HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Escherichia coli TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP β-carotene Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Cường TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hà i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường TS Nguyễn Xuân Cảnh tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn công nghệ vi sinh, Khoa công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ môn Sinh học phân tử công nghệ Gene, Viện Khoa học sống - Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hà ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Khái quát sắc tố β-carotene 2.1.1 Cấu trúc tính chất lý hóa 2.1.2 Vai trò β-carotene người 2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene 2.1.4 Các nguồn cung cấp β-carotene 14 2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên 18 2.2 Vi khuẩn E coli hệ vector biểu sản xuất protein tái tổ hợp 19 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn E coli sản xuất protein tái tổ hợp 19 2.2.2 Một số hệ thống vector biểu vi khuẩn E coli 21 2.3 Vai trò gene crtB đường sinh tổng hợp β-carotene 23 2.4 Tình hình ngồi nước 24 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 24 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 25 iii Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1 Vi khuẩn 27 3.1.2 Vật liệu 27 3.1.3 Hóa chất 30 3.1.4 Dụng cụ 31 3.1.5 Thiết bị 31 3.1.6 Phạm vi nghiên cứu 32 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 34 3.4.2 Phương pháp PCR 35 3.4.3 Phương pháp điện di DNA gel agarose 36 3.4.4 Phương pháp lập đồ giới hạn 37 3.4.5 Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose 37 3.4.6 Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu 38 3.4.7 Phương pháp chuẩn bị tế bào E coli khả biến 38 3.4.8 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến sốc nhiệt 39 3.4.9 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 39 Phần Kết thảo luận 41 4.1 Tách dòng gene crtB từ vi khuẩn Pantoea ananatis 41 4.1.1 Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn Pantoea ananatis 41 4.1.2 Kết nhân gene crtB phương pháp PCR 41 4.1.3 Kết gắn nối đoạn gene crtB vào vector tách dòng 42 4.2 Thiết kế vector biểu chứa gene mã hóa cho enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp β-carotene 46 4.3 Kết cảm ứng biểu gene đích tạo β-carotene đánh giá sơ mức độ biểu màu sắc cặn tế bào 48 Phần Kết luận kiến nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Amp : Ampicillin Bp : Base pair CoA : Coenzyme Acetoacetyl Cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetra axetic acid IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base LB : Lauria Broth NCBI : Nation Cetrer for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Recation TAE : Tris-acetate-EDTA UV : Ultraviolet X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside ROS : Reactive Oxygen Species RNS : Reactive Nitrogen Species IPP : Isopentenyl pyrophosphate DMAPP : Dimethylallyl pyrophosphate MAV : Mevalonate v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng carotenoid có thực vật 14 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi crtB 27 Bảng 3.2 Các thành phần vector pRSET-A 28 Bảng 3.3 Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 32 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng gắn nối 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo β-carotene Hình 2.2 Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A Hình 2.3 Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 dự kiến đến năm 2018 Hình 2.4 Sinh tổng hợp IPP DMAPP theo đường MAV 10 Hình 2.5 Sinh tổng hợp IPP DMAPP theo đường MEP 11 Hình 2.6 Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP DMAPP 12 Hình 2.7 Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene 13 Hình 2.8 