 sau thích hợp cho tạo thành enzim proteaza, tỷ lệ bào tử mốc giống 0,35 g/kg nguyên liệu khô (số lượng bào tử 2.109/g giống mốc) độ dày khối ủ cm, đảo trộn định kỳ giờ/lần SUMMARY This work has investigated the technology for production of Koji, which can be used in fermened soy sauce production Obtained data showed that strain Aspergillus oryzae No1 has the highest activity of protease and amylase This strain could be suitabe for Koji production Two ways of combinating raw material were selected for Koji preparation: steamed soybean mixed with roasted wheat (ratio of 1:1) and steamed soybean mixed with roasted soybean (ratio of 1:1) The good condition for preparing Koji with high amylase and protease activities were: initial humidity of 42 – 45%, addition of saturated vapour during the growth of fungi, temperature of 33 – 350C in the first 24 hour and 25 – 280C in the next 48 hour The ratio between spore and raw material was 0,35 g/kg The thiness of mixture was cm and the mixture was turned over every hours Trường ĐHBK - Hà Nội Lun tt nghiệp Trần Thị Mai Hương MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU…………………………………………………… PHẦN 1: TỔNG QUAN……………………………………………… 10 1.1 Tình hình sản xuất tương giới Việt Nam……………… 10 1.1.1 Lịch sử hình thành trình phát triển sản phẩm tương…………………………………………………………… 12 1.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ tương sản phẩm tương tự số nước giới…………………………………………… 12 1.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ tương Việt Nam………… 13 1.2 Công nghệ sản xuất tương………………………………………… 1.2.1 Các nguyên liệu sử dụng trình sản xuất tương………… 14 14 1.2.1.1 Nguyên liệu giàu protein………………………………… 15 1.2.1.2 Nguyên liệu giàu tinh bột………………………………… 15 1.2.1.3 Muối ……………………………………………………… 17 1.2.1.4 Nước ……………………………………………………… 17 1.2.1.5 Nấm mốc…………………………………………………… 18 1.2.2 Các phương pháp sản xuất tương ……………………………… 19 1.2.2.1 Phương pháp lên men…………………………………… 19 1.1.2.2 Phương pháp hoá học (thủy phân axit)……………… 19 1.1.2.3 Ưu nhược điểm hai phương pháp……………………… 20 1.3 Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm mốc (Koji)……………………… 21 1.3.1 Định nghĩa phân loại 21 1.3.2 Hệ emzim tạo thành q trình ni mốc (Koji) 21 1.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo chế phẩm nấm mốc (Koji) 22 1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzim ca nm mc 24 Trường ĐHBK - Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 1.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ……………………………………… 24 1.4.2 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường……………………………… 24 1.4.3 Ảnh hưởng thành phần môi trường………………………… 24 1.4.4 Ảnh hưởng thời gian ni cấy……………………………… 25 1.4.5 Ảnh hưởng độ thống khí 25 1.4.6 Ảnh hưởng pH……………………………………………… 25 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 26 2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 26 2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………… 26 2.1.1.1 Đậu tương………………………………………………… 26 2.1.1.2 Lúa mỳ…………………………………………………… 26 2.1.1.3 Khô đậu tương…………………………………………… 26 2.1.1.4 Chủng giống vi sinh vật………………………………… 26 2.1.1.5 Hoá chất…………………………………………………… 27 2.1.2 Các dụng cụ thiết bị sử dụng…………………………………… 27 2.1.3 Các loại môi trường……………………………………………… 27 2.2 Các phương pháp nghiên cứu………………………………………… 28 2.2.1 Phương pháp vi sinh……………………………………………… 28 2.2.1.1 Phương pháp thu nhận dịch enzim thô…………………… 28 2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch………………………………… 28 2.2.2 Phương pháp hoá sinh…………………………………………… 29 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzim α-amylaza………… 29 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzim proteaza…………… 31 