TỔNG QUAN
Tổng quan về carbocistein
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của carbocistein
- Tên khoa học: (2R)-2-amino-3-(carboxymethylsulfanyl)propanoic acid
- Công thức phân tử: C5H9NO4S [23]
- Khối lƣợng phân tử: 179,19 g/mol [23]
- Một số tên gọi khác: carbocystein, S-carboxymethyl-L-cystein [23]
- Bột kết tinh hay tinh thể hình đĩa, không màu
- Tan trong nước sôi, không tan trong nước lạnh, không tan trong một số dung môi hữu cơ thông thường như ethanol, methanol, aceton…
- Độ quay cực riêng: = 0,5 (trong dung dịch HCl 1N)
Carbocistein is an α-amino acid characterized by the presence of both –COOH and –NH2 groups, enabling it to undergo distinctive reactions associated with amine and carboxyl groups, such as acetylation, formylation, and esterification.
Nhóm amin và nhóm carboxyl của α-amino acid khi bị oxy hóa bởi ninhydrin dưới nhiệt độ cao sẽ tạo ra dạng khử, CO2, NH3 và aldehyd Sau đó, ninhydrin cùng với sản phẩm khử sẽ phản ứng với NH3 tự do để hình thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở λ= 570 nm Cường độ màu của phức hợp này có thể được sử dụng để xác định nồng độ của α-amino acid, do đó phản ứng này có thể áp dụng trong việc định tính và định lượng α-amino acid.
Ninhydrin Carbocistein Màu xanh tím
Hình 1.2 Phản ứng của carbocistein với ninhydrin
Trong môi trường kiềm, acid amin kết hợp với ion Cu 2+ để hình thành phức hợp màu tím ở dạng anion Phản ứng này tạo ra phức bền vững và ổn định, được ứng dụng trong việc định lượng acid amin.
Hình 1.3 Phản ứng Biure của α-amino acid
Fluorescamin phản ứng với nhóm α-amino của α-amino acid tạo dẫn xuất huỳnh quang Phản ứng này rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới cỡ nano gram
Hình 1.4 Phản ứng của acid amin với Fluorescamin
Acid amin phản ứng với clorid dabsyl, clorid dansyl và 1- fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein Phản
Fluorescamin Acid amin Dẫn xuất huỳnh quang
Có 5 ứng dụng để xác định acid amin-N tận cùng, dựa trên phản ứng của acid amin với clorid dabsyl và 1-fluoro-2,4 dinitrobezen, tạo ra các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein.
Hình 1.5 Phản ứng Sanger của acid amin
Carbocistein là một phân tử chứa lưu huỳnh, có khả năng tham gia phản ứng Folh để xác định acid amin chứa lưu huỳnh Khi được đun nóng trong môi trường kiềm, carbocistein tạo ra muối sulfid, và chất này phản ứng với muối chì để tạo thành chì sulfid có màu đen xám.
- Phân tử carbocistein có chứa nhóm chức acid (diacid), nên có phản ứng đặc trƣng của acid: phản ứng este hóa, phản ứng acyl hóa
Carbocistein là một chất giúp điều hòa đờm, thường được sử dụng trong điều trị hỗ trợ các rối loạn hô hấp có đặc điểm là sản sinh chất nhầy quá mức và nhớt, bao gồm bệnh đường thở tắc nghẽn mạn tính.
Carbocistein, một dẫn xuất cystein, có tác dụng làm giảm độ nhớt của chất nhầy bằng cách phá vỡ cầu nối disulphid giữa các đại phân tử trong chất nhầy, giúp khạc đờm dễ dàng hơn Đặc tính nhớt của chất nhầy phế quản chủ yếu được xác định bởi các glycoprotein như fucomucin, sialomucin và sulfomucin, trong đó nồng độ fucomucin thường cao hơn ở bệnh nhân mắc COPD Carbocistein giúp thiết lập lại sự cân bằng giữa sialomucin và fucomucin, tăng cường nồng độ sialomucin và giảm nồng độ fucomucin.
Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng carbocistein có khả năng tăng cường vận chuyển clorua qua biểu mô đường hô hấp, điều này có thể góp phần vào hoạt động của niêm mạc.
Một số nghiên cứu đã chứng minh carbocistein làm giảm độ nhớt đờm đo đƣợc ngay sau 4 ngày sau khi bắt đầu điều trị [8], [11] Ngoài ra còn có bằng
Nghiên cứu đã chỉ ra 6 chứng in-vivo và in-vitro cho thấy carbocistein có khả năng tăng tốc độ thanh thải niêm mạc, đặc biệt hiệu quả ở những bệnh nhân có độ thanh thải chậm trước khi điều trị.
Carbocistein có tác dụng làm tăng sự thâm nhập của amoxicilin vào dịch tiết phế quản ở bệnh nhân viêm phế quản mãn tính do vi khuẩn khi được sử dụng đồng thời Hiện tượng này có thể liên quan đến sự thay đổi thành phần glycoprotein trong đờm Việc cải thiện khả năng cung cấp kháng sinh đến vị trí nhiễm khuẩn có thể nâng cao hiệu quả điều trị của kháng sinh Tuy nhiên, ý nghĩa lâm sàng của phát hiện này đối với các đợt cấp của nhiễm trùng cấp tính vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Carbocistein có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm mạnh mẽ, giúp loại bỏ gốc tự do trong cơ thể Nhóm thioeste của carbocistein có khả năng bị oxy hóa bởi các gốc oxy hoạt động, tạo ra các sản phẩm phụ như sulfoxid hoặc dẫn xuất sulfon Tác dụng này đặc biệt chọn lọc đối với nhóm -HClO, góp phần nâng cao hiệu quả chống oxy hóa.