Tổng hợp β-carotene từ lycopene 13 Hình 2.9 Sơ đồ tổng hợp β-carotene BASF 16 Hình 2.10 Sơ đồ tổng hợp β-carotene Roche 17 Hình 2.11 Cơ chế kiểm sốt phiên mã T7 promoter 20 Hình 2.12 Sơ đồ hệ thống vector biểu pRSET 21 Hình 2.13 Sơ đồ hệ thống vector biểu pET 22 Hình 2.14 Tương tác protein tái tổ hợp chứa 6xHis giá thể Niken 22 Hình 2.15 Quá trình chuyển hóa β-carotene tham gia gene Crt 23 Hình 3.1 Cấu trúc vector biểu pRSET 28 Hình 3.2 Cấu trúc vector tách dịng 29 Hình 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 36 Hình 4.1 Hình ảnh tách chiết DNA tổng số P ananatis 41 Hình 4.2 Kết khuếch đại gene crtB vi khuẩn P ananatis 42 Hình 4.3 Kết biến nạp vào tế bào E coli DH5α 43 Hình 4.4 Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn 43 Hình 4.5 Kết chọn lọc dịng cắt với enzyme EcoRI KpnI 44 Hình 4.6 Kết giải trình tự (A) dịch mã insilico gene crtB (B) 45 Hình 4.7 Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pR-iEIBY 46 Hình 4.8 Sản phẩm cắt vector pRSET-iEIBY với EcoRI NcoI 47 Hình 4.9 Kết biểu gene idi, crtE, crtI, crtB crtY nằm vector pRSET-A E coli BL21(DE3) 49 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà Tên luận văn: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp β-carotene Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam β-carotene thuộc nhóm carotenoid, có sắc tố vàng da cam, tổng hợp tự nhiên số loài thực vật cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry et al., 1998) β-carotene gọi provitamin A, tiền chất để tổng hợp vitamin A – loại vitamin cần thiết cho mắt (Lampert et al., 2003; Stutz et al., 2015) Cũng giống carotenoid khác, β-carotene chất chống oxy hoá sinh học, bảo vệ tế bào mô khỏi tác hại gốc tự do, có tác dụng ngăn ngừa bệnh ung thư (Britton 1995) Một tác dụng khác β-carotene giảm thiểu bệnh tim mạch – nguyên nhân gây tử vong hàng đầu người Mặc dù có vai trị quan trọng bảo vệ sức khoẻ, song thân thể người lại không tự tổng hợp β-carotene mà phải đưa vào nhờ thực phẩm Và nhờ tác dụng hữu ích β-carotene nên nhu cầu sử dụng chất lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm ngày cao (Mata-Gómez et al., 2014) Thị trường β-carotene năm 2010 261 triệu USD dự tính đến 2018 đạt 334 triệu USD (BCC 2011) Tổng hợp β-carotene thường theo hai phương pháp tách chiết từ nguồn tự nhiên tổng hợp hoá học (Ribeiro et al., 2011; Vachali et al., 2012) Những phương pháp có nhược điểm định Tổng hợp hoá học tạo chất thải nhiễm, sản phẩm có hoạt tính sinh học thấp β-carotene tự nhiên khơng có đồng phân α-carotene γ-carotene (Voutilainen et al., 2006; Baky and El-Baroty, 2013) Trong β-carotene tách chiết từ nguồn tự nhiên cho hàm lượng không nhiều phụ thuộc vào nguồn cung vật liệu có chứa β-carotene Nhằm góp phần khắc phục yếu điểm phương pháp nói trên, hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật di truyền tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả sản xuất β-carotene hướng quan tâm E coli tự nhiên khơng tổng hợp provitamin β-carotene khơng có enzyme chuyển hóa từ DMAPP đến chất Gene idi có hệ gene E coli cần đưa vào vector biểu để tăng cường mức độ biểu hiện, từ giúp cân nguồn chất IPP DMAPP Đã có số nghiên cứu sinh tổng hợp carotenoid nói chung β-carotene nói riêng sử dụng E coli làm vật chủ cho thấy tiềm phát triển quy mô công nghiệp, nhiên để đưa viii vào thực tiễn sản xuất cần tối ưu (Kirby and Keasling 2009) Mục tiêu nghiên cứu thiết kế vector biểu pRSET-iEIBY mang gene idi, crtI, crtB, crtE crtY mã hoá cho enzyme xúc tác trình tổng hợp β-carotene vi khuẩn E coli Vector pRSET-iEI tạo trước việc gắn gene idi, crtI crtE vào vector biểu pRSET-A Gene crtB tách dòng xác định trình tự trước gắn vào vector pRSET-iEI để tạo thành pRSET-iEIB Gene crtY cắt từ vector pLUG-Y gắn vào pRSET-iEIB để tạo vector biểu pRSET-iEIBY Phương pháp thí nghiệm Vi khuẩn P ananatis