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………… 34 3.1 Xác định thành phần nguyên liệu sử dụng sản xuất chế phẩm nấm mốc (Koji)…………………………………………… 34 3.2 Nghiên cứu lựa chọn chủng giống mốc có hoạt lực cao dùng cho cơng nghệ sản xuất nước chấm lên men từ đậu tương………………… Trường ĐHBK - Hà Nội 35 Lun tt nghiệp Trần Thị Mai Hương 3.3 Ảnh hưởng điều kiện xử lý nguyên liệu đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc…………………………………… 37 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian ngâm đậu tương đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc……………………………… 37 3.3.2 Ảnh hưởng chế độ hấp đậu tương đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc………………………………… 38 3.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ phối chế nguyên liệu đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc……………………………… 39 3.4 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp để tạo chế phẩm mốc có hoạt lực enzim cao……………………… 40 3.4.1 Ảnh hưởng tỷ lệ mốc giống đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc……………………………………… 40 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc……………………………………… 41 3.4.3 Ảnh hưởng việc bổ sung trì ẩm đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc…………………………… 43 3.4.4 Ảnh hưởng độ dày khối ủ đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc……………………………………………… 44 3.4.5 Ảnh hưởng mức độ đảo trộn đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc……………………………………… 45 3.5 Sản xuất chế phẩm Koji quy mô thực nghiệm……………………… 46 KẾT LUẬN…………………………………………………………… 49 TI LIU THAM KHO 50 Trường ĐHBK - Hà Néi Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng số Tên bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu tương Bảng Thành phần axit amin đậu tương Bảng 1.3 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Thành phần hydratcacbon đậu tương Một số chủng nấm mốc sử dụng q trình tuyển chọn Thành phần ngun liệu dùng sản xuất mốc (Koji) Khả thủy phân tinh bột casein chủng nấm mốc Tr­êng §HBK - Hµ Néi 16 24 25 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Quy trình ni cấy tạo chế phẩm mốc (Koji) 13 Hình 2.1 Đường chuẩn tyrozin 23 Hình 3.1 Hình ảnh độ rộng vòng thuỷ phân casein 26 chủng nấm mốc Aspergillus oryzae No1 Hình 3.2 Hình ảnh độ rộng vòng thuỷ phân tinh bột 26 chủng nấm mốc Aspergillus oryzae No1 Hình 3.3 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji 27 ngâm đậu tương khoảng thời gian khác Hình 3.4 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza 28 mốc Koji hấp đậu tương chế độ khác Hình 3.5 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 29 Koji sử dụng loại công thức nguyên liệu khác Hình 3.6 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 31 Koji với tỷ lệ giống ban đầu khác Hình 3.7: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 32 Koji nuôi khoảng nhiệt độ khác 10 Hình 3.8 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 34 Koji ni điều kiện ẩm khác 11 Hình 3.9 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 35 Koji ni độ dày khác 12 Hình 3.10 Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc 36 Koji mức độ đảo trộn khác 13 Hình 3.11 Động học tạo q trình ni mốc Koji quy mô 35 kg/mẻ 37 với công thức nguyên liệu đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1 14 Hình 3.12 Động học q trình ni mốc Koji quy mô 35 kg/ mẻ 37 với công thức nguyên liệu đậu tương hấp đậu tương rang tỷ lệ 1:1 15 Hình 3.13 Qui trình ni cấy chế phẩm nm mc Trường ĐHBK - Hà Nội 38 Lun văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương LỜI MỞ ĐẦU Trong số thực phẩm lên men truyền thống, tương sản xuất từ đậu nành lên men nấm mốc đặc sản tiếng, đặc biệt miền Bắc Việt Nam Các sản phẩm tương nối