Tác dụng oxy hóa đã được chứng minh qua việc kích hoạt các tế bào máu đơn nhân ngoại vi, giúp giảm sản xuất các cytokine tiền viêm như TNF-α, IL-6 và IL-8, từ đó có tác dụng chống viêm Tuy nhiên, cơ chế chống oxy hóa của nó vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn.
Nghiên cứu của Mutsuo và cộng sự chỉ ra rằng carbocistein có khả năng ngăn ngừa lây nhiễm cúm A bằng cách ức chế yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor-kappa B) và làm tăng pH trong endosomes, từ đó giảm số lượng thụ thể virus cúm ở tế bào biểu mô đường hô hấp.
Carbocistein được hấp thu hiệu quả qua đường uống, với nồng độ đỉnh trong huyết thanh đạt được sau 1 đến 1,7 giờ Thời gian bán hủy trong huyết tương là 1,33 giờ, cho thấy khả năng thâm nhập tốt vào mô phổi và dịch tiết phế quản.
Carbocistein được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) Nghiên cứu lâm sàng của Zheng Zeng tại Trung Quốc vào năm 2001 cho thấy việc sử dụng carbocistein trong thời gian dài giúp giảm tỷ lệ trầm trọng của bệnh và số lượng bệnh nhân trải qua ít nhất một đợt trầm trọng, đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống của họ.
Tổng quan về carbocistein lysin
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của carbocistein lysin
- Khối lƣợng phân tử: 343,4 g/mol [37]
- Một số tên gọi khác: carbocystein lysin, S-carboxymethyl-L-cystein lysin, carbocistein lysin monohydrat [20]
- Tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng [26]
1.2.3 Tác dụng dược lý, chỉ định của carbocistein lysin và ưu điểm so với carbocistein
Các thuốc điều hòa đờm có thể gây xói mòn dạ dày do thay đổi đặc tính của chất nhầy, làm hỏng lớp bảo vệ niêm mạc dạ dày Carbocistein, với cấu trúc có 2 nhóm –COOH, có tác dụng kích thích đường tiêu hóa, dẫn đến các triệu chứng khó chịu như buồn nôn, nôn, xuất huyết tiêu hóa và các tác dụng phụ khác khi sử dụng lâu dài.
Carbocistein có thể gây tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa, dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như chảy máu, loét hoặc thủng, vì vậy nó chống chỉ định trong trường hợp loét dạ dày hoạt động Mặc dù một số tác dụng phụ nhẹ, chủ yếu là khó chịu ở dạ dày, đã được ghi nhận, ví dụ như 1,8% bệnh nhân trong nghiên cứu của Allegra năm 1996, nhưng tác dụng phụ này thường liên quan đến việc sử dụng lâu dài carbocistein.
Carbocistein có tính hòa tan kém trong nước và tính acid cao, điều này hạn chế việc sử dụng của nó Tuy nhiên, muối lysin hòa tan trong nước của carbocistein khắc phục được những nhược điểm này, cho phép sử dụng thuốc cho các bệnh phổi mãn tính cần điều trị bằng thuốc điều hòa đờm lâu dài Muối lysin của carbocistein có thể được dùng dưới dạng chế phẩm đường uống, và nhóm lysin sẽ được phân cắt trong dạ dày để tạo thành carbocistein hoạt động.
Carbocistein lysin là một chất điều hòa đờm hiệu quả, giúp phá vỡ các cầu nối disulfid của glycoprotein và tác động vào pha gel của đờm Chất này thiết lập sự cân bằng giữa các chất nhầy sialomucin và fucomucin, làm tăng tính lưu động và hỗ trợ loại bỏ chất nhầy Ngoài ra, Carbocistein lysin còn có khả năng điều chỉnh vận chuyển Cl- qua biểu mô khí quản, từ đó giúp tiết dịch hiệu quả.
Carbocistein lysin không chỉ có tác dụng làm loãng đờm trong các bệnh viêm phổi cấp và mãn tính, mà còn có khả năng dọn dẹp các chất oxy hóa trung gian nhờ vào khả năng phản ứng với các gốc acid hypoclorid (HOCl) và gốc hydroxyl (OH•) Việc dọn dẹp gốc HOCl giúp bảo vệ chất ức chế a1-antitripsin (a1-AT) khỏi tác động của các gốc oxy hóa Hơn nữa, carbocistein lysin còn làm giảm đáng kể sự sản xuất interleukin (IL)-8, một chất trung gian quan trọng trong phản ứng viêm, thông qua việc ức chế sản xuất IL-8 của bạch cầu đa nhân trung tính do OH•.