ni tăng sinh khối tách DNA tổng số, làm nguyên liệu để khuếch đại đoạn gene crtB cặp mồi đặc hiệu Đoạn gene crtB sau khuếch đại thành cơng, gắn nối vào vector tách dịng pLUG chọn lọc dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn Sau sàng lọc dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn, plasmid lại dùng làm nguyên liệu để thiết kế vector biểu mang gene mã hóa sinh tổng hợp β-carotene Plasmid pLUG-B (là plasmid mang đoạn gen crtB) pRiEIY (là vector biểu pRSET gắn thành công gene idi, crtE, crtI crtY gắn thành cơng trước đó) Hai vector cắt đồng thời hai enzyme EcoRI KpnI với mục đích thu đoạn gene crtB cắt mở vịng vector biểu Sau đó, sản phẩm đoạn gene crtB cắt vector nối lại với enzyme gắn nối lygase Sản phẩm gắn nối lại sàng lọc chọn lọc dòng tái tổ hợp Sau chọn lọc vector biểu mang gene mã hóa sinh tổng hợp β-carotene, biến nạp vào vi khuẩn E coli BL21 để cảm ứng biểu sinh tổng hợp β-carotene Sau q trình thực đề tài chúng tơi thu số kết sau: Kết thứ 1: Kết tách dòng gene crtB từ vi khuẩn P.ananatis + Vi khuẩn P ananatis nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng tách DNA tổng số Kết cho thấy tách chiết thành công DNA tổng số vi khuẩn P.ananatis, DNA tổng số có chất lượng tương đối tốt, bị đứt gãy + Tiếp theo tiến hành khuếch đại đoạn gene crtB Kết cho thấy sản phẩm PCR thu có băng kích thước xấp xỉ kb tương đương với kích thước đoạn gene crtB lý thuyết 930 bp Kết thứ 2: Thiết kế vector biểu mang gene mã hóa cho enzyme tham gia trình sinh tổng β-carotene Để thiết kế vector biểu mang gene mã hóa cho q trình sinh tổng hợp ix Hình 4.2 Kết khuếch đại gene crtB vi khuẩn P ananatis Đường chạy 1, 2: Tương ứng với sản phẩm khuếch đại gene crtB Đường chạy L: GeneRulerTM kb Thermo Sientific Kết điện di sản phẩm PCR gene crtB hình cho thấy có xuất băng sáng đường chạy số 2, so sánh kích thước với thang chuẩn kb hãng Thermo Sientific cho thấy sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 1000 bp, tương đương với kích thước gene crtB (930 bp), đồng thời sản phẩm khuếch đại đường chạy xuất băng Như vậy, kết luận khuếch đại thành công gene crtB vi khuẩn P ananatis 4.1.3 Kết gắn nối đoạn gene crtB vào vector tách dòng Các sản phẩm PCR enzyme Taq DNA polymerase tổng hợp có đặc điểm có treo thêm đầu dính Adenine đầu 3’ mạch Lợi dụng đặc điểm vector thương mại thiết có thêm đầu treo Thymine đầu 5’ Đoạn gene crtB vector tách dòng pLUG gắn nối với enzyme ligase sau biến nạp vào vi khuẩn DH5α phương pháp sốc nhiệt Sau biến nạp vi khuẩn cấy mơi trường thạch agar có chứa kháng sinh chọn lọc ampicillin, đồng thời có chất thị X-gal IPTG Đĩa thạch nuôi 30oC 15 giờ, kết biến nạp thể hình 4.3 42  Kết biến nạp sản phẩm gắn nối gene crtB vector tách dịng Hình 4.3 Kết biến nạp vào tế bào E coli DH5α Kết biến nạp hình cho thấy, có nhiều khuẩn lạc phát triển bề mặt thạch, có xuất hai loại khuẩn lạc khác khuẩn lạc màu trắng, khuẩn lạc màu xanh Theo lý thuyết, khuẩn lạc xanh khuẩn lạc dịng tế bào mang vector tự đóng vòng, khuẩn lạc trắng dòng tế bào mang vector tái tổ hợp Trong phạm vi đề tài chúng tơi chọn lọc ngẫu nhiên 14 dịng khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh (đối chứng) để sàng lọc dòng tái tổ hợp Kết sàng lọc dịng tái tổ hợp điện di so sánh kích thước Các khuẩn lạc chọn nuôi tăng sinh mơi trường LB lỏng có kháng sinh ampicilin Ly tâm thu cặn tách chiết DNA plasmid Plasmid từ 16 chủng lựa chọn điện di để kiểm tra, kết thể hình 4.4 Hình 4.4 Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn 43 Đường chạy 1-14: tương ứng với DNA plasmid 14 dòng nghi ngờ Đường chạy X: tương ứng với DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh Theo lý thuyết, điều kiện điện di phân tử DNA có kích thước lớn di chuyển chậm so với phân tử có kích thước nhỏ, Vector tái tổ hợp gắn sản phẩm PCR nên kích thước lớn vector