tiếng tương Bần (Hưng Yên), tương Cự Đà (Hà Tây), tương Nam Đàn (Nghệ An) Điển sản phẩm tương Bần tiếng sản phẩm tiêu thụ mạnh, người tiêu dùng khắp nơi Hà Nội, Hải Phòng qua làng sản xuất tương đặt mua Đáng kể, sản phẩm tương « Minh Quất » xuất sang nhiều nước giới : Pháp, Mỹ , Nga, Đức,…Đơn đặt hàng nhiều lúc lên tới 7.000 - 8.000 lít/lần, nhiều khi, gia đình phải từ chối khơng có đủ hàng cung cấp Ngay người Nhật vốn có truyền thống làm sử dụng tương mua tương Việt Nam Họ cho biết, ăn tương có tác dụng chống bệnh ung thư, tương Bần Việt Nam ngon, có vị đậm đà, độc đáo Cơng nghệ sản xuất sản phẩm tương đa dạng có khác biệt riêng tùy theo vùng sản xuất Tương "dân dã" song lại kén chọn nguyên liệu, cần chọn ngun liệu khơng kỹ, có lẫn hạt lép, hạt sâu, hay loại hạt khác không chủng loại khiến mầu sắc hương vị tương không ngon, không đẹp Hay đơn giản, chum sành dùng để trữ tương không nung "già" làm tương chua, chất lượng Ngoài kinh nghiệm hộ gia đình có bí riêng nhà mà khơng truyền cho người ngồi Nói chung, để làm tương, phải chọn loại đậu nành vàng, hạt, rang chín, nghiền nhỏ, nấu nước mưa đổ vào chum để khoảng hai mươi đến ba mươi ngày Để làm giống mốc cần chọn loại gạo nếp thơm, mẩy hạt, đem nấu thành xôi, để vài ngày cho lên mốc sau đem ủ với nhãn thời gian khoảng nửa tháng Khi nước đậu dậy mùi thơm ngậy, xôi mốc ủ trộn vào đem xay lại lần cho thật nhuyễn Tương Bần hay tương vùng quê khác ăn nhìn thấy mảnh đậu hay hạt xơi, cịn tương Cự Đà lại nhuyễn loại nước cốt Muối trắng không trực tiếp rắc lên xôi hay nước đậu mà đun với nước mưa, để nguội, lọc bỏ cặn nêm vào tương Tương làm xong trữ chum, tương để lâu, hay phơi "được nắng" "ngấu", ăn ngon Tương "ngấu" trở thành thứ nước chấm thơm ngon, hay đem kho cá, rim thịt tùy thuộc vào ăn sở thích người Tương nước chấm đậm chất thôn quê người nước kiều bào yêu thích Tuy nhiên, việc sản xuất sản phẩm tương thô sơ chủ yếu theo kinh nghiệm hộ gia đình làng nghề, nguy c mt v sinh an ton Trường ĐHBK - Hà Néi Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 3.3 Ảnh hưởng điều kiện xử lý nguyên liệu đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc Quá trình xử lý ngun liệu đậu tương gồm hai cơng đoạn ngâm đậu tương trước hấp để làm trương nở hạt đậu tương trình hấp chín để nấm mốc dễ dàng phát triển tạo hệ sợi sinh enzim 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian ngâm đậu tương đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc Các mẫu đậu tương ngâm khoảng thời gian khác nhau: (mẫu M1), (mẫu M2), 12 (mẫu M3), 16 (mẫu M4), 20 (mẫu M5) Sau ngâm, đậu tương đãi bỏ vỏ, hấp chín, xay nhỏ, làm nguội rắc nấm mốc tiến hành nuôi tạo mốc Koji Kết hoạt độ enzim chế phẩm nấm mốc thu được thể hình 3.3 1200 200 1000 Proteaza (UI/g koji) 160 140 800 120 600 100 80 400 60 40 Alpha-amylaza (UI/g koji) 180 200 20 0 24 41 48 65 72 thời gian (giờ) M1P M1A M2P M2A M3P M3A M4P M4A M5P M5A Hình 3.3: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji ngâm đậu tương khoảng thời gian khác Kết cho thấy đậu tương ngâm thời gian 16 đến 20 cho hoạt độ enzim cao Ngâm đậu dài hoạt độ enzim không tăng thêm ngâm thời gian ngắn hoạt độ enzim tạo thành thấp Điều ngâm đậu khoảng thời gian 16 giờ, hạt đậu chưa trương nở hồn tồn nên chưa đủ chín sau hấp Do nấm mốc khơng Tr­êng §HBK - Hµ Néi 36 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương thể phát triển hệ sợi tạo enzim mức độ tối đa Trái lại, ngâm đậu với thời gian lâu (quá 20 giờ) độ ẩm khối đậu sau hấp cao dẫn tới ức chế phát triển nấm mốc làm hoạt độ enzim khối mốc Koji bị giảm nhiều Do chọn thời gian ngâm đậu tương từ 16 đến 20 giờ, đủ cho hạt đậu tương trương nở để hấp đảm bảo chín hạt, đồng thời mang lại