Do đó, các tác động dọn dẹp gốc oxy hóa trung gian góp phần làm tăng hiệu quả điều trị của carbocistein lysin [19]
Nghiên cứu của T.A Kryuchkova (2013) cho thấy muối carbocistein lysin có hiệu quả cao và an toàn trong điều trị các bệnh viêm đường hô hấp cấp tính và mãn tính ở trẻ em Thuốc giúp bệnh nhân hồi phục nhanh chóng và có thể kết hợp với các loại thuốc khác trong thực hành nhi khoa Khi sử dụng chung với kháng sinh, carbocistein lysin tăng cường sự thâm nhập của kháng sinh vào dịch tiết phế quản, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị Carbocistein lysin không độc hại, dung nạp tốt trong thời gian dài, nên có thể được khuyên dùng cho trẻ em trong cả phòng khám và bệnh viện.
Nghiên cứu của D.S Tyrtov tại Nga năm 2014 cho thấy việc sử dụng muối carbocistein lysin ở bệnh nhân mắc bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính có tác dụng tích cực Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra rằng muối carbocistein lysin cải thiện chất lượng đờm, giảm nhu cầu sử dụng thuốc giãn phế quản, tăng khả năng chịu đựng hoạt động thể lực, và đồng thời giảm tần suất, mức độ nghiêm trọng cũng như thời gian trầm trọng của bệnh.
Năm 2019, G Paone và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu lâm sàng tại Ý về tác dụng của muối carbocistein lysin đối với tần suất đợt cấp ở bệnh nhân COPD, cả những người sử dụng và không sử dụng steroid hít Kết quả cho thấy việc sử dụng lâu dài liều 2,7 g/ngày muối carbocistein lysin giúp giảm số lần trầm trọng ở bệnh nhân COPD, từ đó khuyến nghị sử dụng carbocistein lysin trong thực hành lâm sàng.
Bệnh phế quản có thể chia thành hai loại chính: cấp tính và mãn tính, thường đi kèm với sự hình thành đờm và khó khạc đờm Các bệnh lý liên quan bao gồm viêm khí quản, viêm phế quản, hen phế quản và bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính.
- Các bệnh viêm tai giữa và xoang cạnh mũi, kèm theo sự hình thành của chất nhầy, bao gồm: viêm mũi, viêm mũi, viêm tai giữa, viêm xoang
- Chuẩn bị cho bệnh nhân nội soi phế quản và nội soi phế quản
Các phương pháp điều chế muối carbocistein lysin
Wang L và các cộng sự tiến hành tạo muối carbocistein lysin theo sơ đồ sau:
(R) + H 2 O carbocistein L-lysin hydroclorid carbocistein lysin
Phương pháp tạo muối carbocistein lysin theo Wang L cải tiến từ quy trình sản xuất truyền thống bằng cách hòa tan L-lysin hydroclorid trong nước, trung hòa bằng natri hydroxyd, và thêm carbocistein để tạo muối ở nhiệt độ cao Hạn chế của phương pháp truyền thống là độ hòa tan thấp của carbocistein dẫn đến hiệu quả phản ứng thấp, năng suất và độ tinh khiết sản phẩm không cao Hơn nữa, quá trình trung hòa tạo ra natri clorua, làm mất một phần sản phẩm Wang L đã phát triển quy trình sáng chế với sản phẩm có cấu trúc tinh thể ổn định, thời gian bảo quản dài, và quy trình sản xuất phù hợp cho quy mô công nghiệp.
(1) Hòa tan carbocistein trong dung dịch amoniac và nạp lên cột nhựa trao đổi ion Rửa cột đến trung tính bằng nước tinh khiết
Hòa tan L-lysin hydroclorid trong nước tinh khiết và nạp lên cột để thực hiện phản ứng tạo muối Quá trình thu dòng chảy bắt đầu khi có phản ứng dương tính với ninhydrin và tiếp tục cho đến khi dòng chảy phản ứng dương tính với ion clorid, lúc này thì ngừng thu.
Thêm 1% dịch theo trọng lượng của than hoạt tính, khuấy trong 10 phút để khử màu, sau đó lọc để loại bỏ than hoạt Dịch lọc được cô đặc còn khoảng 30 - 70% thể tích dưới chân không và được làm lạnh để kết tinh trong khoảng thời gian từ 8 đến 24 giờ.
11 giờ, ly tâm thu sản phẩm, sấy khô ở nhiệt độ 40 - 80 °C dưới chân không trong 3
- Phương pháp của Maria A và các cộng sự (1992) [20]
Maria A và các cộng sự tiến hành tạo muối carbocistein lysin theo sơ đồ sau:
Hình 1.8 Sơ đồ phương pháp tạo muối carbocistein lysin theo Maria A
Quá trình tạo muối bao gồm các bước sau:
(1) Hòa tan carbocistein trong dung dịch nước lysin ở nhiệt độ phòng dưới sự khuấy trộn, theo tỷ lệ gần nhƣ cân bằng hóa học
(2) Khử màu và lọc dung dịch thu đƣợc
(3) Pha loãng với ethanol với số lƣợng 2 - 10 thể tích, tốt nhất là 4 - 6 thể tích, tương ứng với thể tích dung dịch đã xử lý
(4) Kết tinh bằng cách khuấy ở nhiệt độ từ 15 đến 30 °C trong 10 - 48 giờ, tốt nhất là ở 20 - 25 °C trong 24 - 30 giờ
- Phương pháp của Wang T và các cộng sự (2018) [28]
Wang T và các cộng sự tiến hành tạo muối carbocistein lysin theo sơ đồ sau:
Hình 1.9 Sơ đồ phương pháp tạo muối carbocistein lysin theo Wang T
Muối carbocistein lysin được hình thành thông qua quá trình khuấy trộn lysin và carbocistein trong nước với tỷ lệ mol là 1 (từ 0,8 đến 1,2) Nồng độ carbocistein trong dung dịch nước nên dao động từ 10% đến 50%, với mức tối ưu là 30% đến 40% tính theo khối lượng Nhiệt độ phản ứng cũng là yếu tố quan trọng trong quá trình này.