gốc khơng mang đoạn xen, điện di để sàng lọc dòng tái tổ hợp Từ kết cho thấy 14 dịng nghi ngờ có dịng 3, 4, 8, 11 có kích thước cao so với đường chạy dòng khuẩn lạc xanh Như dịng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gene crtB Kết chọn lọc dòng pLUG-B phương pháp lập đồ giới hạn Tuy nhiên để khẳng định chắn tiến hành sàng lọc tiếp dòng: 3, 4, 8, 11 phương pháp lập đồ giới hạn Ở hai đầu đoạn gene crtB chúng tơi thiết kế có vị trí nhận biết hai enzyme cắt giới hạn EcoR I KpnI Chính chúng tơi tiến hành cắt dòng nghi ngờ đồng thời với hai loại enzyme Kết thể sau: L 3kb 1kb Hình 4.5 Kết chọn lọc dòng cắt với enzyme EcoRI KpnI Đường chạy 1-4: Tương ứng sản phẩm cắt dòng 3, 4, 8, 11 Đường chạy L: GeneRulerTM kb Thermo Sientific Kết cho thấy dòng sàng lọc có dịng xuất băng kích thước dự kiến: băng kích thước 3000 bp tương đương kích thước 44 vector pLUG băng kích thước 930 bp tương đương đoạn gene crtB Như dòng sàng lọc vector tái tổ hợp mang đoạn gene crtB  Kết giải trình tự gene crtB vector tách dịng Để kiểm tra trình tự nucleotid đoạn gene crtB có đột biến vơ nghĩa khơng chúng tơi tiến hành giải trình tự dịng crtB vừa chọn lọc Hình 4.6 Kết giải trình tự (A) dịch mã insilico gene crtB (B) Kết cho thấy Gene crtB tách dòng từ vi khuẩn P ananatis có kích thước 930 nucleotide, đầu 5’ có ba mã mở đầu ATG trình tự mồi crtB-F (in đậm), đầu 3’ có ba mã kết thúc TAG trình tự mồi crtB-R (in đậm) Các vị trí KpnI EcoRI thiết kế ban đầu cho mục đích gắn gene sau tách dịng vào vector biểu pR-iEIY bảo tồn Trình tự crtB dịch mã in silico công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene dịch mã thành công khơng xuất stop codon vơ nghĩa, sử dụng để biểu enzyme phytoene desaturase Như chúng tơi tách dịng thành cơng đoạn gene crtB vector tách dòng pLUG-B biến nạp vi khuẩn E coli DH5α 45 4.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CHỨA GENE MÃ HÓA CHO CÁC ENZYME THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP β-carotene Kết gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pRiEIBY Để thiết kế vector biểu mang gene mã hóa cho q trình sinh tổng hợp β-carotene chúng tơi sử dụng vector tách dịng pLUG-B (đã chúng tơi tách dịng) vector biểu pR-iEIY vector biểu pRSET-A gắn thành công gene: idi, crtE, crtI, crtY trước Sau biến nạp sản phẩm gắn nối gene crtB vector pR-iEIY mở vịng ni cấy chúng tơi thu số khuẩn lạc mọc môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc, tách DNA plasmid từ dịng chúng tơi thu kết hình 4.7A A B Hình 4.7 Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pR-Ieiby (A) Vector pRSET-iEIBY gắn xuôi chiều theo lý thuyết (B) Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pR-iEIY Đường chạy 1-5: Các dòng plasmid nghi ngờ mang gen crtB 46 Kết tách chiết DNA plasmid hình 6A cho thấy tất dịng chọn lọc có băng sáng cao so với băng plasmid đối chứng pR-iEIY Như vậy, dịng nghi ngờ mang đoạn gene crtB Tuy nhiên để chắn khẳng định tiếp tục sử dụng dòng 1, 2, 3, 4, để cắt kiểm tra khả gắn gene crtB kết hình 4.8 cho bước chọn lọc  Kết chọn lọc dòng mang gene crtB đồ giới hạn Cơ sơ: Trên đoạn gen crtB có vị trí nhận biết enzyme NcoI nằm cách vị trí nhận biết enzyme EcoRI 581 bp Kết cắt thể hình 4.8 Hình 4.8 Sản phẩm cắt vector pRSET-iEIBY với EcoRI NcoI Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pR-iEYBI Đường chạy 1-5: Sản phẩm cắt tương ứng với dòng 1, 2, 3, 4, Đường chạy M: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM kb Thermo Sientific Từ kết cho thấy dòng nghi ngờ xuất băng: băng có kích thước 581 bp (tương đương kích thước hai vị trí enzyme EcoRI NcoI), băng có kích thước xấp xỉ 7279 bp (tương đương kích thước vector pRiEIY phần đoạn gene crtB) Điều cho thấy gắn gene crtB vào vector pRSET-iEIY gene gắn chiều 47 hình 4.7B gắn theo chiều ngược lại kích thước vị trí cắt 402 bp Như kết