cho đậu tưong độ ẩm phù hợp với yêu cầu độ ẩm nguyên liệu ban đầu q trình ni chế phẩm mốc Koji 3.3.2 Ảnh hưởng chế độ hấp đậu tương đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc Độ ẩm ban đầu ngun liệu đóng vai trị quan trọng đến phát triển hệ sợi nấm mốc tạo thành enzim proteaza α-amylaza Ngoài thời gian ngâm đậu tương trước hấp, chế độ hấp (nhiệt độ, thời gian) yếu tố ảnh hưởng đến độ ẩm ban đầu nguyên liệu Theo nghiên cứu trước Nhật, độ ẩm nguyên liệu ban đầu thích hợp cho nấm mốc phát triển 4245% Sau lựa chọn thời gian ngâm đậu tương thích hợp 16-20 giờ, chúng tơi tiến hành hấp đậu tương chế độ khác nhau: 1000C 90 phút (M1), 1210C 30 phút (M2), 1150C 60 phút (M3) Trong q trình ni mốc, hoạt độ enzim proteaza α- amylaza xác định theo thời gian nuôi Kết thu được thể hình 3.4 160 1200 1000 120 800 100 80 600 60 400 40 200 20 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koj) 140 24 41 M1P M2P 48 Thời gian (giờ) M3P 65 M1A 72 M2A M3A Hình 3.4: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji hấp đậu tương chế độ khác Tr­êng §HBK - Hµ Néi 37 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương Như với thời gian ngâm đậu 16-20 kết cho thấy chế độ hấp đậu tương 1150C 60 phút tốt nhất, Koji thu cho hàm lượng enzim proteaza α-amylaza cao Do chọn chế độ hấp đậu tương 1150C 60 phút 3.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ phối chế nguyên liệu đến hoạt tính enzim chế phẩm nấm mốc Để khẳng định loại nguyên liệu phù hợp với công nghệ sản xuất chế phẩm nấm mốc cho hoạt lực enzim cao, tiến hành khảo sát công thức nguyên liệu là: đậu tương hấp lúa mỳ rang theo tỷ lệ 1:1 (M1), đậu tương hấp đậu tương rang tỷ lệ 1:1 (M2), khô đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1 (M3) hồn tồn dùng khơ đậu tương hấp (M4) 200 1200 1000 160 140 800 120 100 600 80 400 60 40 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) 180 200 20 0 41 24 M1P M1A 48 Thời gian (giờ) M2P M2A 65 M3P M3A 72 M4P M4A Hình 3.5: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji sử dụng loại công thức nguyên liệu khác Việc xử lý nguyên liệu thực nghiên cứu phần 3.3.1 3.3.2 Các nguyên liệu sau phối trộn theo tỷ lệ, đưa vào khay gỗ để nuôi tủ nuôi 35°C, độ ẩm ban đầu 42% Hoạt độ enzim proteaza α- amylaza khối mốc xác định theo thời gian nuôi Kết thu được th hin hỡnh 3.5 Trường ĐHBK - Hà Nội 38 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương Kết cho thấy mẫu Koji nuôi cấy cơng thức ngun liệu có thành phần khơ đậu tương cho hoạt độ enzim thấp Hai mẫu Koji nuôi cấy công thức nguyên liệu đậu tương hấp lúa mỳ rang tỉ lệ 1:1, đậu tương hấp đậu tương rang tỉ lệ 1:1 có hoạt độ enzim cao mẫu Koji từ đậu tương hấp lúa mỳ rang tốt Điều lí giải chất lượng khơ đậu không tốt (do ngành công nghệ sản xuất dầu ăn trích ly chất béo sử dụng hoá chất gây ảnh hưởng đến chất lượng khơ đậu) Do cơng thức ngun liệu để ni cấy chế phẩm nấm mốc Koji cho chất lượng tốt công thức đậu tương hấp lúa mỳ rang tỉ lệ 1:1, đậu tương hấp đậu tương rang tỉ lệ 1:1 3.4 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp để tạo chế phẩm mốc có hoạt lực enzim cao Từ kết nghiên cứu cho thấy hai công thức nguyên liệu phù hợp cho q trình ni mốc Koji cơng thức đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1, đậu tương hấp đậu tương rang tỷ lệ 1:1 Tuy nhiên qua kết khảo sát công thức nguyên liệu thấy hoạt lực enzim tạo thành hai công thức nguyên liệu khác biệt không nhiều Công thức đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1 cho hàm lượng enzim tạo thành cao chút công thức tạo cho sản phẩm nước tương mùi thơm đặc trưng nhờ hương thơm từ ngun liệu lúa mì rang Cơng thức ưa thích Nhật Bản Do chọn công thức nguyên