20 - 40°C (tốt nhất là 28 - 32 °C) trong thời gian 1 - 5 giờ (tốt nhất là 2 - 4 giờ) tạo dung dịch muối, thu sản phẩm bằng phương pháp phun sấy Nhiệt độ không
Máy sấy phun hoạt động với khí nạp có nhiệt độ từ 80 - 120 °C và nhiệt độ cửa thoát khí từ 50 - 100 °C Tần số nguyên tử hóa dao động trong khoảng 500 - 2000 vòng/phút, trong khi tốc độ quay của bơm nhu động là 10 - 50 vòng/phút Quá trình sấy phun đảm bảo sản phẩm không còn dư lượng dung môi, có hạt đồng nhất và không tạo ra tạp chất, đồng thời không sử dụng dung môi hữu cơ, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Phân tích và lựa chọn phương pháp
Muối carbocistein lysin được phổ biến ở nhiều nước châu Âu như Ý, Tây Ban Nha và Nga dưới các dạng như cốm, bột pha uống, siro và dung dịch uống Trong khi đó, tại Việt Nam, các chế phẩm chứa carbocistein chủ yếu tồn tại ở dạng tự do, và hiện chưa có nghiên cứu cũng như thương mại hóa carbocistein lysin Hơn nữa, tiêu chuẩn sản xuất cho hoạt chất này vẫn chưa được công bố.
Năm 2016, nhóm nghiên cứu Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã thành công trong việc tổng hợp carbocistein với quy mô 10 kg/mẻ từ nguyên liệu trong nước, bao gồm L-cystin và L-cystein, sản phẩm thủy phân từ phế phẩm keratin Đề tài nghiên cứu dựa trên quy trình của Maria A và cộng sự, tận dụng nguyên liệu sẵn có và quy trình tinh chế đơn giản, dễ thực hiện ở nhiều quy mô Nhóm nghiên cứu đã tạo muối carbocistein lysin và khảo sát các điều kiện phản ứng cũng như tinh chế để tối ưu hóa quy trình.
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát các điều kiện tạo muối carbocistein lysin ở quy mô 2 g/mẻ:
+ Tỷ lệ mol lysin : carbocistein
+ Ảnh hưởng của khí trơ đến phản ứng
+ Tỷ lệ dung môi kết tinh
+ Ảnh hưởng của khuấy trộn đến kết tinh
+ Ảnh hưởng của khí trơ đến kết tinh
- Khảo sát quá trình tinh chế sản phẩm
- Xây dựng quy trình tạo muối và tinh chế carbocistein lysin quy mô 20 g/mẻ
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy
Để đánh giá các đặc trưng của sản phẩm, cần xác định cấu trúc thông qua các phương pháp phân tích như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ (1H-NMR, 13C-NMR), phổ nhiễu xạ tia X (XRPD), quét nhiệt lượng vi sai (DSC) và đo pH Những phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, tính chất vật lý và hóa lý của sản phẩm, giúp đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất trong quy trình sản xuất.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng quy trình tạo muối và tinh chế sản phẩm
Tạo muối carbocistein lysin được tiến hành theo phương pháp của Maria A [20] theo sơ đồ sau:
Hình 1.8 Sơ đồ phương pháp tạo muối carbocistein lysin theo Maria A
Kết tinh sản phẩm bằng các phương pháp kết tinh trong dung môi thích hợp
2.3.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết Đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm trên máy EZ – Melt (Mỹ)
2.3.3 Xác định cấu trúc và một số đặc trưng của sản phẩm
Sản phẩm đƣợc đƣợc xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon
( 13 C-NMR) và đánh giá một số đặc trƣng bằng phổ nhiễu xạ tia X (XRPD), quét nhiệt lƣợng vi sai (DSC), pH
Phổ hồng ngoại (IR) được ghi nhận tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr trong khoảng 4000-400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã được sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 và sau đó được ép thành film mỏng dưới áp lực cao với hệ thống hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng (MS) được thực hiện tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng máy đo LC/MSD Trap Agilent với dung môi nước.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^1H-NMR và ^13C-NMR đã được ghi lại trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi.
- Phổ nhiễu xạ tia X (XRSD) được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Nhiệt quét vi sai (DSC) được thực hiện trên máy Setaram DSC131 tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Mẫu được phân tích trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 300 °C với tốc độ gia nhiệt 10 °C/phút.