luận chúng tơi gắn thành công gene crtB lên vector pRiEIY gene gắn xuôi chiều phiên mã điều khiển promoter T7 tạo vector biểu pR-iEIBY tảng vector pRSET-A Sơ đồ vector pRSET-iEIBY thể hình 4.7B Các gene idi, crtE, crtI, crtB crtY có chứa vị trí bám ribosom, ba mở đầu ba kết thúc Các gene xếp dạng thiết kế polycistronic operon để đảm bảo biểu đồng thời điều khiển promoter T7 4.3 KẾT QUẢ CẢM ỨNG BIỂU HIỆN GENE ĐÍCH TẠO RA β-carotene VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN BẰNG MÀU SẮC CẶN TẾ BÀO Với liệu thu từ: Sàng lọc kích thước vector, chọn lọc dòng tái tổ hợp phương pháp lập đồ giới hạn, chúng tơi tạm thời kết luận gắn thành công gene mã hóa cho enzyme xúc tác q trình chuyển hóa β-carotene lên vector biểu pRSET-A Tuy nhiên với mục đích thu β-carotene, yêu cầu gene nằm vector biểu phải hoạt động, tạo enzyme enzyme phải xúc tác trình sinh tổng hợp β-carotene Chính để kiểm tra hoạt động gene tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pR-iEIBY vào chủng biểu E coli BL21 (DE3) nuôi môi trường LB lỏng vịng -12 giờ, OD đạt 0,4 chúng tơi tiến hành cảm ứng IPTG 0,1mM tiếp tục nuôi 12 Kết đánh giá biểu gene chúng tơi thể hình: 48 Hình 4.9 Kết biểu gene idi, crtE, crtI, crtB crtY nằm vector pRSET-A E coli BL21(DE3) Chú thích: Cặn khuẩn dịng tế bào: (1): E coli BL21 (DE3) mang vector pRSET-A (đối chứng); (2): E coli DH5α mang vector pR-iEIBY (màu vàng); (3): E coli BL21 (DE3) mang vector pR-iEIBY (màu da cam – màu đặc trưng β-carotene); Kết cảm ứng biểu cho thấy, Ống khơng có biểu màu sắc chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang plasmid gốc pRSET-A khơng có chứa gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp βcarotene Ống số cho cặn tế bào có màu tương ứng vàng, da cam (màu đặc trưng β-carotene) Mức độ biểu chủng E coli BL21(DE3) vượt trội so với chủng DH5α (dựa vào độ đậm màu sắc) Tuy nhiên, theo lý thuyết, biểu gene nằm vị trí đa tách dịng vector pRSET-A chịu kiểm sốt hệ thống T7 promoter, địi hỏi cần phải có xúc tác enzyme T7 DNA polymerase DH5α khơng có gene mã hóa cho enzyme T7 DNA polymerase để tương thích với T7 promoter, song kết thu biểu mầu sắc mức độ thấp Đây kết tượng rị rỉ biểu gene Có số lý dẫn đến tượng này, nhiên trường hợp cụ thể giả thuyết đặt vector pRSETA, ngồi trình tự T7 cịn trình tự promoter bla promoter điều khiển hoạt động gene kháng kháng sinh Tuy nhiên tín hiệu kết thúc gene kháng kháng sinh không đủ mạnh nên kết promoter phiên mã đoạn gene kháng amp trình tự gene nằm vùng MCS, sau đoạn mRNA dịch mã tạo thành protein 49 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Tách dịng thành cơng gene crtB từ vi khuẩn P ananatis LMG 20103 có kích thước 930 nucleotide - Đã tạo thành công vector biểu pR-iEIBY chứa gene mã hóa cho enzyme xúc tác đường sinh tổng hợp β-carotene vi khuẩn E coli tảng vector biểu pRSET-A - Biểu thành công vector pR-iEIBY vi khuẩn E coli BL21(DE3) tạo màu vàng da cam (màu đặc trưng β-carotene) 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu chuyển gene idi, crtI, crtE, crtB, crtY lên hệ vector biểu khác pET28, pQE30, pGEX - Biến nạp hệ vector tái tổ hợp vào chủng E coli khác để tìm giải pháp tối ưu cho việc biểu β-carotene vi khuẩn E coli - Tiến hành phân tích cặn khuẩn thu từ hệ biểu chủng biểu khác phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) để đánh giá khả sinh tổng hợp β-carotene 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ha Thi Bich Ngoc, T T H N Nguyễn Văn Mùi (2007).