liệu đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1 cho nghiên cứu để tìm điều kiện ni chế phẩm mốc Koji thích hợp Mục đích thu chế phẩm mốc Koji có hoạt lực enzim thuỷ phân proteaza αamylaza cao, đặc biệt enzim proteaza 3.4.1 Ảnh hưởng tỷ lệ mốc giống đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc Đậu tương ngâm thời gian từ 16-20 hấp chế độ 1150C 60 phút sau xay trộn với lúa mì rang 1800C 20 phút, xay nhỏ Điều chỉnh độ ẩm khối nguyên liệu 42-45% sau rắc mốc giống vào khối nguyên liệu Ở thí nghiệm chúng tơi tiến hành khảo sát tỷ lệ mốc giống/nguyên liệu sau: 0,25 g chế phẩm mốc/kg nguyên liệu (M1); 0,3 g chế phẩm mốc/kg nguyên liệu (M2) 0,35 g chế phẩm mốc/kg nguyờn liu (M3) v Trường ĐHBK - Hà Nội 39 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 0,4 g chế phẩm mốc/kg nguyên liệu (M4) Kết ảnh hưởng tỷ lệ mốc giống đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc thể hình 3.6 1400 250 1000 150 800 600 100 400 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) 1200 200 50 200 0 24 41 M1P M1A 48 Thời gian (giờ) M2P M2A 65 M3P M3A 72 M4P M4A Hình 3.6: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji với tỷ lệ giống ban đầu khác Xác định hoạt độ enzim proteaza α- amylaza theo thời gian nuôi Kết cho thấy với tỷ lệ mốc giống/nguyên liệu cao enzim tạo giai đoạn sớm q trình ni, đặc biệt α-amylaza Tuy nhiên việc tạo thành enzim giai đoạn sớm khơng có nghĩa tỷ lệ mốc giống/nguyên liệu cao mốc Koji thu cuối q trình ni có hoạt lực enzim cao Với lượng chế phẩm mốc thấp (0,25; 0,3 g/kg đậu tương) hệ sợi phát triển lượng enzim tạo thành sau 72 nuôi Khi tăng tỷ lệ bào tử mốc giống từ 0,35 g chế phẩm mốc/kg nguyên liệu lên 0,4 g chế phẩm mốc/kg nguyên liệu lượng enzim tạo thành nhiều không đáng kể Do vậy, chọn tỷ lệ bào tử mốc giống/nguyên 0,35 g/kg ngun liệu cho q trình ni cấy chế phẩm mốc Koji 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc Quá trình ni mốc Koji chia làm hai giai đoạn chính: giai đoạn đầu giai đoạn nấm mốc phát triển tạo hệ sợi giai đoạn sau giai đoạn to enzim thu phõn Trường ĐHBK - Hà Nội 40 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương Do ảnh hưởng nhiệt độ nuôi giai đoạn đến phát triển nấm mốc hoạt độ enzim tạo thành cần nghiên cứu để thấy rõ vai trò việc khống chế nhiệt độ trình ni chế phẩm mốc Koji Các mẫu thí nghiệm tiến hành nuôi điều kiện nhiệt độ khác sau: nuôi 33-35 0C 24 đầu, 25-28 0C 48 sau (M1), nuôi 33-35 0C 36 đầu, 25-28 0C 36 sau (M2) nuôi 33-35 0C 72 (M3) Kết xác định hoạt độ enzim theo thời gian ni cấy thể hình 3.7 200 1400 180 1200 1000 140 120 800 100 600 80 60 400 40 200 20 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) 160 24 41 M1P M2P 48 Thời gian (giờ) M3P 65 M1A 72 M2A M3A Hình 3.7: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji nuôi khoảng nhiệt độ khác Kết thu cho thấy nhiệt độ ni có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ enzim proteaza α-amylaza Khi nuôi mốc Koji nhiệt độ 33-350C suốt 72 hoạt độ hai enzim tạo thành thấp đặc biệt enzim proteaza, sau mẫu M2 nuôi 33-350C 36 đầu 25-28 0C 36 sau cho lượng enzim cao so với mẫu M3 Với chế độ nuôi 33-35 0C 24 đầu, 25-28 0C 48 tiếp sau hoạt độ hai enzim tạo thành cao Điều cho thấy khoảng 24 đầu nhiệt độ 33-350C thích hợp cho nấm mốc phát triển tạo hệ sợi 25-28 0C thích hợp cho việc tạo enzim, đặc biệt enzim proteaza Do chế độ nuụi nhit l Trường ĐHBK - Hà Nội 41 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 33-35oC 24 đầu, 25-28 0C 48 sau lựa chọn chế độ áp dụng để thực nghiên cứu 3.4.3 Ảnh hưởng việc bổ sung trì ẩm đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc Trong q trình ni mốc Koji độ ẩm đóng vai trị quan trọng, ảnh hưởng đến