- pH dung dịch carbocistein 9% trong nước được đo trên máy Mettler Toledo tại bộ môn Công nghiệp dược, Trường Đại học Dược Hà Nội
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng quy trình tạo muối và tinh chế carbocistein lysin
3.1.1 Tạo muối carbocistein lysin quy mô 2 g/mẻ
- Tiến hành tạo muối carbocistein lysin quy mô 2 g/mẻ theo quy trình của Maria
Hình 1.8 Sơ đồ phương pháp tạo muối carbocistein lysin theo Maria A
Trong một bình cầu 100 mL, hòa tan 1,63 gam (0,011 mol) L-lysine trong 3,5 mL nước cất, sau đó thêm 2 gam (0,011 mol) carbocistein và khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ Tiếp theo, thêm 0,01 gam than hoạt để tẩy màu trong 30 phút, rồi lọc lấy dịch Sau đó, thêm 5 lần thể tích ethanol 96% so với lượng dịch đã lọc và khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm để kết tinh sản phẩm Cuối cùng, lọc thu sản phẩm và sấy ở 60 °C trong 2 giờ để thu được sản phẩm thô.
- Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng Khối lƣợng sản phẩm: 3,65 g Hiệu suất đạt đƣợc: 95,28% Nhiệt độ nóng chảy: 183,3 – 186,2 °C
3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo muối và kết tinh muối
Nhóm nghiên cứu đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo muối, bao gồm tỷ lệ mol lysin và carbocistein, nhiệt độ, thời gian phản ứng, dung môi, và tác động của khí trơ Ngoài ra, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tinh muối cũng được xem xét, như dung môi kết tinh, tỷ lệ dung môi, thời gian và nhiệt độ kết tinh, cũng như ảnh hưởng của khuấy trộn và khí trơ.
3.1.2.1 Tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein
Để đánh giá tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng và ảnh hưởng của chúng đến hiệu suất cũng như chất lượng sản phẩm, các thí nghiệm được thực hiện với lượng carbocistein cố định là 2,00 g, trong khi lượng L-lysin được thay đổi.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein tới phản ứng
Tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein
Kết quả bảng 3.1 đƣợc thể hiện ở đồ thị sau:
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ mol tới hiệu suất phản ứng
Tỷ lệ mol lysin : carbocistein có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất phản ứng, theo bảng số liệu 3.1 và hình 3.1 Cụ thể, khi tỷ lệ mol lysin : carbocistein được tăng từ 0,8:1 lên 1,0:1, hiệu suất phản ứng cũng tăng dần và khoảng nóng chảy gần như ổn định.
Tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein
Tỷ lệ mol tối ưu cho phản ứng giữa lysin và carbocistein là 1:1, vì ở tỷ lệ này, hiệu suất cao nhất được đạt được Khi tăng tỷ lệ mol lên 1,1:1 và 1,2:1, hiệu suất chỉ tăng nhẹ và khoảng nóng chảy trở nên rộng hơn, dẫn đến sự xuất hiện của tạp chất lysin dư thừa.
3.1.2.2 Nhiệt độ phản ứng Để đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng, các thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, các nhiệt độ đƣợc khảo sát là 10 °C,
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng
Kết quả bảng 3.2 đƣợc thể hiện ở đồ thị sau:
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng
Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất phản ứng ở nhiệt độ thấp 10 °C chỉ đạt 82,96% Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên 25 °C, hiệu suất phản ứng cải thiện đáng kể, đạt 95,23%, trong khi khoảng nóng chảy gần như không thay đổi Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 40 và 55 °C, hiệu suất phản ứng chỉ thay đổi không nhiều, nhưng khoảng nóng chảy trở nên rộng hơn.
Vì vậy phản ứng diễn ra tốt nhất ở nhiệt độ phòng
3.1.2.3 Thời gian phản ứng Để đánh giá được ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng, các thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, nhiệt độ phòng, thời gian đƣợc khảo sát từ 1,5 giờ – 3 giờ
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng
Kết quả bảng 3.3 đƣợc thể hiện ở đồ thị sau:
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng
Khi thời gian phản ứng được tăng lên 2 giờ, hiệu suất phản ứng đạt mức tối ưu, trong khi khoảng nóng chảy gần như không đổi Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian phản ứng đến 2,5 giờ và 3 giờ, hiệu suất chỉ tăng nhẹ và khoảng nóng chảy trở nên rộng hơn Do đó, thời gian phản ứng 2 giờ là thời điểm tốt nhất để đạt được hiệu suất và chất lượng sản phẩm cao.
3.1.2.5 Ảnh hưởng của hí trơ Để đánh giá được ảnh hưởng của dung môi tới phản ứng, các thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, dung môi nước, nhiệt độ phòng, thời gian 2 giờ, sục khí N2 và không sục N2
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của khí trơ tới phản ứng
STT Khí trơ Cảm quan sản phẩm
Thời gian phản ứng (giờ)
Phản ứng sục khí N2 cho hiệu suất cao hơn và khoảng nóng chảy hẹp hơn so với phản ứng không sục N2, đồng thời cải thiện tính chất cảm quan của sản phẩm Do đó, việc sục khí N2 giúp nâng cao chất lượng và hiệu quả của phản ứng.