Điều tra hợp chất carotenoid số thực vật Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ (23) tr 130-134 Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Xn Vũ, Ngơ Xn Bình Dương Văn Cường (2012) Tạo chủng E coli có khả sản xuất lycopene Tạp chí Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn –kỳ -tháng 3/2012 tr 10-14 Nguyễn Thị Lý T T H V (2010) Tách tinh dầu carotenoid từ trầu (Piper betle L.) Hội Nghị Khoa Học & Công Nghệ lần Phân ban Cơng nghệ Hóa học, Trường Đại học Bách khoa - Tp.HCM Tiếng Anh Adetayo O Omoni and R E Aluko (2005) The anti-carcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene: a review Trends in Food Science & Technology 16(8) pp 344-350 ANS, E P o F A a N S a t F (2012) "Scientific Opinion on the re-evaluation of mixed carotenes (E 160a (i)) and Aoki, H., N T Kieu, N Kuze, K Tomisaka and N Van Chuyen (2002) "Carotenoid pigments in GAC fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG)." Biosci Biotechnol Biochem Vol 66(11) pp 2479-2482 Armstrong, G A and J E Hearst (1996) "Carotenoids 2: Genetics and molecular biology of carotenoid pigment biosynthesis." Faseb j Vol 10(2) pp 228-237 Baky, H H A E and G S El-Baroty (2013) Healthy Benefit of Microalgal Bioactive Substances Journal of Aquatic Science Vol 1(1) pp 11-23 Baneyx, F (1999) "Recombinant protein expression in Escherichia coli." Curr Opin Biotechnol Vol 10(5) pp 411-421 10 BCC (2011) The Global Market for Carotenoids 11 Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto and M A Z Coelho (2011) Technological Aspects of β-carotene Production Food and Bioprocess Technology 4(5) pp 693-701 12 Biesalski, H K., G R Chichili, J Frank, J von Lintig and D Nohr (2007) "Conversion of beta-carotene to retinal pigment." Vitam Horm 75 pp 117-130 13 Britton, G (1995) Structure and properties of carotenoids in relation to function Faseb j Vol 9(15) pp 1551-1558 51 14 Cooper GM (1992) Elements of human cancer Boston: Jones and Bartlett Publishers p 16: ISBN 978-970-86720-86191-86728 15 Del Campo, J A., J Moreno, H Rodriguez, M A Vargas, J Rivas and M G Guerrero (2000) Carotenoid content of chlorophycean microalgae: factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp (Chlorophyta) J Biotechnol 76(1) pp 51-59 16 Desobry, S A., F M Netto and T P Labuza (1998) Preservation of beta-carotene from carrots Crit Rev Food Sci Nutr Vol 38(5) pp 381-396 17 Dhalla, N S., R M Temsah and T Netticadan (2000) Role of oxidative stress in cardiovascular diseases J Hypertens Vol 18(6) pp 655-673 18 Ernst, H (2002) Recent advances in industrial carotenoid synthesis ChemInform 74(11) pp 2213–2226 19 Fujisawa, M., M Watanabe, S K Choi, M Teramoto, K Ohyama and N Misawa (2008) Enrichment of carotenoids in flaxseed (Linum usitatissimum) by metabolic engineering with introduction of bacterial phytoene synthase gene crtB J Biosci Bioeng Vol 105(6) pp 636-641 20 GBD (2015) Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 Lancet Vol 385(9963) pp 117-171 21 Goodwin, T W (1980) The Biochemistry of the Carotenoids Plants 22 Gordon, J E and M Schooff (2002) Can high-dose supplementation with vitamins C and E, beta carotene, and zinc slow the progression of macular degeneration? J Fam Pract Vol 51(2) pp 105 23 Guerin, M., M E Huntley and M Olaizola (2003) Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition Trends Biotechnol 21(5) pp 210-216 24 Harjes, C E., T R Rocheford, L Bai, T P Brutnell, C B Kandianis, S G Sowinski, A E Stapleton, R Vallabhaneni, M Williams, E T Wurtzel, J Yan and E S Buckler (2008) Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification Science Vol 319(5861) pp 330-333 25 Heller, F R., O Descamps and J C Hondekijn (1998) LDL oxidation: therapeutic perspectives Atherosclerosis 137 Suppl: S25-31 26 Hyung Seok Choi, Sang Yup Lee, Tae Yong Kim and H M Woo (2010) In Silico Identification of Gene Amplification Targets for Improvement of Lycopene Production Appl Environ Microbiol Vol 76(10) pp 3097–3105 27 Igielska-Kalwat, J., J Goscianska and I Nowak (2015) Carotenoids as natural antioxidants Postepy Hig Med Dosw (Online) Vol 69(0) pp 418-428 52 28 Ikeda, M and R Katsumata (1992) "Metabolic