hoạt độ enzim tạo thành Vì việc tiến hành nghiên cứu điều kiện ẩm khác để tìm chế độ ẩm thích hợp cho q trình ni tạo chế phẩm mốc Koji cần thiết Thí nghiệm tiến hành với mẫu sau: - Mẫu M1: bổ sung ẩm gián tiếp ẩm bão hoà (dùng máy phun ẩm) q trình ni - Mẫu M2: khơng bổ sung ẩm suốt q trình ni - Mẫu M3: bổ sung ẩm trực tiếp vào nguyên liệu, giữ độ ẩm đạt 30% q trình ni - Mẫu M4: bổ sung ẩm trực tiếp vào nguyên liệu, ln giữ độ ẩm đạt 35% q trình ni - Mẫu M5: bổ sung ẩm trực tiếp vào nguyên liệu, ln giữ độ ẩm đạt 40% q trình ni Trong q trình phát triển khối mốc, hoạt độ enzim proteaza αamylaza xác định Ảnh hưởng việc bổ sung trì ẩm đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc thể hình 3.8 Kết thu cho thấy bổ sung ẩm gián tiếp ẩm bão hoà (dùng máy phun ẩm) q trình ni hoạt độ enzim tạo thành cao nhiều so với mẫu không bổ sung ẩm mẫu bổ sung ẩm trực tiếp vào nguyên liệu với độ ẩm khác Đặc biệt bổ sung ẩm trực tiếp vào ngun liệu lượng enzim tạo thành Điều chứng tỏ đưa thêm lượng nước trực tiếp vào khối nguyên liệu làm ức chế phát triển nấm mốc, kìm hãm tạo thành enzim Do chúng tơi chọn chế độ bổ sung ẩm gián tiếp ẩm bão hịa suốt q trình nuụi Trường ĐHBK - Hà Nội 42 Trn Th Mai Hương 350 3500 300 3000 250 2500 200 2000 150 1500 100 1000 50 500 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) Luận văn tốt nghiệp 24 M1P M1A 41 48 Thời gian (giờ) M2P M2A M3P M3A 65 72 M4P M4A M5P M5A Hình 3.8: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji nuôi điều kiện ẩm khác 3.4.4 Ảnh hưởng độ dày khối ủ đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc Khi ni mốc Koji độ dày khối ủ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ enzim tạo thành Khi nuôi với độ dày lớn khối ủ nhiệt độ tăng cao, kết hợp với độ ẩm cao dễ gây tượng tự phân hủy đạm nguyên liệu, dễ nhiễm tạp, làm hỏng khối ủ Ngược lại ni với độ dày q mỏng ngun liệu tiếp xúc nhiều với khơng khí, dễ tạo thành bào tử Do làm giảm hiệu suất nuôi Koji, enzim proteaza α-amylaza tạo thành Các thí nghiệm tiến hành với mẫu có độ dày khối ủ khác nhằm tìm độ dày thích hợp cho hoạt độ enzim cao nhất: có độ dày khối ủ cm, cm, cm cm (M1, M2, M3, M4) Kết nghiên cứu ảnh hưởng độ dày khối ủ đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc thể hình 3.9 Kết thu cho thấy với mẫu có độ dày khối ủ cm cho hoạt độ enzim proteaza α-amylaza cao Vì chúng tơi chọn độ dày khối ủ cm thích hợp nuụi to ch phm Koji Trường ĐHBK - Hà Néi 43 Trần Thị Mai Hương 350 3500 300 3000 250 2500 200 2000 150 1500 100 1000 50 500 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) Luận văn tốt nghiệp 24 41 48 65 72 Thời gian (giờ) M1P M1A M2P M2A M3P M3A M4P M4A Hình 3.9: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji nuôi độ dày khác 3.4.5 Ảnh hưởng mức độ đảo trộn đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc Trong q trình ni mốc Koji việc định kỳ đảo trộn khối ủ để cung cấp khơng khí cho toàn thể khối ủ cần thiết Chúng tơi làm thí nghiệm với mục đích khảo sát xem định kỳ đảo trộn khối ủ lần thích hợp Các thí nghiệm tiến hành với mẫu có mức độ đảo trộn khác sau: không đảo trộn (M1), đảo giờ/lần (M2), đảo giờ/lần (M3), đảo 12 giờ/lần (M4) Kết nghiên cứu ảnh hưởng mức độ đảo trộn đến hoạt lực enzim chế phẩm mốc thể hình 3.9 Kết thu cho thấy việc tiến hành đảo trộn định kỳ giờ/lần thu chế phẩm mốc Koji có hoạt độ enzim cao hẳn Với mẫu không đảo trộn hay đảo trộn (4 giờ/lần) nấm mốc khơng cung cấp đủ khơng khí, ảnh hưởng đến phát triển tạo hệ sợi ban đầu, nấm mốc phát triển cục chủ yếu phía bề mặt khối ủ Cịn với mẫu đảo trộn nhiều giờ/lần lượng enzim tạo thành không cao, điều đảo trộn nhiều hệ sợi nấm mốc bị gãy ảnh hưởng đến việc hình thành enzim Hơn