3.1.2.5 Dung môi kết tinh Để đánh giá được ảnh hưởng của dung môi kết tinh, các thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, dung môi nước, nhiệt độ phòng, thời gian 2 giờ Dung môi dùng để pha loãng dịch lọc sau phản ứng đƣợc khảo sát là ethanol, isopropyl alcol với thể tích gấp 5 lần thể tích dịch lọc
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi kết tinh
STT Dung môi kết tinh
1 Nước (không pha loãng, làm lạnh) Không có Không có Không có Không có
Sản phẩm không kết tinh khi làm lạnh dịch lọc mà không pha loãng bằng dung môi khác Tuy nhiên, khi pha loãng bằng ethanol và isopropanol, sản phẩm kết tinh với hiệu suất cao hơn khi sử dụng ethanol Khoảng nóng chảy của sản phẩm khi kết tinh bằng hai dung môi này tương tự nhau, cho thấy ethanol là dung môi kết tinh tốt hơn với hiệu suất đạt 95,23%.
3.1.2.6 Tỷ lệ dung môi kết tinh Để đánh giá được ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi kết tinh, các thí nghiệm đƣợc tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, dung môi nước, nhiệt độ phòng, thời gian 2 giờ Dung môi dùng để pha loãng dịch lọc sau phản ứng là ethanol với
23 các tỷ lệ đƣợc khảo sát là lƣợng ethanol gấp 2,5 lần, 5 lần và 10 lần lƣợng dịch lọc
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi kết tinh
STT Tỷ lệ dung môi kết tinh
Nhận xét: Với tỷ lệ ethanol gấp 5 lần nước, sản phẩm kết tinh với hiệu suất tốt
Với tỷ lệ ethanol thấp hơn hiệu suất kết tinh giảm, với tỷ lệ ethanol cao hơn hiệu suất kết tinh thay đổi không đáng kể
3.1.2.7 Thời gian kết tinh Để đánh giá được ảnh hưởng của thời gian kết tinh, các thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ mol L-lysin : carbocistein = 1:1 là: 2,00 g (0,011 mol) carbocistein và 1,63 g (0,011 mol) L-lysin, dung môi nước, nhiệt độ phòng, thời gian 2 giờ Dung môi dùng để pha loãng dịch lọc sau phản ứng là ethanol tích gấp 5 lần thể tích dịch lọc Thời gian kết tinh đƣợc khảo sát là 12 h, 24 h, 36 h
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát thời gian kết tinh
Thời gian kết tinh (giờ)
Kết quả bảng 3.7 đƣợc thể hiện ở đồ thị sau:
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian kết tinh đến hiệu suất
Đánh giá một số đặc trƣng của sản phẩm
hạt nhân ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon ( 13 C-NMR), phổ nhiễu xạ tia X (XRPD), quét nhiệt lượng vi sai (DSC), pH dung dịch 9% trong nước
Kết quả đo phổ khối lƣợng của sản phẩm đƣợc thể hiện ở phụ lục 1 và bảng 3.15
Bảng 3.15 Kết quả phân tích phổ IR của carbocistein lysin
Công thức cấu tạo Nhóm max (cm -1 )
Phân tích phổ đồ của sản phẩm giúp xác định các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm chức acid carboxylic (-COOH) và nhóm amin, phù hợp với công thức cấu tạo của sản phẩm.
Kết quả đo phổ khối lƣợng của sản phẩm đƣợc thể hiện ở phụ lục 2 và bảng 3.16 Chất phân tích được hòa tan trong dung môi là nước
Bảng 3.16 Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của carbocistein
Khối lƣợng phân tử (đvC) m/z
Dựa trên số liệu phổ MS, sản phẩm thể hiện pic phân tử với số khối phù hợp với khối lượng phân tử dự kiến.
3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR)
Tiến hành ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Dung môi được sử dụng:
D2O Kết quả đƣợc thể hiện ở phụ lục 3, 4 và bảng 3.17
Bảng 3.17 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của carbocistein lysin
Công thức cấu tạo sản phẩm δ (ppm)
J 2 =8,0 Hz, H-2) 3,72 (1H, t, J= 6,0 Hz, H-2’) 3,27 (2H, d, J=2,0 Hz, H-4) 3,12 ( 1H, dd, J 1 = 4,5 Hz,
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton cho thấy sản phẩm có cấu trúc nhƣ dự kiến
3.2.4 Phổ cộng hưởng từ carbon ( 13 C-NMR)
Tiến hành ghi phổ cộng hưởng từ carbon 13 Dung môi được sử dụng là D 2 O Kết quả đƣợc thể hiện ở phụ lục 5, 6 và bảng 3.18
Bảng 3.18 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của carbocistein lysin
Công thức cấu tạo sản phẩm δ (ppm)
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến
Tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X Kết quả đƣợc thể hiện ở phụ lục 7 và bảng sau: Bảng 3.19 Kết quả phân tích phổ nhiễu xạ tia X của carbocistein lysin
Các pic theo tài liệu Các pic thực tế d (Å) I/I max (%) D (Å) I/I max (%)
Các pic theo tài liệu Các pic thực tế d (Å) I/I max (%) D (Å) I/I max (%)
Các pic theo tài liệu Các pic thực tế d (Å) I/I max (%) D (Å) I/I max (%)
Nhận xét: Trên phổ nhiễu xạ tia X xuất hiện các pic tương tự với tài liệu [20]
3.2.6 Quét nhiệt lượng vi sai (DSC)
Phân tích quét nhiệt vi sai đã được thực hiện, với kết quả được trình bày trong phụ lục 8 Các đỉnh nhiệt nội cực đại ghi nhận được là 180,64 °C và 197,15 °C, tương đồng với các giá trị trong tài liệu trước đó là 178,25 °C và 193,01 °C [20].