Engineering To Produce Tyrosine or Phenylalanine in a Tryptophan-Producing Corynebacterium glutamicum Strain." Appl Environ Microbiol Vol 58(3) pp 781-785 29 Invitrogene (2010) "pRSETa,b and c For high-level expression of recombinant proteins in E coli." invitrogene in TM by life technologies 315-20: 25-0213 30 Kirby, J and J D Keasling (2009) "Biosynthesis of plant isoprenoids: perspectives for microbial engineering." Annu Rev Plant Biol 60 pp 335-355 31 K L Perry, T A Simonitch, K J Harrison-Lavoie and S T Liu (1986) "Cloning and regulation of Erwinia herbicola pigment genes." J Bacteriol 168(2) pp 607–612 32 Lampert, J M., J Holzschuh, S Hessel, W Driever, K Vogt and J von Lintig (2003) Provitamin A conversion to retinal via the beta,beta-carotene-15,15'oxygenase (bcox) is essential for pattern formation and differentiation during zebrafish embryogenesis Development Vol 130(10) pp 2173-2186 33 Lee, P C., A Z Momen, B N Mijts and C Schmidt-Dannert (2003) Biosynthesis of structurally novel carotenoids in Escherichia coli Chem Biol Vol 10(5) pp 453-462 34 Lee, P C and C Schmidt-Dannert (2002) "Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms." Appl Microbiol Biotechnol Vol 60(1-2) pp 1-11 35 Lien Ai Pham-Huy, Hua He and C Pham-Huy (2008) Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health Int J Biomed Sci Vol 4(2) pp 89-96 36 Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez, Alejandro Méndez-Zavala and C N Aguilar (2014) "Biotechnological production of carotenoids by yeasts: 37 Lynen, F (1967) Biosynthetic pathways from acetate to natural products Pure Appl Chem 14(1) pp 137-167 38 Maiani, G., M J Caston, G Catasta, E Toti, I G Cambrodon, A Bysted, F Granado-Lorencio, B Olmedilla-Alonso, P Knuthsen, M Valoti, V Bohm, E Mayer-Miebach, D Behsnilian and U Schlemmer (2009) Carotenoids: actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans Mol Nutr Food Res 53 Suppl 2: S194-218 39 Mbuyi, J M., J Dequeker, F Bloemmen and E Stevens (1982) "Plasma proteins in human cortical bone: enrichment of alpha HS-glycoprotein, alpha acidglycoprotein, and IgE." Calcif Tissue Int Vol 34(3) pp 229-231 40 Mendis, Shanthi;, Puska, Pekka;, Norrving and Bo (2014) Global atlas on cardiovascular disease prevention and control Geneva: World Health Organization in collaboration with the World Heart Federation and the World Stroke Organization pp 3-18 53 41 Misawa, N., S Yamano and H Ikenaga (1991) Production of beta-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora Appl Environ Microbiol Vol 57(6) pp 1847-1849 42 Miura, Y., K Kondo, T Saito, H Shimada, P D Fraser and N Misawa (1998) "Production of the carotenoids lycopene, beta-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis." Appl Environ Microbiol Vol 64(4) pp 1226-1229 43 Moran, A E., M H Forouzanfar, G A Roth, G A Mensah, M Ezzati, C J Murray and M Naghavi (2014) Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 study Circulation Vol 129(14) pp 1483-1492 44 Nagao, A (2009) Absorption and function of dietary carotenoids Forum Nutr 61 pp 55-63 45 Novagen (2006) "pET System Manual." TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144 46 Olson, J A (1999) "Carotenoids and human health." Arch latinoam Nutr 49(3 Suppl 1): 7s-11s 47 Parker, R S., J E Swanson, C S You, A J Edwards and T Huang (1999) "Bioavailability of carotenoids in human subjects." Proc Nutr Soc 58(1) pp 155-162 48 Rao, A V and L G Rao (2007) "Carotenoids and human health." Pharmacol Res 55(3) pp 207-216 49 Reaven, P D., E Ferguson, M Navab and F L Powell (1994) Susceptibility of human LDL to oxidative modification Effects of variations in beta-carotene concentration and oxygen tension Arterioscler Thromb 14(7) pp 1162-1169 50 Ribaya-Mercado, J D., C C Maramag, L W Tengco, G G Dolnikowski, J B Blumberg and F S