việc thơng thống q tạo điều kiện cho khối ủ tiếp xúc nhiều với khơng khí nên dễ hình thành bào tử, ảnh hưởng trực tip ti vic to thnh enzim Trường ĐHBK - Hà Néi 44 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 400 4000 350 3500 300 3000 250 2500 200 2000 150 1500 100 1000 50 500 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) proteaza α-amylaza Do lựa chọn chế độ đảo trộn định kỳ giờ/lần cho q trình ni mốc Koji thích hợp 24 41 M1P M1A 48 Thời gian (giờ) M2P M2A 65 72 M3P M3A M4P M4A Hình 3.10: Hoạt độ enzim proteaza α-amylaza mốc Koji mức độ đảo trộn khác 3.5 Sản xuất chế phẩm mốc Koji quy mô thực nghiệm Sau có thơng số thích hợp cho q trình ni mốc Koji cho hoạt độ enzim cao, tiến hành thực nghiệm sản xuất theo dõi động học q trình ni mốc Koji quy mơ 35 kg ngun liệu/ mẻ Q trình ni mốc Koji quy mơ 35 kg/mẻ thực phịng ni, có hệ thống điều khiển nhiệt độ, phun ẩm bão hòa Chúng thực mẻ thực nghiệm với thành phần nguyên liệu sau: - Mẻ 1: 17,5 kg đậu tương hấp 17,5 kg lúa mỳ rang - Mẻ 2: 17,5 kg đậu tương hấp 17,5 kg đậu tương rang Các điều kiện nuôi mốc Koji thực theo kết lựa chọn nghiên cứu trên: tỷ lệ mốc giống 0,35 g bào tử/ kg nguyên liệu (nồng độ chế phẩm bào tử giống 2x109 bào tử/g giống gốc); nhiệt độ nuôi 33-350C 24 25-280C 48 giờ; độ ẩm khối nguyên liệu thời điểm ban đầu 42% phịng ni phun ẩm bão hịa ton b quỏ trỡnh nuụi; Trường ĐHBK - Hà Néi 45 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 400 4000 350 3500 300 3000 250 2500 200 2000 150 1500 100 1000 50 500 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) dày khối ủ cm chế độ đảo trộn định kỳ giờ/ lần Kết động học tạo enzim chế phẩm mốc thể hình 3.11 3.12 24 41 48 65 Thời gian (giờ) Protease 72 Amylase 400 4000 350 3500 300 3000 250 2500 200 2000 150 1500 100 1000 50 500 Alpha-amylaza (UI/g koji) Proteaza (UI/g koji) Hình 3.11: Động học tạo trình nuôi mốc Koji quy mô 35 kg/ mẻ với công thức nguyên liệu đậu tương hấp lúa mỳ rang tỷ lệ 1:1 24 41 48 65 Thời gian (giờ) Protease 72 Amylase Hình 3.12: Động học trình nuôi mốc Koji quy mô 35 kg/ mẻ với công thức nguyên liệu đậu tương hấp đậu tương rang t l 1:1 Trường ĐHBK - Hà Nội 46 Lun văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương Hoạt độ enzim hai mẻ thực nghiệm tương đối cao, với proteaza sau 72 nuôi cấy hoạt độ đạt 350 UI/g Koji với α-amylaza hoạt độ đạt 3500 UI/g Koji, dùng làm nguyên liệu cho trình lên men nước tương Nhưng so với chế phẩm nấm mốc nuôi cấy theo công nghệ đại dây chuyền tự động sản xuất nước tương Nhật có hoạt độ enzim proteaza lên tới 450 UI/g Koji α-amylaza 4500 UI/g Koji [14] chế phẩm nấm mốc mà chúng tơi nghiên cứu có hoạt độ enzim thấp Tuy nhiên với bước đầu nghiên cứu chế phẩm nấm mốc từ hai mẻ thực nghiệm có hoạt độ enzim quy trình cơng nghệ nghiên cứu ổn định đưa thực nghiệm quy mơ lớn.Qui trình ni cấy tạo chế phẩm mốc Koji thể hình 3.13 Đậu tương Lúa mỳ Ngâm 16-20 (nhiệt độ phịng) Hấp chín (1150C/60 phút) Rang (1800C/20 phút) Làm nguội Bào tử mốc giống Nghiền Trộn 0,35 g bào tử/kg nguyên liệu Đưa vào khay, độ dày cm Vào phịng ni Ni cấy 33-350C/24 25-280C/48 giờ, đảo giờ/lần Chế phẩm nấm mốc (Koji) Hình 3.13: Qui trình ni cấy chế phẩm nấm mốc Trường ĐHBK - Hà Nội 47 Lun tt nghip Trần Thị Mai Hương KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu thu kết sau đây: Lựa chọn chủng nấm mốc Aspergillus oryzae No1, chủng có khả thuỷ phân casein tinh bột cao số chủng nấm mốc nghiên cứu, cho sản xuất chế phẩm nấm mốc Koji Lựa chọn loại công thức nguyên liệu số loại khảo sát phù hợp với q trình ni mốc Koji là: đậu tương hấp lúa mì rang tỉ lệ 1:1; đậu tương hấp đậu tương rang tỉ lệ 1:1 Xác định điều kiện thích hợp đảm bảo cho q trình ni mốc