3.2.7 Đo pH dung dịch muối carbocistein lysin
Tiến hành đo pH dung dịch carbocistein lysin 9% trong nước Kết quả pH = 6,35 đúng với pH theo tài liệu (pH= 6,0 - 7,0 [20]).
Bàn luận
3.3.1 Về tạo muối và tinh chế muối carbocistein lysin
3.3.1.1 Về phản ứng tạo muối carbocistein lysin Đề tài đã sử dụng và cải tiến phương pháp tạo muối carbocistein lysin từ phương pháp chính của tác giả Maria A và các cộng sự, đi từ 2 nguyên liệu là carbocistein là L-lysin Đây là phản ứng tạo muối giữa một acid và một base Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng như tỷ lệ mol lysin : carbocistein, nhiệt độ, thời gian, dung môi, ảnh hưởng của khí trơ Vì thế nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố trên để tìm ra thông số tối ƣu cho phản ứng
Tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng là yếu tố quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm Carbocistein phản ứng tối ưu với lysin ở tỷ lệ 1:1 Khi tỷ lệ lysin so với carbocistein giảm xuống còn 0,8:1 hoặc 0,9:1, khả năng phản ứng hoàn toàn với carbocistein sẽ bị giảm, dẫn đến việc carbocistein dư thừa và hiệu suất thấp do mất mát trong quá trình lọc Ngược lại, khi tăng tỷ lệ lysin so với carbocistein lên 1,1:1 hoặc 1,2:1, hiệu suất phản ứng sẽ được cải thiện.
35 cũng không làm tăng hiệu suất so với tỷ lệ 1:1 mà có thể tăng lƣợng tạp lysin làm giảm độ tinh khiết của sản phẩm
Lysin là hợp chất không bền, dễ bị oxy hóa và tạo ra tạp chất màu Để nâng cao hiệu suất và đảm bảo sản phẩm tinh khiết, cần sục khí nitơ và bọc kín bình phản ứng, tránh tiếp xúc với không khí trong suốt quá trình phản ứng Nghiên cứu cho thấy phản ứng diễn ra hiệu quả nhất ở nhiệt độ phòng; khi nhiệt độ tăng, hiệu suất không cải thiện mà lượng tạp chất lại gia tăng, thể hiện qua khoảng nóng chảy rộng hơn.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát để xác định thời gian phản ứng tối ưu, vì tài liệu không cung cấp thông tin này Kết quả cho thấy thời gian phản ứng tốt nhất là 2 giờ, trong khi thời gian ngắn hơn không đạt hiệu suất cao, và thời gian dài hơn không chỉ không tăng hiệu suất mà còn làm giảm độ tinh khiết của sản phẩm.
3.3.1.2 Về kết tinh và tinh chế sản phẩm
Sản phẩm muối carbocistein lysin có khả năng tan tốt trong nước nhưng tan kém trong các dung môi như ethanol và isopropanol Do đó, phương pháp kết tinh sản phẩm trở nên đơn giản hơn khi thêm các dung môi này Kết quả khảo sát cho thấy ethanol là dung môi kết tinh hiệu quả nhất, với tỷ lệ tối ưu là gấp 5 lần lượng dịch lọc.
Nhiệt độ và thời gian kết tinh đã được nghiên cứu, cho thấy sản phẩm kết tinh tốt ở nhiệt độ phòng với hiệu suất cao, không cần làm lạnh Phương pháp kết tinh này tiết kiệm năng lượng và đơn giản hóa quy trình, thuận tiện cho việc mở rộng quy mô Thời gian kết tinh tối ưu là 24 giờ; thời gian ngắn hơn sẽ giảm hiệu suất, trong khi thời gian dài hơn có thể làm tăng lượng tạp chất trong sản phẩm Do thời gian kết tinh khá dài, sản phẩm có nguy cơ bị oxy hóa, vì vậy việc sục khí trơ trong quá trình kết tinh là cần thiết để nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm.
Khuấy trộn trong quá trình kết tinh đóng vai trò quan trọng, giúp pha cồn dễ dàng hòa trộn với dịch phản ứng đậm đặc, từ đó làm cho quá trình kết tinh trở nên thuận lợi hơn, đặc biệt khi nâng cấp quy mô sản xuất Hơn nữa, khuấy trộn cũng duy trì trạng thái hỗn dịch, đảm bảo chất lượng bột kết tinh.
Kết tinh nhỏ mịn không bị lắng đọng dưới đáy bình giúp quá trình thu sản phẩm dễ dàng hơn, đồng thời nâng cao tính cảm quan của sản phẩm Bột mịn không vón cục mang lại chất lượng tốt hơn cho sản phẩm cuối cùng.