Solon (2007) "Carotene-rich plant foods ingested with minimal dietary fat enhance the total-body vitamin A pool size in Filipino schoolchildren as assessed by stable-isotope-dilution methodology." Am J Clin Nutr 85(4) pp 1041-1049 51 Robert Mierendorf, Keith Yeager and R Novy (1994) "pET system: Your choice for expression." News letter of Novagen Inc 1(1) 52 Roncone, D P (2006) Xerophthalmia secondary to alcohol-induced malnutrition Optometry 77(3) pp 124-133 53 Schmidt-Dannert, C (2000) "Engineering novel carotenoids in microorganisms." Curr Opin Biotechnol 11(3) pp 255-261 54 54 Sies, H and W Stahl (1998) Lycopene: antioxidant and biological effects and its bioavailability in the human Proc Soc Exp Biol Med 218(2): 121-124 55 Singh, N., A K Dhalla, C Seneviratne and P K Singal (1995) Oxidative stress and heart failure Molecular and Cellular Biochemistry 147(1) pp 77-81 56 Sklan, D (1987) Vitamin A in human nutrition Prog Food Nutr Sci 11(1) pp 39-55 57 Smith, T A (1998) Carotenoids and cancer: prevention and potential therapy Br J Biomed Sci 55(4) pp 268-275 58 Snodderly, D M (1995) Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins Am J Clin Nutr 62(6 Suppl): 1448s-1461s 59 Stephanopoulos, G (1994) "metabolic engineering." Curr Opin Biotechnol 5(2) pp 196-200 60 Stutz, H., N Bresgen and P M Eckl (2015) Analytical tools for the analysis of beta-carotene and its degradation products Free Radic Res pp 1-31 61 Sugantha priya S, Gowri Shankar J, Thirumalaisamy R and K P (2010) "Over Expression of IPTG inducible GST protein in E.coli BL21." Journal of Biomedical Sciences and Research 2(1) pp 54-59 62 Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti, Dangly Jacob, Mustafa Al-Shamali, Anwar Ahmed and N Ahmed (2010) Induction and extraction of β-carotene from the locally isolated 63 The QIAexpressionistTM (2003) "A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins." Fifth edition, QIAGEN, Germany 64 Vachali, P., P Bhosale and P S Bernstein (2012) Microbial carotenoids 65 Vershinin, A (1999) "Biological functions of carotenoids diversity and evolution." Biofactors 10(2-3) pp 99-104 66 Voutilainen, S., T Nurmi, J Mursu and T H Rissanen (2006) Carotenoids and cardiovascular health Am J Clin Nutr 83(6) pp 1265-1271 67 Wolf, G (2001) The discovery of the visual function of vitamin A J Nutr 131(6) pp 1647-1650 68 Yamano, S., T Ishii, M Nakagawa, H Ikenaga and N Misawa (1994) Metabolic engineering for production of beta-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae Biosci Biotechnol Biochem 58(6) pp 1112-1114 69 Yoon, S.-H., Hye-Min Park, Ju-Eun Kim, Sook-Hee Lee, Myung-Suk Choi, JaeYean Kim, Deok-Kun Oh, Jay D Keasling and S.-W Kim (2007) Increased βcarotene Production in Recombinant Escherichia coli Harboring an Engineered 55 Isoprenoid Precursor Pathway with Mevalonate Addition Biotechnol 23(3) pp 599-605 70 Yoon, S H., S H Lee, A Das, H K Ryu, H J Jang, J Y Kim, D K Oh, J D Keasling and S W Kim (2009) Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of beta-carotene in E coli J Biotechnol 140(3-4) pp 218-226 71 Young, I S and J V Woodside (2001) Antioxidants in health and disease J Clin Pathol 54(3) pp 176-186 56 ... nêu Các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả sản sinh enzyme tham gia vào trình tổng hợp β- carotene gặt hái thành công định Năm 1990, Misawa cộng tạo chủng sinh vật có khả sinh tổng hợp carotene, ... phẩm β- carotene tổng hợp hóa học có chứa đồng phân nhất, β- carotene tự nhiên khơng có chứa β- carotene mà cịn có α -carotene γ -carotene; β- carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao 10% so với tổng. .. E coli BL21(DE3) 49 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà Tên luận văn: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp β- carotene Ngành: Công nghệ Sinh