Koji có hoạt lực enzim cao: - Thời gian ngâm đậu tương: 16-20 - Chế độ hấp đậu tương 1150C thời gian 60 phút - Tỷ lệ bào tử mốc giống ban đầu nguyên liệu khô: 0,35 g/kg - Nhiệt độ nuôi cấy tạo chế phẩm nấm mốc-Koji: 33-350C 24 đầu 25-280C 48 - Độ ẩm ban đầu khối ủ 42-45% bổ sung ẩm gián tiếp máy phun ẩm q trình ni - Độ dày khối ủ: cm - Chế độ đảo trộn nh k gi/ln Trường ĐHBK - Hà Nội 48 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương TÀI LIỆU THAM KHẢO A: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (1982), Vi sinh vật học Công nghiệp Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang (2000), Công nghệ enzime, Trường đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003),Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Một số sản phẩm vi nấm Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 1982 Nguyễn Thị Hiền (2006) Công nghệ sản xuất mì sản phẩn lên men cổ truyền, NXB KH&KT Hà Nội Nguyễn Thị Hiền Phan Thị Kim (1999), Nghiên cứu áp dụng enzim từ hạt nảy mầm từ vi sinh vật, Hội thảo sinh học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh tập, NXB Đại Học Quốc Gia-TP Hồ Chí Minh Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Xây dựng 10 Nguyễn Thanh Thuỷ (2004), Bài giảng: Enzim công nghệ sản xuất thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội B: TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 Alagasamy Sumantha, Chamdran Sandhya et al (2005), Production and partial purification of a neutral metalloprotease by fungal mixed substrate fermentation- Food technol Bio technol, 313 – 319 Tr­êng §HBK - Hµ Néi 49 Luận văn tốt nghiệp Trần Thị Mai Hương 12 Alagasamy Sumantha, Paul Deepa et al (2006), Pice brain as a substrate for proteolytic enzyme production, Brazilian archives of biology and technology 13 D.Fukushima,(1981) Soy proteins for foods centering around soy sauce and tofu, Journal of Fermented products, 346–354 14 D.Fukushim.,(2001) Soy saucc, Committcc of Bio-industry Association, Handbook of Fcrmcntation, Tokyo: Kyoritsu Shuppan Corp, 588–592 15 Horikoshi Koki (1996), Alkalophiles from an industrial poit of view, FEM, Microbial Rev, 259-270 16 Nunomura, M.Sasaki (1986) Soy sauce, Legume-based fermented foods, 5–46 17 KeShun Liu (1995), Soy Sauce as Natural Seasoning, University of Missouri, Columbia 18 Tzou-Chi Huang and Der-Feng Teng (1998), Soy Sauce: Manufacturing and Biochemical Changes, National Pingtung University of Science and Technology, Pingtung, Taiwan 19 WH Hsu, MN Lai, DL Lin, CD Jan, (1974) Studies on the brewing of soy sauce with mixed fermentation, Food Industry Research and Development Institute report 20 Kikkoman Corporation overview(onlinesource)." (2005) "Company profile: corporate [www.kikkoman.com/company/com_ove ] 21 Ong, K L.; Tan, S A & Toh, H K (2002) "Soy Sauce: a traditional Asian sauce now globalised." Singapore Polytechnic: School of Chemical and Life Science [www.sp.edu.sg/projects/ tjournal ] Tr­êng §HBK - Hµ Néi 50 ... tương truyền thống, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nước ta giới hạn luận văn tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Xác định nguyên nhân gây nhiễm vi sinh vật độc hại gây bệnh trình sản xuất tương truyền. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *********♦********* TRẦN THỊ MAI HƯƠNG XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY NHIỄM VI SINH GÂY BỆNH VÀ ĐỘC HẠI TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT TƯƠNG TRUYỀN THỐNG ĐỂ NÂNG... men vi sinh quan tâm thời gian gần Tuy nhiên nước ta chưa có sở sản xuất thực phẩm lên men có ứng dụng chế phẩm vi sinh vật giống khởi động cho nước tương lên men Hầu hết sở sản xuất dạng sản xuất