Sản phẩm được tinh chế bằng cách hòa tan sản phẩm thô trong nước và kết tinh lại bằng cồn Quá trình này giúp thu hẹp khoảng nóng chảy của sản phẩm so với dạng thô ban đầu Nghiên cứu cho thấy, chỉ cần một lần kết tinh lại, sản phẩm đã đạt được độ tinh khiết mong muốn.
Các khảo sát đã giúp tối ưu hóa điều kiện phản ứng và tinh chế, hoàn thiện quy trình sản xuất muối Quy trình này không chỉ đơn giản mà còn có hiệu suất cao, ổn định khi nâng cấp quy mô, và dễ dàng triển khai ở quy mô lớn hơn.
3.3.2 Về xác định một số đặc trưng của sản phẩm
Phân tích phổ hồng ngoại giúp xác định các dải hấp phụ đặc trưng liên quan đến dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức, cũng như các liên kết đặc trưng trong cấu trúc phân tử của chất được phân tích.
Phổ hồng ngoại của carbocistein lysin có các dải hấp thụ đặc trƣng của các nhóm N-H (3427, 3179, 2636), C-H no (2935, 2867), C=O carboxylat (1599,
1631), C-O (1227) phù hợp với cấu trúc phân tử dự kiến
Carbocistein lysin monohydrat có khối lƣợng phân tử là 343,4 đvC Kết quả phân tích phổ khối lƣợng cho thấy pic phân tử có số khối phù hợp (m/z thực tế = 341,75 ([M-H] - ))
3.3.2.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho phép nhận biết được các dạng proton và số lƣợng proton của từng chất tạo thành
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbocistein lysin xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho các proton trong phân tử:
- Tín hiệu doublet doublet ở 3,88 ppm là tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí carbon bất đối số 2
- Tín hiệu triplet ở 3,72 ppm là tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí carbon bất đối số 2’
- Tín hiệu doublet ở 3,27 ppm là tín hiệu thuộc 2 proton của nhóm -CH2- ở vị trí số 4
- Tín hiệu doublet doublet ở 3,12 ppm tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí số 3a
- Tín hiệu doublet doublet ở 3,01 ppm tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí số 3b
- Tín hiệu triplet ở 2,98 ppm là tín hiệu thuộc 2 proton của nhóm -CH2- ở vị trí số 6’
- Tín hiệu multiplet ở 1,84-1,89 ppm là tín hiệu thuộc 2 proton của nhóm -CH2- ở vị trí số 3’
- Tín hiệu quartet ở 1,69 ppm tín hiệu thuộc 2 proton của nhóm -CH2- ở vị trí số 5’
- Tín hiệu multiplet ở 1,40-1,50 ppm là tín hiệu thuộc 2 proton của nhóm -CH 2 - ở vị trí số 4’
Proton của nhóm NH2 và COOH không quan sát thấy do sự trao đổi hydro với dung môi D2O Cường độ tích phân các pic trong phổ 1H-NMR cho thấy carbocistein tạo muối với lysin theo tỷ lệ 1:1.
3.3.2.4 Về phổ cộng hưởng từ carbon 13
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C cho phép nhận biết các dạng carbon và số lƣợng carbon trong chất tạo thành
Phổ 13 C-NMR cho thấy 11 tín hiệu tương ứng với 11 carbon trong phân tử phù hợp với khung carbon của carbocistein lysin
3.3.2.5 Về phổ nhiễu xạ tia X
Nhiễu xạ tia X là hiện tượng xảy ra khi các chùm tia X bị nhiễu xạ trên các mặt tinh thể của chất rắn, nhờ vào tính tuần hoàn của cấu trúc tinh thể, tạo ra các cực đại và cực tiểu nhiễu xạ Phổ nhiễu xạ tia X giúp nhận diện các đặc trưng của cấu trúc tinh thể một cách chính xác.
Phổ nhiễu xạ tia X của sản phẩm cho các đỉnh cực đại nhiễu xạ tương tự so với tài liệu [20]
3.3.2.6 Về phân tích nhiệt quét vi sai DSC
Phân tích nhiệt quét vi sai giúp xác định các tính chất chuyển pha nhiệt của mẫu bằng cách đo lượng nhiệt tỏa ra hoặc thu vào từ mẫu khi được đốt nóng với các tốc độ quét nhiệt khác nhau.
Kết quả phân tích nhiệt vi sai của sản phẩm cho các đỉnh nội nhiệt cực đại tương tự so với tài liệu [20]
3.3.2.7 Về pH dung dịch 9% tr ng nước pH dung dịch của một chất cho biết độ acid hay base của nó pH dung dịch carbocistein lysin 9% trong nước đo được là 6,35 đúng với tài liệu (pH 6,0-7,0 [20]) Muối carbocistein lysin có tính kiềm hơn so với carbocistein
Từ kết quả phân tích cấu trúc và một số đặc trƣng của sản phẩm ở trên, chúng tôi kết luận: sản phẩm thu đƣợc là carbocistein lysin
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Đã xây dựng đƣợc quy trình tạo muối carbocistein lysin ở quy mô phòng thí nghiệm với quy mô 20 g/mẻ đạt hiệu suất trung bình toàn quy trình 93,57%
2 Đã xác định đƣợc cấu trúc và đánh giá đƣợc một số đặc trƣng của sản phẩm qua phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, XRPD, DSC, pH Đề xuất:
